γ-氨基丁酸Rho2受體在神經(jīng)母細胞瘤細胞中的穩(wěn)定表達及其在谷氨酸鹽致細胞死亡中的作用

李 敏，楚人杰，張 姣，韓思樂，李超堃

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學與神經(jīng)生物學教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體按藥理學特性被分為GABAa、GABAb和GABAc受體[1]。在腦缺血神經(jīng)損傷過程中，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡引起神經(jīng)元的興奮毒性，最終導致神經(jīng)元的死亡[2-3]。研究顯示，GABAa受體介導的突觸傳遞功能增強有利于機體對抗缺血損傷[4-6]。缺血腦損傷動物實驗顯示，能夠促進GABA攝入或者激活GABAa受體的藥物有一定的神經(jīng)保護作用[7-8]。研究顯示，孕酮的代謝產(chǎn)物能激活GABAa受體，引起腦缺血者GABA能神經(jīng)元活性增強[9-11]。然而，有關(guān)孕酮對GABAa受體調(diào)節(jié)作用的認識大多是通過GABAa受體選擇性抑制劑的研究間接獲得，尚缺乏直接證據(jù)顯示孕酮可直接作用于GABAa受體而影響GABA受體功能以及對GABAergic信號通路的調(diào)節(jié)。海馬神經(jīng)元存活狀態(tài)直接反映缺血損傷程度和藥物治療效果，該區(qū)域也是GABAergic系統(tǒng)中GABA Rho2受體(γ-aminobutyric acid Rho2，GABRR2)基因集中分布的區(qū)域。GABRR2的mRNA表達及蛋白免疫標記最明顯的區(qū)域是海馬組織，GABRR2分布于海馬區(qū)域神經(jīng)元的突觸外[12-13]。因此，GABRR2基因介導的突觸傳遞作用有必要被作為缺血應激調(diào)節(jié)和藥物作用的重要靶標進行深入研究。本研究通過克隆人腦組織GABRR2基因，利用真核表達質(zhì)粒pIRES2-eGFP構(gòu)建pIRES2-eGFP-Rho2重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染制備穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞，使用谷氨酸鹽進行損傷實驗，評估GABRR2在神經(jīng)損傷中的作用，旨在為GABRR2參與神經(jīng)損傷的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細胞神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞購于上海中國科學院細胞培養(yǎng)庫，由新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學教研室保存。

1.2主要試劑與儀器人腦組織GABRR2全長cDNA購自美國Open Biosystems公司，pIRES2-eGFP載體、X-fect轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Clontech公司，感受態(tài)大腸桿菌DH5a 購自北京天根生化科技有限公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，高糖達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)、遺傳霉素418(Geneticin 418，G418)購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，高保真聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)Q5 DNA聚合酶試劑盒購自美國New England Biolabs公司，脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucl esoside triphosphate,dNTPMix)、限制性內(nèi)切酶QuickCutDpnI購自日本TaKaRa公司，去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega公司，Anti-Rho2兔多克隆抗體購自美國ABcam公司，SOC培養(yǎng)基、無抗性培養(yǎng)(luria-bertani，LB)培養(yǎng)基、抗兔Alexa-Fluor555免疫熒光試劑盒、免疫染色固定液、卡那霉素、胰蛋白酶、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試驗盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；熒光顯微鏡購自德國蔡司公司，流式細胞儀購自美國BD公司。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成：pIRES2-eGFP上游引物序列為5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′，下游引物序列為5′-GCTTCGAATTCTG-CAGTCGA-3′；Rho2上游引物序列為5′-TGGGAGT-TTGTTTACTTGGCAC-3′，下游引物序列為5′-GGACACGCTGAACGCTTTGTGG-3′。

1.3實驗方法

1.3.1GABRR2基因亞克隆及pIRES2-eGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建利用PCR擴增GABRR2基因，采用快速克隆方法亞克隆GABRR2基因到真核表達載體pIRES2-eGFP[14]。PCR反應體系：Q5酶擴增緩沖液(0.25 g·L-1)10 μL，dNTP Mix 8 μL，pIRES2-eGFP上游引物(0.5 g·L-1)1.5 μL，pIRES2-eGFP下游引物(0.5 g·L-1)1.5 μL，模板(0.1 g·L-1)1 μL，Q5酶0.5 μL，補充雙蒸水50 μL，瞬時離心混勻。PCR反應參數(shù)：98 ℃預變性30 s，98 ℃變性15 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸2 min，共21個循環(huán)；72 ℃延伸5 min后冷卻至 4 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)體積分數(shù)1%瓊脂糖電泳進行鑒定，pIRES2-eGFP載體PCR產(chǎn)物及GABRR2基因產(chǎn)物各5 μL上樣電泳。在余留的PCR產(chǎn)物中加入1 μL QuickCutDpnI酶，混合后置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化 3 h。

1.3.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化將pIRES2-eGFP PCR產(chǎn)物和GABRR2擴增產(chǎn)物的消化產(chǎn)物各5 μL混合，取 2 μL 加入到100 μL感受態(tài)大腸桿菌DH5a(5×109L-1)中，冰浴30 min，42 ℃熱激處理60 s，0 ℃冰浴2 min，加入300 μL SOC培養(yǎng)基，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)1 h后，均勻涂布于含0.1 g·L-1的卡那霉素抗性LB固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12～15 h。

1.3.3重組質(zhì)粒提取及陽性克隆鑒定在卡那霉素抗性LB固體培養(yǎng)基上隨機挑取7個單克隆菌落，置于5 mL含有0.05 g·L-1卡那霉素的培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)。使用pIRES2-eGFP多克隆位點引物做菌液PCR，鑒定GABRR2重組陽性克隆，pIRES2-eGFP上游引物序列為5′-TGGGAGTTTGTT-TACTTGGCAC-3′，下游引物序列為5′-GGACACGCTGAACGCTTTGTGG-3′。菌液PCR反應參數(shù)：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min 后冷卻至4 ℃。反應完成后進行瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。選取能擴增出目標大小條帶的克隆，菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行DNA測序鑒定。按無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書進行質(zhì)粒抽提，重組質(zhì)粒命名為pIRES2-eGFP-Rho2。

1.3.4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及篩選穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞株接種SH-SY5Y細胞于6孔板中，待細胞生長密度達到50%后，使用X-fect轉(zhuǎn)染試劑盒將3 μg pIRES2-eGFP-Rho2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細胞。轉(zhuǎn)染4 h后更換正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后熒光顯微鏡下觀察pIRES2-eGFP-Rho2熒光蛋白的表達情況，視野下出現(xiàn)綠色熒光則表示轉(zhuǎn)染成功，將其植入96孔板培養(yǎng)1周，期間使用含G418(0.4 g·L-1)的選擇性培養(yǎng)基篩選耐藥綠色熒光株，每48 h換液1次。1周后熒光顯微鏡下觀察篩選綠色熒光細胞，用胰蛋白酶消化分散細胞，梯度稀釋至每1 mL 培養(yǎng)基中含10個細胞，取100 μL 稀釋后的培養(yǎng)基接種于96孔板內(nèi)，確保96孔板每孔中植入0或者1個細胞，同時做2個96孔板的平行接種。使用含G418(0.4 g·L-1)的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞2周，每48 h換液1次。熒光顯微鏡鑒定獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞，利用流式細胞儀進行細胞分選，以波長 488 nm 熒光激發(fā)，512 nm進行測定，篩選帶綠色熒光的陽性細胞，將篩選后的陽性細胞進一步擴大培養(yǎng)，使用熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達。

1.3.5免疫熒光法檢測pIRES2-eGFP-Rho2在野生型SH-SY5Y細胞和穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞中的表達分別將野生型SH-SY5Y細胞和穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞置于24孔板內(nèi)，細胞生長密度達70%時，吸盡培養(yǎng)液，分別加入100 μL固定液，固定20 min后洗滌3次。封閉液封閉，在搖床上輕輕搖動60 min，去封閉液，加入anti-Rho2一抗(150) 100 μL 作用 60 min。用洗滌液洗滌3次后加入 100 μL 免疫熒光二抗，避光孵育60 min，洗滌液洗滌3次，抗熒光淬滅封片液封片，使用熒光顯微鏡觀察明視野、綠色熒光視野和紅色熒光視野下pIRES2-eGFP-Rho2在野生型SH-SY5Y細胞、穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞中的表達情況。

1.3.6LDH試劑盒檢測野生型SH-SY5Y細胞、穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞存活率用胰蛋白酶消化野生型SH-SY5Y細胞和穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞，配成2×108L-1的單細胞懸液，接種于96孔塑料培養(yǎng)板中，每孔100 μL。將野生型SH-SY5Y細胞分為A1、B1、C1組，穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞分為A2、B2、C2組，每組設(shè)3個平行孔，其中A1、A2組細胞使用DMEM孵育，B1、B2組細胞使用含有200 μL谷氨酸鹽(0.9 g·L-1)的DMEM孵育，C1、C2組細胞使用含有200 μL谷氨酸鹽(0.9 g·L-1)和 100 μL GABA(0.4 g·L-1)的DMEM孵育，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，應用LDH試劑盒檢測各組細胞的存活率。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1GABBR2真核表達質(zhì)粒構(gòu)建以人腦組織cDNA和真核表達載體pIRES2-eGFP質(zhì)粒為模板，分別擴增出人GABRR2全長及pIRES2-eGFP骨架。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，1 400、5 100 bp PCR條帶清晰可見(圖1)。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物(圖2)，3、4、6、7泳道可見約 1 700 bp 條帶，其對應的單克隆菌液均為含有pIRES2-eGFP-Rho2重組質(zhì)粒的陽性克隆；2、5、8泳道顯示 300 bp 條帶，對應菌液為含有pIRES2-eGFP未重組質(zhì)粒菌液；說明重組質(zhì)粒構(gòu)建完成。

1：GABRR2基因擴增產(chǎn)物；2：質(zhì)粒pIRES2-eGFP的PCR擴增產(chǎn)物；3：DNA Marker。

圖1GABAR2基因擴增產(chǎn)物的PCR瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.1PCRagarosegelelectrophoresisofGABAR2geneamplificationproduct

1：DNA marker；2、5、8：重組質(zhì)粒pIRES2-eGFP-Rho2的陰性克隆；3、4、6、7：重組質(zhì)粒pIRES2-eGFP-Rho2的陽性克隆。

圖2pIRES2-eGFP載體的PCR瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.2PCRagarosegelelectrophoresisofpIRES2-eGFPcarrier

2.2pIRES2-eGFP-Rho2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及瞬時表達細胞系篩選鑒定SH-SY5Y細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h后，熒光顯微鏡明視野下檢測顯示，pIRES2-eGFP-Rho2瞬時轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細胞均處于正常存活狀態(tài)(圖3A)；使用綠色激發(fā)光對同一視野下的SH-SY5Y細胞進行檢測顯示，部分細胞中pIRES2-eGFP-Rho2瞬時轉(zhuǎn)染成功(圖3B)。

A：轉(zhuǎn)染后的SH-SY5Y細胞明視野圖；B：轉(zhuǎn)染后的SH-SY5Y細胞熒光視野圖，綠色熒光部分顯示pIRES2-eGFP-Rho2瞬時轉(zhuǎn)染成功。

圖3pIRES2-eGFP-Rho2在SH-SY5Y細胞中的瞬時表達(×400)

Fig.3TransientexpressionofpIRES2-eGFP-Rho2inSH-SY5Ycells(×400)

2.3流式細胞術(shù)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞的比例野生型SH-SY5Y細胞中表達pIRES2-eGFP-Rho2質(zhì)粒的細胞比例為0%(圖4A)；轉(zhuǎn)染pIRES2-eGFP-Rho2質(zhì)粒的SH-SY5Y細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES2-eGFP-Rho2質(zhì)粒的細胞比例為92%(圖4B)。

A：野生型SH-SY5Y細胞；B：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES2-eGFP-Rho2質(zhì)粒的SH-SY5Y細胞；M1：pIRES2-eGFP區(qū)域。

圖4流式細胞術(shù)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞數(shù)量

Fig.4ThenumberofsuccessfullytransfectedpIRES2-eGFPcellsinSH-SY5Ycellsbyflowcytometry

2.4pIRES2-eGFP-Rho2在SH-SY5Y細胞中的穩(wěn)定表達利用熒光顯微鏡鑒定SH-SY5Y細胞的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞處于正常存活狀態(tài)(圖5A)；明視野下正常存活的SH-SY5Y細胞的熒光圖像均顯示細胞內(nèi)的綠色熒光蛋白(圖5B)，含有綠色熒光蛋白的pIRES2-eGFP質(zhì)粒成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至SH-SY5細胞中。

A：明視野圖；B：熒光視野圖。

圖5pIRES2-eGFP-Rho2在SH-SY5Y細胞中的穩(wěn)定表達(×200)

Fig.5StableexpressionofpIRES2-eGFP-Rho2inSH-SY5Ycells(×200)

2.5pIRES2-eGFP-Rho2在SH-SY5Y細胞中的表達野生型SH-SY5Y細胞明視野下細胞分布均勻，形態(tài)正常(圖6A)；野生型SH-SY5Y細胞綠色熒光視野下無綠色熒光信號，無pIRES2-eGFP-Rho2質(zhì)粒的表達(圖6B)；野生型SH-SY5Y細胞紅色熒光視野下細胞分布均勻，形態(tài)正常且有紅色熒光信號，存在Rho2受體(圖6C)。穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞明視野下細胞分布均勻，形態(tài)正常(圖6D)；穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞綠色熒光視野下細胞分布均勻，形態(tài)正常且有綠色熒光信號，表達了pIRES2-eGFP-Rho2質(zhì)粒(圖6E)；穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞紅色熒光視野下細胞分布均勻，形態(tài)正常且有紅色熒光信號，存在Rho2受體(圖6F)。

A：野生型SH-SY5Y細胞明視野圖；B：野生型SH-SY5Y細胞綠色熒光視野圖；C：野生型SH-SY5Y細胞紅色熒光視野圖；D：穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho-2的SH-SY5Y細胞明視野圖；E：穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho-2的SH-SY5Y細胞綠色熒光視野圖；F：穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho-2的SH-SY5Y細胞紅色熒光視野圖。

圖6pIRES2-eGFP-Rho2在SH-SY5Y細胞中的表達(×400)

Fig.6ExpressionofpIRES2-eGFP-Rho2inSH-SY5Ycells(×400)

2.6GABA及谷氨酸鹽對野生型SH-SY5Y細胞和穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞存活率的影響A1、B1、C1組細胞存活率分別為(100.0±1.2)%、(69.6±1.5)%、(73.7±2.2)%，A2、B2、C2組細胞存活率分別為(100.0±0.8)%、(38.5±2.4)%、(59.7±1.8)%。A1、B1、C1組細胞存活率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=5.542，P<0.05)；其中，B1、C1組細胞存活率顯著低于A1組，C1組細胞存活率顯著高于B1組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。A2、B2、C2組細胞存活率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=6.588，P<0.05)；其中，B2、C2組細胞存活率顯著低于A2組，C2組細胞存活率顯著高于B2組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。A2組與A1組細胞存活率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，B2組細胞存活率顯著低于B1組，C2組細胞存活率顯著低于C1組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

腦血管疾病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，也是導致人類死亡的主要疾病之一。缺血缺氧引發(fā)的腦組織海馬神經(jīng)元死亡及其興奮毒性學說一直是腦缺血領(lǐng)域研究的熱點問題，GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其合成的改變是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性平衡的重要因素[15]。研究表明，在大鼠大腦中動脈永久閉塞模型中，缺血5 min后，阻塞側(cè)GABA合成只是對側(cè)的30%，這可能與抑制性中間神經(jīng)元自發(fā)性活動增加有關(guān)[16]。

當GABA激活時，谷氨酸鹽的釋放受到抑制，從而維持細胞內(nèi)外興奮性平衡[17]。研究發(fā)現(xiàn)，在海馬神經(jīng)元中，一系列的神經(jīng)遞質(zhì)激活過程及離子間的電導主要由谷氨酸鹽和GABA受體介導所產(chǎn)生[18]。海馬神經(jīng)的缺血缺氧損傷是腦缺血研究的重點，而GABA受體中的Rho亞基的集中區(qū)域為海馬組織，在全腦中，ρ亞基的mRNA表達及蛋白免疫標志最明顯的區(qū)域為海馬組織[19]。因此，有必要將GABRR2介導的突觸傳遞作用作為缺血應激調(diào)節(jié)和藥物作用的重要靶標來進行深入研究?；诖?，本實驗構(gòu)建pIRER2-eGFP-Rho2真核表達載體，旨在為探討GABRR2受體在腦缺血損傷中作用機制的研究提供基礎(chǔ)。

本研究利用基因克隆法構(gòu)建pIRES2-eGFP-Rho2過表達質(zhì)粒，進行細胞轉(zhuǎn)染，利用綠色熒光、G418抗性和流式細胞術(shù)實現(xiàn)了穩(wěn)定過表達細胞系的鑒定和篩選，采用免疫熒光法和熒光顯微鏡檢測了pIRER2-eGFP-Rho2在SH-SY5Y細胞中的穩(wěn)定表達，提示pIRER2-eGFP-Rho2質(zhì)粒成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細胞中，擴大培養(yǎng)后無脫靶現(xiàn)象。此外，使用谷氨酸鹽和GABA對野生型SH-SY5Y細胞及穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞進行干預后發(fā)現(xiàn)，給予谷氨酸鹽的B1、B2組細胞的存活率明顯低于僅使用DMEM孵育的A1、A2組，而B2組細胞的存活率顯著低于B1組，提示穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞對于谷氨酸鹽的損傷更加敏感；使用谷氨酸鹽+GABA干預的C1組細胞的存活率比B1組升高，而C2組細胞的存活率與B2組比較顯著升高，提示在GABA緩解谷氨酸鹽所造成的細胞損傷方面,穩(wěn)定表達pIRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞較野生型SH-SY5Y細胞更加敏感。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建pIRES2-eGFP-Rho2真核表達載體，建立了穩(wěn)定表達qIRER2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y細胞株，同時證明了使用GABA可緩解谷氨酸鹽對細胞帶來的損傷，為體外研究GABRR2的功能提供了實驗基礎(chǔ)，也為缺血性腦損傷的分子生物學治療提供了靶點。