慢性牙周炎和IgA腎病大鼠模型的建立及其相關(guān)性初步分析*

王譯凡 劉 娜 胡 巍 郝思維 遲曉培 郭 斌

近年來，多項(xiàng)研究均證明慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)引起的局部炎癥可影響機(jī)體其他器官的宿主免疫反應(yīng)[1,2]。慢性腎病(chronic kidney diseases，CKD)和慢性牙周炎有許多共同的危險(xiǎn)因素，越來越多的流行病學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎是慢性腎病的一個(gè)危險(xiǎn)因素[3]。部分流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，中重度牙周炎患者的CKD患病率比牙周健康者高出2倍[4]，腎功能異常的患者牙周炎患病率是一般人群的2倍[5]。IgA腎病(immunoglobulin A nephropathy，IgAN)在慢性腎病中發(fā)病率較高，其發(fā)生發(fā)展與感染、粘膜免疫反應(yīng)密切相關(guān)[6]。慢性牙周炎是口腔疾病中最常見的慢性感染性病灶，在IgA腎病的發(fā)生發(fā)展過程中是否起到促進(jìn)作用是眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。因此本研究將建立SD大鼠IgAN和慢性牙周炎的復(fù)合模型，系統(tǒng)探究慢性牙周炎與IgAN之間互相影響的關(guān)系。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 6周齡SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，雌雄各半，體重160～180g，由斯北福(北京)生物技術(shù)有限公司提供。于解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)SCXK(京)2016-0002)飼養(yǎng)，室溫20～24℃，濕度20%，自由飲水、攝食。普通飼料適應(yīng)性培養(yǎng)1周后隨機(jī)分成4組，每組20只，雌雄各半。分別為正常對(duì)照組，慢性牙周炎組(CP組)，IgA腎病組(IgAN組)，慢性牙周炎+IgA腎病復(fù)合組(CP+IgAN組)。實(shí)驗(yàn)人員均取得動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上崗證。

1.2 實(shí)驗(yàn)用牙周致病菌 牙齦卟啉單胞菌(porphyromanus gingivalis，P.gingivalis)ATCC 33277株，伴放線放線桿菌(actinobacillus actinomycetemcomitans，A.actinomycetemcomitans)ATCC29523株，由北京中科質(zhì)檢公司提供。

1.3 動(dòng)物模型建立和處理

1.3.1 正常對(duì)照組 正常飼養(yǎng)，生理鹽水灌胃，皮下注射生理鹽水0.4ml，頻率同模型組。

1.3.2 CP動(dòng)物模型建立 100μL的 2-4×1010CFU/ml的牙齦卟啉單胞菌和4-6×108CFU/ml的伴放線放線桿菌加入到2%的羧甲基纖維素鈉CMC中配置細(xì)菌混懸液，腹腔麻醉大鼠，開口器固定大鼠頭部暴露雙側(cè)上頜磨牙，探針分離牙齦，結(jié)扎絲結(jié)扎雙側(cè)上頜第一磨牙，如結(jié)扎絲脫落，隨時(shí)結(jié)扎。細(xì)菌混懸液涂抹結(jié)扎線，隔一天一次，連續(xù)8次。

1.3.3 IgAN動(dòng)物模型建立 參考李靜等[7]的方法并加以改進(jìn)，用蒸餾水配置BSA成100g/L，劑量400mg/kg，隔天灌胃，持續(xù)12周；皮下注射四氯化碳0.1ml+蓖麻油0.3ml，每周1次；第8周尾靜脈注射脂多糖0.05mg。

1.3.4 CP+IgAN動(dòng)物模型建立 在CP大鼠模型的基礎(chǔ)上結(jié)合IgAN大鼠模型建立方法建立模型。

1.3.5 分別于8周末和12周末收集大鼠24h尿液；于建模第12周末處死大鼠，水合氯醛腹腔麻醉，取雙腎置于組織固定液中，取大鼠雙側(cè)上頜骨，然后處死。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 大鼠一般狀況 隔天稱重，檢查結(jié)扎絲脫落情況，觀察大鼠進(jìn)食及精神活動(dòng)狀況。

1.4.2 牙周臨床指標(biāo) 觀察牙周色、形、質(zhì)的變化，實(shí)驗(yàn)前、后由同一位口腔專業(yè)醫(yī)生利用牙周細(xì)探針對(duì)SD大鼠檢查記錄齦出血指數(shù)和探診深度，并根據(jù)X線檢查和體視顯微鏡確定附著喪失。

(1)齦出血指數(shù)(sulcus bleeding index，SBI)：SD大鼠處死前，用探針輕探選用牙的牙周袋或牙齦溝10 S，記分標(biāo)準(zhǔn)為：0＝齦緣和齦乳頭外觀健康，輕探齦溝后不出血；1＝齦緣和齦乳頭呈輕度炎癥，輕探齦溝后不出血；2＝牙齦呈輕度炎癥，有顏色改變，無腫脹或水腫，探診后點(diǎn)狀出血；3＝牙齦呈中度炎癥，有顏色改變和輕度水腫，探診后出血，血仍在齦溝內(nèi)；4＝牙齦呈重度炎癥，不但有色的改變，并且有明顯腫脹，探診后出血，血流出齦溝；5＝牙齦有色的改變，明顯腫脹，有時(shí)有潰瘍，探診后出血或自動(dòng)出血。

(2)探診深度(probing depth，PD)：SD大鼠處死后，用細(xì)牙周探針探選用牙的牙周袋，每牙選近中頰、頰側(cè)、遠(yuǎn)中頰3個(gè)點(diǎn)測(cè)量，取均值。

(3)附著喪失(attachment loss，AL)：大鼠處死后取牙槽骨經(jīng)顯微鏡目鏡大體觀察各組骨吸收情況，使用圖像分析軟件精確測(cè)定附著喪失情況，即釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x，每顆牙測(cè)量頰側(cè)和腭側(cè)的近、中、遠(yuǎn)分別六個(gè)位點(diǎn)的附著喪失距離，取均值。

1.4.3 牙周病理檢查 大鼠處死后，取牙槽骨福爾馬林固定、脫鈣，HE染色，顯微鏡下觀察大鼠牙周病理改變。

1.4.4 腎臟病理檢查和免疫熒光檢查

(1)分離雙腎，于組織固定液中固定腎組織24h后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，常規(guī)病理切片，常規(guī)HE染色，同時(shí)采用PAS、Masson染色技術(shù)，按試劑盒說明進(jìn)行操作，光鏡下觀察。采用半定量法評(píng)價(jià)腎小球硬化程度[8]，半定量法評(píng)價(jià)腎小管間質(zhì)纖維化程度[9]。

(2)采用石蠟切片免疫熒光染色流程，評(píng)分時(shí)采用國(guó)際通用5級(jí)半定量法判定IgA沉積強(qiáng)度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：低倍鏡下不能顯示、高倍鏡下似乎可見為一，0分；低倍鏡下似乎可見、高倍鏡下可見為+，1分；低倍鏡下可見、高倍鏡下清晰可見為++，2分；低倍鏡下可見、高倍鏡下耀眼為+++，3分；高倍鏡下刺眼++++，4分。

1.4.5 24h尿蛋白檢測(cè) 于8周末和12周末大鼠禁食12h，代謝籠內(nèi)收集24h尿液，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)尿蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 如圖1所示，大鼠建模過程中，正常對(duì)照組大鼠體重持續(xù)增長(zhǎng)，精神狀態(tài)佳。CP組、IgAN組、CP+IgAN組大鼠建模后較正常對(duì)照組體重增長(zhǎng)緩慢，與正常大鼠相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，8周后IgAN組4只大鼠出現(xiàn)毛色偏黃變亂，精神不振，CP+IgAN組大鼠發(fā)現(xiàn)9只出現(xiàn)同樣情況。

圖1 大鼠體重變化趨勢(shì)

2.2 牙周炎建模檢測(cè) 建模后4周CP組、CP+IgAN組大鼠表現(xiàn)出現(xiàn)牙齦炎癥，8周后部分大鼠結(jié)扎區(qū)可探及較深的牙周袋，臨床可見紅腫，探診易出血，非結(jié)扎區(qū)牙齦無明顯炎癥表現(xiàn)。

2.2.1 大鼠牙周臨床及病理表現(xiàn) 圖2可見正常組大鼠牙齦呈粉紅色，質(zhì)堅(jiān)韌，無牙槽骨吸收，病理切片顯示附著上皮無病理表現(xiàn)，牙槽嵴頂無吸收，牙槽骨無吸收；CP組、CP+IgAN組大鼠牙齦呈炎癥表現(xiàn)，色鮮紅，探診后出血，牙槽骨吸收明顯，病理切片顯示齦溝上皮糜爛，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，牙槽嵴頂可見破骨細(xì)胞位于骨陷窩內(nèi)，牙槽嵴頂及牙槽骨吸收明顯。

圖2 正常大鼠及牙周炎大鼠牙齦表現(xiàn)、牙槽骨吸收及牙周病理表現(xiàn)(HE染色×400)

2.2.2 大鼠牙周齦出血指數(shù)評(píng)分 圖3可見正常對(duì)照組大鼠牙齦無明顯異常，無探診出血，CP組大鼠呈牙周炎表現(xiàn)，牙齦中度炎癥，淺牙周袋形成，探診后出血，血在齦溝內(nèi)，IgAN組大鼠牙齦無明顯異常，部分呈牙齦輕度炎癥表現(xiàn)，探診后點(diǎn)狀出血，CP+IgAN組大鼠牙齦呈重度炎癥，探及深牙周袋，探診后出血，血流出齦溝。各組大鼠齦出血指數(shù)評(píng)分如表1所示，結(jié)果顯示：CP組、CP+IgAN組SBI指數(shù)和正常對(duì)照組比較，P＜0.001；CP+IgAN組和CP組比較SBI指數(shù)有顯著上升，P=0.003；IgAN組與正常對(duì)照組相比，P＞0.05。

2.2.3 大鼠牙周探診深度結(jié)果 如表2結(jié)果所示，CP組、CP+IgAN組探診深度均顯著高于正常組，P＜0.001；同時(shí)，CP+IgAN組和CP組的探診深度相比較，P＜0.001；IgAN組探診平均深度高于正常對(duì)照組。

圖3 各組大鼠結(jié)扎區(qū)牙齦

表1 牙周齦出血指數(shù)評(píng)分頻數(shù)表(n=20)

2.3 腎病建模檢測(cè) 于8周末和12周末大鼠禁食12h，于代謝籠內(nèi)收集24h尿液，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)尿蛋白含量，比較各組8周末和12周末大鼠尿蛋白的變化，結(jié)果如表3所示：建模的8周后，IgAN組和CP+IgAN組相較正常對(duì)照組大鼠尿蛋白顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；CP+IgAN組尿蛋白含量比IgAN組高，P＜0.05；CP組和IgAN組比較尿蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CP組和正常對(duì)照組比較尿蛋白含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。建模12周后，CP組、IgAN組和CP+IgAN組相較正常對(duì)照組大鼠尿蛋白顯著上升，P＜0.05；CP+IgAN組尿蛋白含量比IgAN組顯著增高，P=0.001。

表3 各組大鼠8周末和12周末24h尿蛋白量(mg/kg.24h，x.s)

2.4 處死后測(cè)定附著喪失 大鼠處死后取牙槽骨測(cè)定附著喪失情況，結(jié)果如表2：CP組、CP+IgAN組附著喪失程度通過軟件精密測(cè)量、統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)平均數(shù)均顯著高于正常組，P＜0.001；CP+IgAN組較CP組附著喪失增多，P＜0.001。

表2 探診深度及附著喪失

2.5 處死后檢測(cè)大鼠的腎臟病理及評(píng)分

2.5.1 腎臟病理表現(xiàn) 圖4 PAS染色結(jié)果可見，光鏡下正常對(duì)照組大鼠腎小球形態(tài)正常，未見明顯異常改變；CP組大鼠切片可見大部分腎小球形態(tài)正常，偶見系膜輕度增寬；IgAN組大鼠切片可見腎小球腎小球多處系膜區(qū)系膜輕中度增生，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，偶有系膜硬化、粘連；CP+IgAN組大鼠腎小球病變較IgAN組嚴(yán)重，系膜顯著增生，可見不同程度腎小球局灶系膜硬化。

2.5.2 免疫熒光染色結(jié)果 如圖4所示，正常對(duì)照組大鼠腎小球系膜區(qū)無免疫復(fù)合物沉積，即無熒光反應(yīng)，CP組大鼠腎小球偶見弱熒光，IgAN組大鼠腎小球免疫復(fù)合物沿腎小球系膜顆粒狀分布，IgA熒光低倍鏡下可見，高倍鏡下可見強(qiáng)度為+～+++，CP+IgAN組大鼠腎小球免疫復(fù)合物顆粒狀或團(tuán)塊狀分布，IgA熒光顯著，可見明顯IgA熒光沉積，熒光強(qiáng)度為++～++++。染色結(jié)果評(píng)分如表4，兩兩比較結(jié)果：CP組、IgA組、CP+IgAN組腎臟免疫熒光染色評(píng)分高于正常對(duì)照組，P＜0.001，提示大鼠腎組織IgA沉積；CP+IgAN組大鼠較IgAN組大鼠相比，染色評(píng)分顯著上升，P=0.002。

圖4 大鼠腎臟病理改變(PAS染色×400，IgA免疫熒光×400)

表4 免疫熒光染色評(píng)分頻數(shù)

3.討論

牙周炎是危害口腔健康的常見病和引起成人失牙的主要原因，在我國(guó)有較高的患病率。同時(shí)牙周炎也是最常見的慢性感染性病灶，與黏膜免疫相關(guān)，可引起全身炎性反應(yīng)。牙周炎的始動(dòng)因子是牙菌斑生物膜，口腔局部適宜的溫度和營(yíng)養(yǎng)條件為微生物的定植、生長(zhǎng)、繁殖創(chuàng)造了有利地形，加上各種組織的局部反應(yīng)，以及各種因素調(diào)節(jié)的宿主系統(tǒng)反應(yīng)，決定了牙菌斑形成后的牙齦炎癥進(jìn)展為牙周炎，引起牙周袋的形成、附著喪失及牙槽骨的喪失。近年來，關(guān)于牙周炎和其他系統(tǒng)疾病影響的研究越來越多，比如牙周炎與冠心病[10]、糖尿病、肺部疾病、早產(chǎn)、肥胖等疾病具有相關(guān)性。大量流行病學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)顯示慢性牙周炎是慢性腎病的一個(gè)危險(xiǎn)因素，有學(xué)者對(duì)慢性牙周病和慢性腎病的觀察性研究進(jìn)行meta分析[11]系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，與非牙周炎患者個(gè)體相比，慢性牙周炎患者的慢性腎病發(fā)生率高60%，OR為1.60(95%CI：1.44-1.79)。還有研究發(fā)現(xiàn)牙周炎患者早期腎損害指標(biāo)如胱抑素C升高。血透患者也會(huì)出現(xiàn)比較明顯的牙周組織的破壞，牙周狀況(包括菌斑指數(shù)、牙齦指數(shù)和牙石指數(shù))隨著透析治療的時(shí)間變長(zhǎng)變得更差[12]。

IgA腎病是我國(guó)最常見的慢性腎炎，在我國(guó)發(fā)病率占原發(fā)性腎小球腎炎的40%～47.2%[13]。明確診斷為IgA腎病的患者，有15%～20%的可能于10年內(nèi)進(jìn)展、30%～40%的可能于20年內(nèi)進(jìn)展為終末期腎功能衰竭[14,15]。IgA腎病的發(fā)病機(jī)制仍不明確，但目前有最新研究表明其與感染、粘膜免疫密切相關(guān)。牙周炎是目前已知的最常見的慢性感染性病灶，同全身健康密切相關(guān)，可能成為某些全身疾病的危險(xiǎn)因素。慢性牙周炎可以不斷局部產(chǎn)生炎性因子并進(jìn)入血循環(huán)，同時(shí)有研究表明IgA腎病患者的血液中有牙周炎特定致病菌，且抗體滴度同病程進(jìn)展相關(guān)[16,17]。

本研究建立了大鼠慢性牙周炎和IgA腎病復(fù)合模型。慢性牙周炎主要表現(xiàn)為炎癥、牙周袋的形成、附著喪失和牙槽骨的破壞，IgA腎病主要表現(xiàn)為蛋白尿及腎組織活檢可見系膜區(qū)IgA免疫熒光沉積。與正常組相比，牙周炎模型的成功建立可以觀察到明顯的牙周袋的形成、附著喪失及牙槽骨的吸收，IgA腎病模型的建立主要標(biāo)準(zhǔn)是可見明顯的腎臟免疫熒光染色，而復(fù)合模型同時(shí)表現(xiàn)出牙周炎的臨床及病理表現(xiàn)為深牙周袋的形成、附著喪失和牙槽骨的吸收，以及IgA腎病的臨床病理表現(xiàn)：腎小球系膜區(qū)系膜增生，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以及最關(guān)鍵的免疫復(fù)合物沉積的熒光反應(yīng)等。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：在成功建模的基礎(chǔ)上，CP+IgAN組的各項(xiàng)牙周臨床指標(biāo)，如齦出血指數(shù)、探診深度與附著喪失，和CP組比較，上升幅度都具有顯著差異，提示IgA腎病對(duì)牙周炎的發(fā)展可能有促進(jìn)作用；CP+IgAN組的腎組織病理和免疫熒光評(píng)分也較IgAN組嚴(yán)重，表明牙周炎也可能促進(jìn)IgA腎病的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)，CP組的腎臟病理出現(xiàn)部分腎組織炎性改變，免疫熒光染色評(píng)分比正常對(duì)照組高，說明牙周炎可能影響腎臟病的發(fā)生；IgAN組大鼠的齦出血指數(shù)評(píng)分、探診深度及附著喪失較正常對(duì)照組有一定的上升，部分大鼠出現(xiàn)牙齦炎甚至輕微的牙周炎，提示IgA腎病也可能會(huì)影響口腔內(nèi)牙齦炎的發(fā)生。可以從此推斷出：慢性牙周炎同IgA腎病之間有一定的互相促進(jìn)的影響。慢性牙周炎與IgA腎病相關(guān)性的生物學(xué)機(jī)制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)，與患牙周炎的健康人群相比，血透患者牙周病原菌的檢出率更高[18]，牙周基礎(chǔ)治療可以降低血透患者的炎性標(biāo)記物水平[19]。牙周炎致病菌可導(dǎo)致牙周的局部組織炎癥，通過局部病灶的炎性因子產(chǎn)生如IL-1，IL-6，PGE2和TNF-α等炎性介質(zhì)，以及部分細(xì)菌如牙齦卟啉單胞菌和其產(chǎn)物L(fēng)PS的入血[20]，介導(dǎo)并加重全身慢性炎癥狀態(tài)損害腎臟，特征表現(xiàn)為C反應(yīng)蛋白水平的增高。IL-1，IL-6，PGE2和TNF-α等炎性介質(zhì)隨著血流運(yùn)輸至腎臟組織，可以造成腎臟內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，形成腎臟血管動(dòng)脈粥樣硬化[21]，導(dǎo)致腎血流量的減少，進(jìn)而造成腎小球硬化。而IgA腎病可能通過黏膜免疫反應(yīng)及影響口腔衛(wèi)生健康加重慢性牙周炎，引起牙周組織的病理性改變[22]。然而他們之間的因果關(guān)系還有待進(jìn)一步闡述研究。

綜上所述，慢性牙周炎可能同IgA腎病互相影響，這可為臨床醫(yī)師提供更多的參考。但本研究樣本量不夠大，限制了研究結(jié)果的可靠性，且本研究無法證明慢性牙周炎和IgA腎病之間的因果關(guān)系，需要更多研究進(jìn)一步探索慢性牙周炎同IgA腎病之間的關(guān)系和相關(guān)機(jī)制。