Jmjd3和Ezh2酶活性抑制劑對人間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響及機(jī)制研究

武曉慧 李蓉 黃振鵬 楊帆 陳佳琪

摘要：目的? 研究EZH2和JMJD3對人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響及可能機(jī)制。方法? 體外培養(yǎng)人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行誘導(dǎo)分化。分化過程中分別加入EZH2酶活性抑制劑GSK126（6 μM）和JMJD3酶活性抑制劑GSKJ4（20 μM），對照組加入DMSO。采用Realtime PCR方法檢測脂肪細(xì)胞分化基因PPARγ、FABP4和ADIPOQ;棕色化標(biāo)志基因UCP1、PRDM16和CIDEA，以及米色脂肪獨有的標(biāo)志基因CD137、TMEM26和TBX1，并計算各組與對照組的相對表達(dá)量。采用Western Blot法檢測H3K27me3、UCP1、JAK2、STAT3和pSTST3的蛋白表達(dá)量。結(jié)果? GSK126組的脂滴形成略減少，GSKJ4組的脂滴形成明顯減少。GSK126組的H3K27me3含量減少，GSKJ4組的H3K27me3含量增加;GSK126組的UCP1、PRDM16、TMEM26和JAK2基因表達(dá)均明顯增加（P<0.05）;GSKJ4組的PPARγ、UCP1和JAK2的基因表達(dá)量均明顯降低（P<0.05）;GSK126組的UCP1蛋白表達(dá)增加而GSKJ4組UCP1蛋白表達(dá)減少。GSK126組的JAK2和pSTST3均增加，GSKJ4組的JAK2和pSTST3蛋白表達(dá)均減少。結(jié)論? EZH2酶活性抑制劑GSK126促進(jìn)人MSC向棕色或米色脂肪細(xì)胞分化。JMJD3酶活性抑制劑GSKJ4抑制人MSC向棕色或米色脂肪細(xì)胞分化;EZH2和JMJD3的酶活性影響H3K27的三甲基化修飾，可能通過JAK2-STAT信號通路，發(fā)揮調(diào)控人脂肪細(xì)胞分化的作用。

關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞;分化;EZH2;JMJD3;UCP1;JAK2c

中圖分類號：R364.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.020

文章編號：1006-1959（2019）02-0063-06

肥胖是當(dāng)今世界最常見的慢性非傳染性疾病之一[1]，我國的肥胖人數(shù)已達(dá)世界之最，2010年的調(diào)查結(jié)果顯示，有41.7%以上的人群處于超重或者肥胖狀態(tài)[2]。肥胖可以引發(fā)多種疾病，如胰島素抵抗、2型糖尿病、心腦血管疾病、骨關(guān)節(jié)炎、部分癌癥等[3，4]。多項研究表明，嚙齒動物和人體內(nèi)的棕色和米色脂肪細(xì)胞可以通過產(chǎn)熱消耗能量，對抗肥胖和胰島素抵抗，因而這兩類脂肪細(xì)胞的分化成為肥胖治療領(lǐng)域的研究熱點[5]。

目前對于脂肪細(xì)胞分化的研究已由針對單個基因功能的研究轉(zhuǎn)為基因表達(dá)調(diào)控的研究，如表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控基因表達(dá)的方式之一，研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3K27me3去甲基化酶jmjd3可以促進(jìn)小鼠棕色脂肪細(xì)胞的分化[6]，而H3K27me3甲基轉(zhuǎn)移酶Ezh2可以在體外促進(jìn)小鼠白色和棕色脂肪細(xì)胞的分化[7]，但在人體細(xì)胞尚無相關(guān)報道，其調(diào)控機(jī)制亦尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，JAK2可通過JAK2/STAT途徑調(diào)控脂肪細(xì)胞分化[8]。本實驗擬以人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）為研究對象，在誘導(dǎo)分化過程中使用EZH2酶活性抑制劑GSK126或JMJD3酶活性抑制劑GSKJ4處理細(xì)胞，觀察細(xì)胞成脂分化情況，并檢測JAK2及STAT3的表達(dá)，揭示Jmjd3和Ezh2對人間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過程的影響及可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑? 人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫）;間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液（MSCM，7501，美國Sciencell）;DMEM培養(yǎng)液（美國Sigma）;胎牛血清（四季青）;人用生物合成短效胰島素（諾和靈R，諾和諾德）;3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）（美國Sigma）;地塞米松（美國Sigma）;三碘甲腺原氨酸（T3，上海麥克林）;羅格列酮（麥克林）。用于western blot的一抗：兔Ezh2 抗體（1∶1000;CST）;兔Jmjd3抗體（1∶1000，Abcam）;兔H3K27me3抗體（1∶1000;Abcam）;兔JAK2抗體（1∶1000;Abcam）;兔STAT3抗體（1∶1000;Abcam）;兔磷酸化STAT3抗體（1∶1000;Abcam）;小鼠β-Tubulin（1∶1000;天津三箭）。二抗：HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗鼠IgG（1∶5000;北京中杉金橋）。全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）。用于Realtime PCR的RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Syber Green Master Mix（日本Takara）。小分子抑制劑GSK126、GSKJ4（美國MCE）;油紅0粉末（Sigma）。

1.2細(xì)胞的分化方法? 實驗設(shè)3個組，分別為對照組，GSK126組和GSKJ4組，將細(xì)胞種于12孔板內(nèi)，每個組設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞擴(kuò)增達(dá)100%匯合時出現(xiàn)接觸抑制，細(xì)胞停止分裂進(jìn)入分化階段（G0期），設(shè)為分化第2天。接觸抑制2 d后，開始分化，為分化第0天。每孔加入分化液，并且按照設(shè)計分別加入GSK126、GSKJ4或DMSO;分化液培養(yǎng)2 d后換用維持培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，換液后根據(jù)分組加入GSK126或GSKJ4，對照組加入等體積DMSO。分化第8天時，對照組已經(jīng)全部出現(xiàn)脂滴，此時結(jié)束分化。

1.3分化液的配制

1.3.1分化液的成份? 經(jīng)摸索實驗條件，MSC的擴(kuò)增培養(yǎng)和傳代使用MSCM培養(yǎng)液，分化時換用DMEM培養(yǎng)液分化更好。分化液的配制：在50 ml DMEM完全培養(yǎng)液中加入胰島素、IBMX、地塞米松、羅格列酮和T3;維持液的配制：在50 ml DMEM完全培養(yǎng)液中加入胰島素、羅格列酮和T3。所有藥品加入后0.22 μm濾器過濾于新的滅菌50 ml離心管，4 ℃保存。

1.3.2分化用藥品的配制? 短效胰島素：50 ml培養(yǎng)液中加入60 μl。IBMX的工作濃度為0.5 mM，稱取IBMX粉劑 222.2 mg，溶于2 ml DMSO，配成1000×母液，用時50 ml培養(yǎng)液中加入IBMX母液50 μl。地塞米松工作濃度為5 μm，稱取3.92 mg地塞米松，加入1 ml DMSO，配成10000×母液，用時在50 ml培養(yǎng)液中加入地塞米松母液5 μl。羅格列酮的工作濃度為1 μm，稱取0.357 mg羅格列酮，加入1 ml DMSO，配成1000×母液，用時在50 ml培養(yǎng)液中加入羅格列酮母液5 μl;T3工作濃度為1 nm，稱取0.0651 mg T3，加入10 ml DMSO，配成10000×母液。用時在50 ml培養(yǎng)液中加入T3母液 5 μl。

1.3.3 GSK126及GSKJ4儲存液的配制及使用? GSK126的分子量為526.6 g/mol。稱取GSK126粉劑1.05 mg，加入DMSO 1 ml，0.22 μm微孔濾膜過濾，工作濃度為6 μm，用時每1 ml培養(yǎng)液加3 μl母液。GSK J4的分子量為417.5 g/mol。稱取GSKJ4粉劑2.8 mg，加入DMSO 1 ml，充分溶解后，0.22 μm微孔濾膜過濾，工作濃度為20 μm，用時每1 ml培養(yǎng)液加3 μl母液。因培養(yǎng)液中DMSO>1‰，為排除影響，對照組每1 ml培養(yǎng)液加3 μl DMSO。

1.4細(xì)胞的油紅染色? 配制油紅O染液：稱取油紅O 粉末0.5 g，溶于100 ml異丙醇，濾紙過濾，避光4℃保存。使用時配制工作液，用時現(xiàn)配：取6 ml儲存液加ddH2O 4 ml，混勻后靜置10 min，用濾紙過濾。染色時，細(xì)胞用預(yù)冷的4%甲醛固定10 min，PBS緩沖液洗1次。油紅O工作液避光染色30 min;60%異丙醇浸洗1～2次，除去多余的油紅O染液。PBS浸洗2次，在吸水紙上拍干，滴加50%甘油封片劑（甘油：PBS緩沖液體積比=1∶1），在倒置顯微鏡下觀察并照相。

1.5 Realtime PCR檢測mRNA的表達(dá)? Trizol法提取總RNA。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。實驗所需引物由大連寶生公司設(shè)計并合成，序列信息見表1。以小鼠β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s，隨后42個循環(huán)：95 ℃變性5 s，56 ℃退火及延伸30 s。每個基因設(shè)3個復(fù)孔，采用2-△△Ct法計算基因的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，采用Graphpad prism 5軟件繪制成柱狀圖。

1.6 Western blot 法檢測蛋白表達(dá)? 倒掉培養(yǎng)液，向培養(yǎng)皿中加入RIPA裂解液（已經(jīng)加入PMSF），冰上放置裂解30 min;細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，并吸出液體至1.5 ml離心管，13000 rpm 4 ℃離心5 min。將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml的離心管中，上清液取5 μl采用BCA法做蛋白濃度測定，其余按照體積加入5×loading Buffer上樣緩沖液（內(nèi)含β-巰基乙醇），混勻，95 ℃金屬浴10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)待測蛋白的分子量配制不同濃度的SDS-Page分離凝膠，蛋白上樣量為20～50 μg，電泳完成后100 V 1 h濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后4 ℃孵育一抗過夜，相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液發(fā)光。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法? 數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件處理，所有數(shù)據(jù)采用（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本均數(shù)t檢驗，以P<0.05為統(tǒng)計學(xué)意義顯著，P<0.01為統(tǒng)計學(xué)意義極顯著。

2結(jié)果

2.1 GSK126對人MSC成脂分化影響較小，GSKJ4明顯減少MSC的成脂分化? 實驗設(shè)置3個組，分別是GSK126組，GSKJ4組和溶劑對照組（DMSO）。我們在培養(yǎng)液中根據(jù)文獻(xiàn)提供的濃度，在分化誘導(dǎo)和維持期持續(xù)加入GSK126和GSKJ4。分化8 d后進(jìn)行拍照，發(fā)現(xiàn)加入抑制劑后，細(xì)胞分化仍可進(jìn)行，但脂滴形成有差異。GSK126組脂滴形成略減少，GSKJ4組脂滴形成明顯減少，見圖1（上）。經(jīng)油紅染色證實，對照組脂滴較多，GSK126組的脂滴形成略減少，GSKJ4組脂滴形成明顯減少，見圖1（下）。

2.2抑制劑改變了H3K27me3甲基化修飾水平? 經(jīng)Western Blot檢測，發(fā)現(xiàn)給藥組H3K27me3的含量出現(xiàn)相應(yīng)的改變，GSKJ4組該蛋白含量增加，H3K27三甲基化修飾水平增高;GSK126組該蛋白含量減少，H3K27三甲基化修飾水平降低，見圖2A。接著我們測定了H3K27me3的甲基轉(zhuǎn)移酶Ezh2和去甲基化酶Jmjd3的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，加入酶活性抑制劑后Ezh2和Jmjd3的蛋白表達(dá)均無明顯改變，表明在酶蛋白含量無明顯改變的情況下，兩種蛋白的酶活性被部分抑制，見圖2B，圖2C。

2.3 GSK126組棕色脂肪標(biāo)志基因表達(dá)增加，GSKJ4組的脂肪分化基因和棕色脂肪標(biāo)志基因表達(dá)減少? 我們檢測了三組細(xì)胞的脂肪細(xì)胞分化基因PPARγ、FABP4和ADIPOQ;棕色化標(biāo)志基因UCP1、PRDM16和CIDEA，以及米色脂肪特有的標(biāo)志基因CD137、TMEM26和TBX1，并計算各組與對照組的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，GSK126組的脂肪細(xì)胞分化基因沒有明顯改變，而GSKJ4組的PPARγ表達(dá)明顯減少（P<0.05），見圖3B。GSK126組的UCP1和PRDM16的表達(dá)明顯升高（P<0.05，P<0.01），見圖3A。GSK J4組的Ucp1表達(dá)明顯減少（P<0.05），見圖3B。另外，GSK126組的米色脂肪特有基因TMEM26的表達(dá)明顯升高（P<0.05），見圖3A。經(jīng)Western blot檢測，GSK126組的Ucp1表達(dá)升高，而GSKJ4組的Ucp1表達(dá)降低，見圖3C。這些結(jié)果表明，GSK126促進(jìn)了人MSC向棕色脂肪方向的分化，而GSKJ4抑制了MSC向棕色脂肪方向分化。

綜上所述，H3K27me3的甲基化修飾在體外對于人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化發(fā)揮了重要的調(diào)控作用：EZH2催化的H3K27me3修飾增加抑制MSC向棕色和米色脂肪細(xì)胞分化;JMJD3催化的H3K27me3修飾減少促進(jìn)MSC向棕色和米色脂肪細(xì)胞分化。這些效應(yīng)可能通過JAK2-STAT3信號通路發(fā)揮作用。

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收稿日期：2018-11-3;修回日期：2018-11-13

編輯/楊倩