程序性死亡受體配體1和E3泛素連接酶Cbl-b在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

李 鵬，常玉喜，王慧娟，張國偉，閆相濤，張米娜，楊金坡，張曉娟，馬 杰，馬智勇

(1.河南省腫瘤醫(yī)院 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450008；2.河南省腫瘤醫(yī)院 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院分子病理科，河南 鄭州 450008)

近年來研究表明，免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制劑能夠激活腫瘤患者體內(nèi)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，從而促進(jìn)其殺傷腫瘤細(xì)胞，已經(jīng)成為肺癌的重要治療方法之一[1]。程序性死亡受體1(programmed death receptor 1，PD-1)/程序性死亡受體配體1(programmed death receptor ligand 1，PD-L1)是T細(xì)胞活化過程中重要的免疫檢測(cè)點(diǎn)[2]。PD-L1選擇性表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境中，能夠引起腫瘤微環(huán)境中的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞沉默，導(dǎo)致免疫抑制；而PD-1抗體能夠阻擋該免疫抑制過程，激活效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，并增強(qiáng)其抗腫瘤活性。研究顯示，PD-1抗體能夠顯著改善非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的預(yù)后[3]。E3泛素連接酶Cbl-b基因?qū)儆贑bl家族，能夠通過抗原、受體識(shí)別及共刺激分子負(fù)性調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞信號(hào)的激活，有望成為免疫調(diào)節(jié)治療的靶點(diǎn)[4]。本研究旨在探討PD-L1和Cbl-b在NSCLC組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系，為NSCLC患者的抗腫瘤免疫治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2004年7月至2009年6月河南省腫瘤醫(yī)院保存的NSCLC組織標(biāo)本及癌旁組織(距離癌組織>5 cm處)標(biāo)本各165例，其中，男46例，女119例；年齡39～75(63.11±9.54)歲；病理類型[5]：腺癌90例，鱗狀細(xì)胞癌75例；腫瘤分期[6]：Ⅰ期57例，Ⅱ期61例，Ⅲ期44例，Ⅳ期3例；病理分級(jí)[7]：1級(jí)26例，2級(jí)99例，3級(jí)40例。所有患者術(shù)前未接受放射治療和化學(xué)治療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診。NSCLC組織及正常肺組織經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋保存。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器免疫組織化學(xué)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、檸檬酸抗原修復(fù)液(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)，PD-L1一抗、Cbl-b一抗(美國CST公司)；移液器(加拿大BBI公司)，WD-9405型生物化學(xué)搖擺平臺(tái)(北京沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司)，SYQ MDX-280高壓鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，XDS-100倒置顯微鏡 (上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)，水浴箱 (北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)。

1.3免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)NSCLC組織和癌旁組織中PD-L1和Cbl-b蛋白的表達(dá)取石蠟標(biāo)本，連續(xù)切片，厚度約5 μm，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；PBS沖洗3次，每次5 min；體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫溶液中浸泡3～5 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS沖洗3次，每次5 min；98 ℃下檸檬酸修復(fù)液修復(fù)30～60 s，室溫下自然冷卻；PBS液沖洗3次，每次 5 min；滴加一抗(PD-L1抗體稀釋比例為1200，Cbl-b抗體稀釋比例為1250)，4 ℃冰箱過夜；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加二抗，室溫下孵育 40 min；PBS沖洗3次，每次5 min；3，3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色，PBS液沖洗3次，每次5 min；流水沖洗，蘇木精復(fù)染；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4結(jié)果判定PD-L1蛋白和Cbl-b蛋白陽性信號(hào)均為棕黃色顆粒樣物質(zhì)，PD-L1蛋白主要定位于細(xì)胞膜，Cbl-b蛋白位于細(xì)胞膜和(或) 細(xì)胞質(zhì)。陽性細(xì)胞指腫瘤細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)有棕黃色顆粒的細(xì)胞；腫瘤細(xì)胞存在棕黃色顆粒者為陽性表達(dá)，若不存在為陰性表達(dá)。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，觀察陽性細(xì)胞著色程度和陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞總數(shù)的百分比。PD-L1表達(dá)按照顯色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)：未著色為0級(jí)，淺黃色為1級(jí)，棕黃色為2級(jí)，棕褐色為3級(jí)；定義0級(jí)為陰性表達(dá)，1～3級(jí)為陽性表達(dá)；陽性細(xì)胞比例≥50%為高表達(dá)，<50%為低表達(dá)[8]。Cbl-b表達(dá)按照顯色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)：未著色為0級(jí)，淺黃色為1級(jí)，棕黃色或棕褐色為2級(jí)；定義0級(jí)為陰性表達(dá)，1～2級(jí)為陽性表達(dá)；陽性細(xì)胞比例≥25%為高表達(dá)，<25%為低表達(dá)，以25%為分界值由R軟件進(jìn)行擬合曲線分析所得[9]。PD-L1或 Cbl-b 陽性患者的判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)腫瘤比例評(píng)分(tumor proportion score，TPS)[10-11]，TPS=(可見PD-L1或Cbl-b陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)/所有可見腫瘤細(xì)胞數(shù))×100%，若TPS≥1%為陽性，TPS<1%為陰性。

1.5隨訪與資料采集患者均接受手術(shù)治療，隨訪方式包括定期復(fù)查、電話隨訪及家庭隨訪，末次隨訪日期為2014年8月20日，中位隨訪時(shí)間為47個(gè)月，生存時(shí)間以月為單位，總生存期(overall survival，OS)指患者從確診之日起至死亡或末次隨訪時(shí)間。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SAS 9.3軟件和R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。腫瘤組織中PD-L1和Cbl-b表達(dá)水平與患者的臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，PD-L1與Cbl-b表達(dá)的關(guān)系采用直線相關(guān)分析，PD-L1和Cbl-b表達(dá)與OS的關(guān)系采用log-rank檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier方法；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NSCLC組織和癌旁組織中PD-L1和Cbl-b蛋白的表達(dá)結(jié)果見圖1和圖2。NSCLC組織中PD-L1和Cbl-b陽性表達(dá)率分別為72.73%(120/165)、38.79%(64/165)，癌旁組織中PD-L1和 Cbl-b 陽性表達(dá)率均為7.88%(13/165)；NSCLC組織中PD-L1和Cbl-b陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.292、3.076，P<0.05)。

A：NSCLC組織；B：癌旁組織。

圖1NSCLC組織和癌旁組織中PD-L1蛋白的表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×200)

Fig.1ExpressionofPD-L1proteininNSCLCandparacanceroustissues(immunohistochemistry，×200)

A：NSCLC組織；B：癌旁組織。

圖2NSCLC組織和癌旁組織中Cbl-b的表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×200)

Fig.2ExpressionofCbl-bproteininNSCLCandparacanceroustissues(immunohistochemistry，×200)

2.2PD-L1和Cbl-b表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表1。PD-L1蛋白表達(dá)與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤直徑、陽性淋巴結(jié)數(shù)、病理類型及病理分級(jí)無關(guān)(P>0.05)。Cbl-b蛋白表達(dá)與NSCLC患者的性別及腫瘤病理類型有關(guān)(P<0.05)，與患者的年齡、腫瘤分期、腫瘤直徑、陽性淋巴結(jié)數(shù)及病理分級(jí)無關(guān)(P>0.05)。

表1PD-L1和Cbl-b的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1RelationshipbetweentheexpressionofPD-L1，Cbl-bandclinicopathologicalcharacteristicsofNSCLCpatients

臨床病理因素nPD-L1陰性/例(%)陽性/例(%)χ2PCbl-b陰性/例(%)陽性/例(%)χ2P年齡 ≥65歲10031(31.00)69(69.00)1.7780.18265(65.00)35(35.00)1.5340.216 <65歲6514(21.54)51(78.46)36(55.38)29(44.62)性別 男4613(28.26)33(71.74)0.0310.85921(45.65)25(54.35)6.5040.011 女11932(26.89)87(73.11)80(67.23)39(32.77)腫瘤分期 Ⅰ^Ⅱ期11834(28.81)84(71.19)0.5000.48176(64.41)42(35.59)1.7810.185 Ⅲ^Ⅳ期4711(23.40)36(76.60)25(53.19)22(46.81)腫瘤直徑 ≤3 cm5718(31.58)39(68.42)0.8140.36737(64.91)20(35.09)0.5020.479 >3 cm10827(25.00)81(75.00)64(59.26)44(40.74)陽性淋巴結(jié)數(shù) <2個(gè)12532(25.60)93(74.40)0.7270.39480(64.00)45(36.00)1.6880.194 ≥2個(gè)4013(32.50)27(67.50)21(52.5)19(47.50)病理類型 腺癌9024(26.67)66(73.33)0.0370.84838(42.22)52(57.78)30.0730.000 鱗狀細(xì)胞癌7521(28.00)54(72.00)63(84.00)12(16.00)病理分級(jí) 1^2級(jí)12535(28.00)90(72.00)0.1580.69175(60.00)50(40.00)0.3600.549 3級(jí)4010(25.00)30(75.00)26(65.00)14(35.00)

2.3NSCLC組織中PD-L1與Cbl-b蛋白表達(dá)的相關(guān)性NSCLC組織中PD-L1和Cbl-b蛋白表達(dá)呈直線關(guān)系(R2=0.075，P<0.01)，其模型為y=21.464 93+0.532 65x。

2.4PD-L1和Cbl-b蛋白表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系結(jié)果見圖3和圖4。PD-L1蛋白高表達(dá)患者29例，中位OS為45.0個(gè)月；低表達(dá)患者136例，中位OS為52.0個(gè)月；PD-L1蛋白高表達(dá)與低表達(dá)NSCLC患者的中位OS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。75例鱗狀細(xì)胞癌患者中，PD-L1蛋白高表達(dá)患者21例，中位OS為45.0個(gè)月；低表達(dá)患者54例，中位OS為81.0個(gè)月；PD-L1蛋白高表達(dá)的鱗狀細(xì)胞癌患者的中位OS顯著短于低表達(dá)患者(P<0.05)。90例腺癌患者中，PD-L1高表達(dá)患者8例，中位OS為50.0個(gè)月；低表達(dá)患者82例，中位OS為39.0個(gè)月；PD-L1高表達(dá)與低表達(dá)腺癌患者的中位OS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Cbl-b蛋白高表達(dá)患者31例，中位OS為39.0個(gè)月；低表達(dá)患者134例，中位OS為54.5個(gè)月；Cbl-b蛋白高表達(dá)患者的中位OS顯著短于低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3PD-L1蛋白表達(dá)與NSCLC患者生存期的關(guān)系

Fig.3RelationshipbetweentheexpressionofPD-L1proteinandOSofNSCLCpatients

圖4Cbl-b蛋白表達(dá)與NSCLC患者生存期的關(guān)系

Fig.4RelationshipbetweentheexpressionofCbl-bproteinandOSofNSCLCpatients

3 討論

免疫治療是目前腫瘤治療的重要手段，可以顯著提高NSCLC患者的生存時(shí)間，其主要機(jī)制是將免疫檢測(cè)點(diǎn)基因作為治療靶點(diǎn)。PD-1/PD-L1是重要的靶點(diǎn)之一[12-13]，然而，目前PD-L1在NSCLC中的作用尚未明確。一項(xiàng)對(duì)293例NSCLC患者的研究顯示，總體人群中PD-L1蛋白表達(dá)與預(yù)后無顯著相關(guān)性，但是，PD-L1蛋白表達(dá)陽性且淋巴結(jié)陰性的肺腺癌患者預(yù)后較差；PD-L1陽性在腺癌和男性有吸煙史的患者中更常見，PD-L1陽性的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞在鱗狀細(xì)胞癌和肺大細(xì)胞癌更常見[14]。另外一項(xiàng)對(duì)522例NSCLC患者的研究顯示，總體人群中PD-L1表達(dá)與OS無顯著相關(guān)性，然而經(jīng)過多變量分析，在縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，PD-L1強(qiáng)陽性與患者無復(fù)發(fā)生存時(shí)間及OS顯著縮短相關(guān)[8]。SUN等[15]檢測(cè)1 070例NSCLC術(shù)后病理標(biāo)本中PD-L1蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PD-L1陽性細(xì)胞率僅為44%，ⅢB/Ⅳ期NSCLC及鱗狀細(xì)胞癌患者PD-L1陽性細(xì)胞率較高，PD-L1表達(dá)強(qiáng)陽性與OS較短相關(guān)；在Ⅰ期患者中，PD-L1高表達(dá)患者的復(fù)發(fā)率顯著高于低表達(dá)患者。因此，PD-L1在NSCLC組織中的表達(dá)及臨床意義仍有待于進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中PD-L1和 Cbl-b 陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，PD-L1蛋白表達(dá)與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤直徑、陽性淋巴結(jié)數(shù)、病理類型及病理分級(jí)無關(guān)，Cbl-b蛋白表達(dá)與NSCLC患者的性別及腫瘤病理類型有關(guān)，且Cbl-b蛋白高表達(dá)患者的中位OS顯著短于低表達(dá)患者；NSCLC組織中PD-L1蛋白表達(dá)與患者的中位OS無顯著相關(guān)性，但是，PD-L1蛋白高表達(dá)的鱗狀細(xì)胞癌患者的中位OS顯著短于低表達(dá)患者，PD-L1高表達(dá)與低表達(dá)腺癌患者的中位OS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另外，NSCLC組織中PD-L1和Cbl-b蛋白表達(dá)呈直線關(guān)系；提示二者可能存在共同表達(dá)，參與腫瘤的局部免疫調(diào)節(jié)，但尚有待進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)研究證實(shí)。

綜上所述，Cbl-b蛋白和PD-L1蛋白在NSCLC組織中呈高表達(dá)；Cbl-b蛋白表達(dá)情況與NSCLC患者的性別、病理類型及OS有關(guān)；PD-L1蛋白表達(dá)與鱗狀細(xì)胞癌患者的生存期有相關(guān)性，但PD-L1蛋白表達(dá)與腺癌患者的生存期無相關(guān)性；PD-L1與CBLB蛋白表達(dá)呈直線相關(guān)。本研究為進(jìn)一步研究Cbl-b基因作為NSCLC潛在的免疫治療靶點(diǎn)提供了臨床數(shù)據(jù)支持。