耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌對(duì)喹諾酮類耐藥機(jī)制的研究

蘇珊珊，張吉生，王 英，王 勇，王宇超，李慧玲，張曉麗

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154007)

大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌是耐碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)的主要分離菌株，引起較高的病死率并在全世界范圍內(nèi)流行，常對(duì)喹諾酮類藥物表現(xiàn)出高度耐藥性，已引起人們的關(guān)注[1]。喹諾酮類藥物自20世紀(jì)60年代進(jìn)入臨床后，常被用來(lái)治療由腸道細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染，廣泛和不恰當(dāng)?shù)氖褂脤?dǎo)致耐藥株的產(chǎn)生[2]。近年來(lái)，有關(guān)泛耐藥腸桿菌對(duì)喹諾酮藥物的耐藥機(jī)制如降低藥物對(duì)DNA回旋酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的作用、外排泵上調(diào)和產(chǎn)生滅活酶等方面均有研究，而有關(guān)CRE對(duì)喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制的研究還很少。故本研究探討某院CRE對(duì)喹諾酮耐藥基因的攜帶情況及耐藥機(jī)制，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2015年3月—2018年3月住院患者分離出的非重復(fù)CRE，篩選標(biāo)準(zhǔn)為對(duì)亞胺培南、美羅培南或厄他培南中至少一種藥物耐藥者或攜帶有碳青霉烯酶的菌株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。接合菌株為大腸埃希菌J53AZR(疊氮鈉耐藥)。

1.2 藥物敏感試驗(yàn) 采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，E-test試紙條復(fù)核左氧氟沙星，亞胺培南的藥敏結(jié)果(E-test試紙條購(gòu)自鄭州安圖生物公司)，并用紙片擴(kuò)散法復(fù)核厄他培南、美羅培南和環(huán)丙沙星的藥敏結(jié)果(藥敏紙片購(gòu)自O(shè)XOID公司)。根據(jù)2016年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏折點(diǎn)的判定。

1.3 喹諾酮耐藥基因檢測(cè) 采取煮沸法提取菌株模板DNA，PCR法擴(kuò)增PMQR基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、acc(6’)Ib-cr，引物參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)，由上海生工生物有限公司合成?？偡磻?yīng)體系25 μL：Go Taq Master Mix 12.5μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共循環(huán)35次；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳后，用紫外凝膠成像與分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，目的產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測(cè)序，結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上運(yùn)用BLAST比對(duì)基因型。

1.4 其他耐藥基因檢測(cè) 碳青霉烯酶耐藥基因：KPC、NDM、IMP；β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因：SHV、CTX-M-15，檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[4]。

1.5 質(zhì)粒接合試驗(yàn) 選取大腸埃希菌J53AZR為受體菌，分別挑取單個(gè)菌落配制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，?00 μL菌懸液加至4 mL LB肉湯培養(yǎng)基中混勻，放置搖床35℃ 180 r/min，振搖16 h。取40 μL J53AZR和160 μL供體菌于EP管中，高速離心4 000 rpm 5min，去上清再加入200 μL LB肉湯培養(yǎng)18 h，接種在含有亞胺培南(1 mg/L)和疊氮鈉(100 mg/L)的麥康凱培養(yǎng)中培養(yǎng)18 h，選取生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行鑒定，通過(guò)藥敏試驗(yàn)、PCR檢測(cè)耐藥基因及測(cè)序確定接合菌耐藥情況。

2 結(jié)果

2.1 菌株情況 2015年3月—2018年3月住院患者共分離出非重復(fù)的CRE 57株，其中肺炎克雷伯菌45株，大腸埃希菌5株，陰溝腸桿菌7株。

57株CRE中94.74%的菌株含有碳青霉烯酶KPC、NDM、IMP中的一種或多種，β-內(nèi)酰胺酶基因SHV、CTX-M-15檢出率為85.96%和80.70%。

表1 57株CRE對(duì)常見抗菌藥物的耐藥率(%)Table 1 Resistance rates of 57 CRE strains to common antimicrobial agents(%)

2.3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 57株CRE中91.23%的菌株含有喹諾酮耐藥基因，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)，其中acc(6’)Ib-cr分離率最高，為87.72%，其次為qnrB，分離率為77.19%，qnrS分離率為17.54%，共檢出2株菌攜帶qnrA，分離率為3.51%，未分離出qepA基因。共檢出84.21%的菌株同時(shí)含有2種或3種喹諾酮基因。基因檢出情況見表2。CRKP、CRECO和CRECL中耐藥株及敏感株攜帶PMQR基因情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。陽(yáng)性基因電泳圖及測(cè)序結(jié)果見圖1～2。

表2 57株CRE的PMQR基因檢出情況(%)Table 2 Detection of PMQR genes in 57 CRE strains(%)

表3 57株CRE中耐藥株與敏感株P(guān)MQR基因檢出情況Table 3 Detection of PMQR genes in 57 CRE-resistant and susceptible strains

圖1 PMQR陽(yáng)性基因電泳圖Figure 1 Electrophoresis map of PMQR positive genes

2.4 接合試驗(yàn)結(jié)果 57株CRE中有9株接合成功，其中肺炎克雷伯菌6株，大腸埃希菌2株，陰溝腸桿菌1株。除1株大腸埃希菌qnrB基因未轉(zhuǎn)入，其余PMQR基因均成功轉(zhuǎn)入8株接合子中，雖有1株接合子的左氧氟沙星MIC值發(fā)生改變，但9株接合子均對(duì)左氧氟沙星仍敏感。接合子MIC值見表4。

圖2 PMQR陽(yáng)性基因測(cè)序圖Figure 2 Sequencing map of PMQR positive genes

表4 接合子耐藥基因檢出情況及抗菌藥物MIC值(mg/L)Table 4 Detection of resistance genes of transconjugants and MIC values of antimicrobial agents(mg/L)

3 討論

喹諾酮類藥物為人工合成的抗菌藥物，因其抗菌譜廣、體內(nèi)分布廣、不良反應(yīng)少被臨床廣泛應(yīng)用于抗感染，其作用靶點(diǎn)為革蘭陰性菌DNA回旋酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，結(jié)合后形成“喹諾酮-酶-DNA”三元復(fù)合物，破壞細(xì)菌DNA結(jié)構(gòu)抑制其復(fù)制[5]。隨著臨床越來(lái)越多的應(yīng)用該類藥物，2016年CHINT耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)大腸埃希菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥率為52.9%，黑龍江省更高達(dá)60.1%，故引起我們對(duì)喹諾酮耐藥機(jī)制的研究[6]。

1998年美國(guó)在1例肺炎克雷伯菌中首次發(fā)現(xiàn)PMQR基因被命名為qnrA，隨后qnrB、qnrC、qnrS接連被報(bào)道[7]。qnr基因因其能夠編碼Qnr蛋白，保護(hù)細(xì)菌DNA促旋酶及拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)耐藥而引起人們的關(guān)注。喹諾酮耐藥機(jī)制還包括acc(6’)Ib-cr介導(dǎo)的滅活酶產(chǎn)生，qepA介導(dǎo)的細(xì)菌外排泵上調(diào)以及gyrA和parC引起的外膜通透性的改變，通過(guò)使藥物敏感性下降和難以進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部的共同作用導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥[8]。

CRE自發(fā)現(xiàn)以來(lái)的幾十年間迅速在全球多個(gè)國(guó)家及地區(qū)廣泛流行，因其僅對(duì)替加環(huán)素和多粘菌素敏感，臨床幾乎無(wú)藥可用。細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥往往也表現(xiàn)對(duì)喹諾酮類藥物耐藥，有報(bào)道[9]產(chǎn)KPC-2型CRKP對(duì)喹諾酮藥物耐藥主要為gyrA和parC基因發(fā)生突變。本研究CRE中PMQR的檢出率為91.23%，其中acc(6’)Ib-cr基因?yàn)槟c桿菌中攜帶率最高的基因，可能是導(dǎo)致對(duì)喹諾酮類耐藥最主要的原因，與阮榮華等[10]的報(bào)道一致，其也可能導(dǎo)致了本研究中收集菌株對(duì)慶大霉素、妥布霉素的高水平耐藥[7]。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，CRE對(duì)喹諾酮類藥物耐藥還可能是染色體介導(dǎo)的。其次為qnrB(77.19%)、qnrS(17.54%)和qnrA(3.51%)基因，其檢出率分布與臺(tái)灣報(bào)道的陰溝腸桿菌相似，但檢出率均高于該報(bào)道[11]。本試驗(yàn)未檢出qepA基因，說(shuō)明該院喹諾酮耐藥機(jī)制與細(xì)菌外排泵的上調(diào)無(wú)直接相關(guān)性。共檢出84.21%的菌株同時(shí)含有2種或3種喹諾酮基因，說(shuō)明該院CRE攜帶高水平的PMQR基因。

CRKP中acc(6’)Ib-cr檢出率為93.33%，qnrB檢出率為84.44%，同時(shí)攜帶這兩種基因的菌株為82.22%，并且有3株菌同時(shí)攜帶3種PMQR基因。在CRKP中檢出2株qnrA基因，但在大腸埃希菌和陰溝腸桿菌中未檢出此基因，驗(yàn)證了qnrA易在肺炎克雷伯菌中攜帶的結(jié)論[12]。該院CRKP對(duì)喹諾酮藥物的非敏感率為84.43%，對(duì)左氧氟沙星的非敏感率為17.78%，此結(jié)果可能與PMQR基因僅賦予低水平的喹諾酮類藥物耐藥性有關(guān)[2, 13]，由于CRKP還攜帶了KPC、SHV、CTX-M-15基因，可能使PMQR基因表達(dá)水平受影響。

CRECO對(duì)喹諾酮藥物的耐藥性比CRKP及CRECL高，與報(bào)道[14]結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，CRECO均對(duì)喹諾酮藥物耐藥，但有3株菌并未檢出PMQR基因，此現(xiàn)象也可能與其他耐藥機(jī)制如染色體的突變導(dǎo)致喹諾酮藥物高水平耐藥相關(guān)。提示臨床不應(yīng)選用喹諾酮類藥物治療CRECO引起的感染。

7株CRECL存在6株攜帶多種PMQR基因的現(xiàn)象，主要為qnrB、qnrS與acc(6’)Ib-cr組合，對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性與Peymani等[2]的報(bào)道一致。研究發(fā)現(xiàn)許多產(chǎn)ESBLs的分離株對(duì)氨基糖苷類和氟喹諾酮類藥物具有耐藥性[15]，該院陰溝腸桿菌攜帶金屬β-內(nèi)酰胺酶NDM、IMP并伴有SHV、CTX-M-15存在，多種耐藥機(jī)制導(dǎo)致對(duì)喹諾酮類藥物耐藥。

本次試驗(yàn)共有9株菌接合成功，除1株大腸埃希菌qnrB基因未轉(zhuǎn)入，另一株大腸埃希菌未攜帶PMQR基因，其余菌株P(guān)MQR基因均成功轉(zhuǎn)入到接合子中，但接合子中對(duì)左氧氟沙星MIC值只有一株明顯的改變，與其他研究結(jié)果有一定的差異[7，16]。編碼碳青霉烯酶的基因通常位于攜帶喹諾酮和氨基糖苷類耐藥基因的大質(zhì)粒上，所以在接合子中存在PMQR基因和碳青霉烯酶共同轉(zhuǎn)移的情況，在對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥性下降的情況下，可能存在PMQR基因，但是其并未表達(dá)，從而導(dǎo)致接合子耐藥水平不變。在本研究中接合成功菌株并未表達(dá)出對(duì)喹諾酮藥物的耐藥現(xiàn)象，但是否存在應(yīng)用喹諾酮類抗菌藥物后引起喹諾酮類耐藥基因高水平的表達(dá)從而導(dǎo)致耐藥情況，需要進(jìn)一步研究。另外PMQR基因的水平傳播仍需要引起醫(yī)院的重視，并采取相應(yīng)控制措施。

綜上所述，該院CRE攜帶高水平PMQR基因?qū)е锣Z酮藥物的低水平耐藥，證實(shí)PMQR基因作用較弱，而其他耐藥機(jī)制對(duì)其耐藥的產(chǎn)生起到了關(guān)鍵作用。但PMQR基因的高攜帶率是個(gè)不容忽視的問(wèn)題，在臨床喹諾酮類藥物大量使用，抗菌藥物選擇壓力下，PMQR基因表達(dá)可能增強(qiáng)，并通過(guò)質(zhì)粒在細(xì)菌之間進(jìn)行傳播，導(dǎo)致喹諾酮類抗菌藥物高水平耐藥。醫(yī)院應(yīng)長(zhǎng)期對(duì)PMQR基因流行情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并指導(dǎo)臨床醫(yī)生遵循喹諾酮類抗菌藥物使用適應(yīng)證及專家共識(shí)，減少耐藥菌的產(chǎn)生。