補腎中藥促進成骨前體細胞MC3T3-E1成骨與分化研究進展

朱庭辰，華 臻，殷 杰，王建偉

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 214071)

1964年PECK等首次從胎鼠骨組織中成功分離出新生大鼠成骨細胞,開創(chuàng)了前成骨細胞用于骨代謝研究的新紀元[1]。近年來，隨著骨組織工程的興起及各類促成骨成分被廣泛研究，骨缺損的研究進入新的階段。MC3T3-E1細胞是一種成骨細胞前體，可在成骨相關信號的誘導刺激下進一步分化為成熟的成骨細胞[2]。其具有成骨細胞特性，增殖能力強，細胞生物性穩(wěn)定，是一種良好的成骨細胞分化研究模型[3]。因此，如何提高MC3T3-E1細胞增殖及成骨與分化的效能，已成為國內(nèi)外骨科領域研究的重點。目前常用的骨修復材料與骨形態(tài)發(fā)生蛋白等骨修復因子價格昂貴，制備工藝復雜，活性不穩(wěn)定,具有潛在致癌風險[4-5]。近年來隨著中藥分離提純技術的快速發(fā)展，在中醫(yī)“腎主骨”理論指導下，以補腎中藥制劑干預前成骨細胞MC3T3-E1以促進骨組織再生修復的研究逐漸豐富并初見成效[6-9]。中醫(yī)學認為，腎主骨生髓，補腎可以強筋壯骨。現(xiàn)代藥理研究[10]表明，補益肝腎可使骨密度增加，骨抗彎曲和抗壓縮能力增強，促進骨小梁顯微結(jié)構(gòu)改善和修復。補腎中藥可以促進成骨與抑制破骨、改善骨髓間充質(zhì)干細胞骨生物性能。目前研究較集中的中藥有淫羊藿、補骨脂、骨碎補、女貞子等；中藥組方有左歸丸、補腎活血固齒方等。這為研究骨缺損的修復重建提供了新思路。目前，關于此類研究的綜述較少，筆者試從補腎中藥促進成骨前體細胞MC3T3-E1增殖、分化及成骨的理論基礎、觀察研究及機制方面進行綜述。

1 中醫(yī)“腎主骨”理論與成骨前體細胞MC3T3-E1的關系

腎主骨，腎生髓，髓藏于骨腔之中，以充養(yǎng)骨骼，正所謂“腎充則髓實”。而髓的生成，為“腎主骨”提供了物質(zhì)基礎?，F(xiàn)代研究[11]表明，在人體內(nèi)，細胞成骨化的過程中，隨著人從幼年長至成熟，人的骨髓間充質(zhì)細胞快速增加，到達高峰后處于相對穩(wěn)定，部分細胞停止增殖分化，人到老年時，骨髓間充質(zhì)細胞逐漸減少。腎之精氣對骨的影響在人生長過程中的變化規(guī)律與成骨細胞在人體內(nèi)成骨化的過程極為相似[12]，均隨著年齡增長而發(fā)生相應改變。由此可見，腎中精氣與骨組織生長、凋亡有著密不可分的聯(lián)系，這也為研究補腎中藥促進前成骨細胞MC3T3-E1成骨與分化提供了理論基礎。

2 補腎中藥對MC3T3-E1細胞增殖與成骨的影響

2.1 補腎中藥對成骨前體細胞MC3T3-E1增殖、抗凋亡影響的研究 成骨細胞根據(jù)不同分化階段可以分為間充質(zhì)干細胞、成骨前體細胞、成熟的成骨細胞、骨細胞。研究認為，成骨前體細胞MC3T3-E1生物性能十分活躍，其增殖與分化對骨缺損的修復重建極其重要[13]。因此，如何促進成骨前體細胞增殖和分化是骨缺損修復重建的核心環(huán)節(jié)。

在促進MC3T3-E1細胞增殖分化的補腎中藥制劑中，有關淫羊藿的研究相對豐富,淫羊藿具有強筋骨、補腎陽、祛風濕等功效,常用來治療骨質(zhì)疏松、圍絕經(jīng)期綜合征等疾病[14]。徐忠坤等[15]研究表明，淫羊藿總黃酮膠囊中各成分均能促進MC3T3-E1細胞分化增殖,其中保活苷Ⅱ的活性最高。Gong等[16]在研究人工骨膜促進骨再生的研究中發(fā)現(xiàn)，中藥單體淫羊藿苷可以使MC3T3-E1細胞中堿性磷酸酶活性明顯增強，骨鈣素和Ⅰ型膠原表達增加，此外，在載鈣纖維基質(zhì)上培養(yǎng)的MC3T3-E1細胞中還觀察到清晰的鈣沉積含量，這也為MC3T3-E1細胞可以生成骨組織提供了有力的證據(jù)。Ho等[17]對比研究了金雀花堿和淫羊藿苷誘導骨形成和減少的關系，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷比金雀花堿具有更強的抗凋亡作用，可抑制由PI3K抑制劑PI828誘導的MC3T3-E1細胞中Caspase-3下游的分裂。Lai等[18]運用3D打印技術制備聚乳酸-聚乙醇酸/β-磷酸鈣/淫羊藿苷支架，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能促進MC3T3-E1細胞的分化。Qiu等[19]從女貞子干果中分離出3種新的甾體類化合物，即努烯內(nèi)酯、異茉莉花苷B、6′-O-反式肉桂酰-色考龍苷，并對所有化合物進行成骨細胞前MC3T3-E1細胞成骨活性測試。結(jié)果表明，努烯內(nèi)酯和6′-O-反式肉桂酰-色考龍苷對成骨細胞前的細胞增殖有明顯促進作用。研究表明，女貞子水提液可以促進MC3T3-E1細胞的增殖和分化，可能是通過雌激素受體(estrogen receptor，ER)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear-factor kappa B，NF-κB)信號通路來表達的，女貞子水提液對成骨細胞的影響體現(xiàn)了女貞子“功緩”的特點[20-21]。Song等[22]對骨碎補提取物治療婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥進行研究，發(fā)現(xiàn)骨碎補總黃酮可以抑制前成骨細胞MC3T3-E1凋亡并促進增殖，體外實驗表明，骨碎補總黃酮調(diào)節(jié)MC3T3-E1活性的作用是由雌激素受體依賴性途徑介導的。研究表明，骨碎補總黃酮通過上調(diào)骨保護素(osteoprotegerin，opg)以及下調(diào)NF-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear-factor kappa B ligand，RANKL)表達的受體激活物抑制破骨細胞生成。Xia等[23]從骨碎補中分離出山奈酚，以2×104/mL的細胞濃度與負鼠腎細胞、成骨細胞MC3T3-E1和人成纖維細胞共孵育數(shù)個濃度，以70 nmol/L的山奈酚為條件培養(yǎng)基，用于刺激MC3T3-E1的增殖。結(jié)果表明，山奈酚能促進OK細胞生長，提高OK細胞中骨形態(tài)蛋白受體Ⅱ的水平，但單獨使用并不能促進MC3T3-E1細胞增殖。這有力地佐證了中醫(yī)學理論中腎臟對骨形成有重大影響的觀點，骨碎補還可以促進腎臟修復和間接刺激骨形成。除了中藥單體的研究，還有補腎方劑對成骨前體細胞MC3T3-E1影響的研究。桑紅靈等[24]發(fā)現(xiàn)，血清饑餓會誘導MC3T3-E1細胞凋亡，減少Caspase3蛋白表達，左歸丸含藥血清能抑制MC3T3-E1細胞凋亡并促進其增生。研究表明，左歸丸含藥血清雖然可以促進MC3T3-E1細胞分化增殖，尤其在分化中后期更為顯著，但沉默Cx43基因?qū)ζ溆幸种谱饔肹25]。

2.2 補腎中藥促進MC3T3-E1細胞成骨化的研究 在骨骼的動態(tài)變化中,破骨細胞將骨質(zhì)吸收,成骨細胞在此基礎上生成新的骨組織。如何促進成骨細胞骨化、鈣化早已是研究促進骨缺損修復重建的核心問題[26]。

Ge等[27]在研究中發(fā)現(xiàn)，異補骨脂素(isopsoralen，ISO)是補腎中藥補骨脂的主要有效成分之一，具有多種生物學作用，包括抗骨質(zhì)疏松作用。ISO可以促進MC3T3-E1細胞成骨化，增加鈣結(jié)節(jié)水平和堿性磷酸酶活性，上調(diào)成骨細胞標記物，包括堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)、Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)和Ⅰ型膠原α1鏈(type Ⅰ collagen α1，Col1α1)。此外，ISO通過直接結(jié)合芳香烴受體(arylhydrocarbon receptor，AHR)來限制AHR的核質(zhì)穿梭。在體外和體內(nèi)，AHR靶基因細胞色素P450家族1亞家族A成員1(Cyp1a1)也受到抑制。AHR激動劑吲哚-3-甲醇(i3c)和3-甲基膽蒽(3mc)抑制了這種作用。此外，ISO還以AHR依賴的方式增加雌激素受體α的表達，ISO作為AHR拮抗劑，通過AHR/ERα軸促進成骨細胞分化。Zhang等[28]對ISO與膠原體外合成的關系進行研究，結(jié)果顯示，與對照組相比，ISO刺激的MC3T3-E1細胞膠原表達明顯上調(diào)(P<0.05)，ISO通過激活轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)信號通路，抑制Smad7蛋白表達促進膠原合成，從而促進骨組織的成骨化。王建茹等[29]比較不同濃度淫羊藿苷溶液對MC3T3-E1細胞成骨的誘導作用，發(fā)現(xiàn)1×10-4mmol/L濃度的淫羊藿苷溶液促成骨效果最明顯，其成骨誘導作用與重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinat human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)接近,可以作為一種骨誘導生長因子替代劑聯(lián)合骨修復材料用于促進骨組織再生。陳旭鳳等[30]研究表明，淫羊藿苷可以促進MC3T3-E1細胞成骨與分化，其可能是通過Wnt/β-catenin/BMP-2信號通路而實現(xiàn)的。Li等[31]通過實驗證明女貞子水提物對MC3T3-E1細胞有促進成骨作用，其可調(diào)節(jié)上清液中OPG和RANKL蛋白的表達實現(xiàn)。闞默等[32]在研究鹿茸Ⅰ型膠原(sika deer velet collagen Ⅰ，SDC-Ⅰ)治療骨質(zhì)疏松的作用機制時，用不同濃度的SDC-Ⅰ處理小鼠成骨前細胞MC3T3-E1，發(fā)現(xiàn)SDC-Ⅰ可以刺激MC3T3-E1細胞Smad 2/3和TGF-β1的表達，促進骨的形成，并認為可能是通過TGF-β1/Smad信號通路來實現(xiàn)的。相關研究表明，補腎活血固齒方可以通過上調(diào)成骨誘導因子BMP2的表達,誘導前成骨細胞MC3T3-E1向成骨細胞發(fā)展，從而促進骨的形成[33-34]。趙玲[35]研究發(fā)現(xiàn)，補腎活血固齒方可以促進MC3T3-E1細胞向成骨細胞樣表型發(fā)展,增加MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性及Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ，ColⅠ)和礦化結(jié)節(jié)的形成,促進MC3T3-E1細胞分化成熟,促進骨組織的形成。

3 補腎中藥促進MC3T3-E1細胞增殖及成骨與分化的機制探討

目前，補腎中藥對促進MC3T3-E1細胞增殖及成骨與分化的研究已經(jīng)深入到通路、分子水平，在細胞微環(huán)境中，多條信號通路共同作用，從而促進MC3T3-E1細胞增殖及成骨與分化。有學者研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白轉(zhuǎn)導途徑是通過Smad分子介導,主要依靠Smad4 (Co-Smad)與Smad1/5/8 (R-Smad)聚合后轉(zhuǎn)錄Runx2的表達,進而調(diào)節(jié)成骨細胞的相關基因表達[36-38]。有學者認為Smad分子是關鍵的促進成骨的調(diào)節(jié)蛋白,并研究發(fā)現(xiàn)在成骨細胞中特異性敲除Smad分子, 骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號即被阻斷, 成骨與分化停滯[39]。還有學者[40]認為Wnt通路信號是MC3T3-E1細胞在骨骼發(fā)育中的關鍵點，同時也證實了Wnt通路信號在促進MC3T3-E1細胞骨化進程中起到重要作用。也有學者認為補腎中藥是通過促進OPG和RANKL的mRNA和蛋白表達，從而幫助MC3T3-E1細胞骨化[31]。

4 討論

隨著社會的快速發(fā)展，由原發(fā)性骨病或創(chuàng)傷所致的骨缺損已于臨床上廣泛存在，僅在美國每年就存在10萬例以上的骨不連病例[41]。骨組織的再生重建具有極大的研究潛價值，但骨組織的修復是一個漫長、受多種因素影響的復雜過程。目前對骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)的研究較為豐富，而MC3T3-E1細胞作為成骨前體細胞研究相對較少。MC3T3-E1細胞具有體外穩(wěn)定的特性，且價格便宜，更適宜研究使用。研究表明，補腎中藥對MC3T3-E1細胞增殖、分化、成骨有明確的促進效果。中醫(yī)藥在治療骨組織的再生重建方面具有獨特優(yōu)勢，其特點在于整體調(diào)節(jié)、辨證論治。補腎類中藥治療骨缺損、骨質(zhì)疏松癥療效確切，然而其開發(fā)研究雖較多，但多處于初級階段，存在低水平重復現(xiàn)象。中藥及方劑治療疾病是復雜的、多靶點的綜合作用結(jié)果，現(xiàn)有研究對中藥復方的成分分析不夠明確，存在很多局限性。今后應在繼承傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論的基礎上，運用現(xiàn)代醫(yī)學先進的技術手段，中西醫(yī)結(jié)合研究補腎中藥促進骨生長的機制，進一步明確其有效成分并闡明其作用機制。