活血通腑方對(duì)大鼠術(shù)后腹腔粘連巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的影響

王雅潔 李文林 連紫宇 馬妍婷 趙敏 楊麗麗 唐升進(jìn) 王葉同 曾莉,

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210046；2圖書(shū)館；3第一臨床醫(yī)學(xué)院；4護(hù)理學(xué)院)

腹腔粘連是腹部外傷或手術(shù)后在壁層腹膜與臟層腹膜及臟層腹膜之間形成的異常粘連〔1〕。有研究報(bào)道，90%以上的開(kāi)腹手術(shù)會(huì)發(fā)生腹腔粘連〔2〕，腹腔粘連形成后可引起諸多并發(fā)癥，如慢性腹痛、不孕癥、腸梗阻等〔3,4〕，不僅給患者帶來(lái)極大的痛苦，并且增加社會(huì)負(fù)擔(dān)〔5〕。中醫(yī)認(rèn)為術(shù)后腹部氣血瘀滯與腹腔粘連的形成關(guān)系密切〔6〕。經(jīng)優(yōu)化的活血通腑方，具有通里攻下、瀉下通腑、活血化瘀、行氣逐瘀之能?；钛ǜ街委熌c粘連及粘連性腸梗阻療效顯著〔7,8〕。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，具有滅菌、吞噬病原體和分泌細(xì)胞因子等功能，同時(shí)維持體內(nèi)平衡〔9〕。當(dāng)受到不同因子刺激時(shí)，巨噬細(xì)胞會(huì)形成經(jīng)典活化(M1)型和替代活化(M2)型巨噬細(xì)胞。受炎性微環(huán)境促炎因子刺激，巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，其分泌的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6等能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)，清除微生物，形成促炎癥反饋；被抗炎性細(xì)胞因子刺激，則轉(zhuǎn)化為M2型，M2型巨噬細(xì)胞分泌的IL-4、IL-13等可以降低炎癥反應(yīng)，形成抗炎癥反應(yīng)的正反饋機(jī)制〔10〕。因此通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，調(diào)整免疫微環(huán)境是防治腹腔粘連的重要途徑，本實(shí)驗(yàn)旨在探索活血通腑方對(duì)巨噬細(xì)胞極化表型細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控作用，探究活血通腑方防治術(shù)后腹腔粘連的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠50只，體重(250±20)g，由上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)2010002609303。動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)，自由飲食，照明晝夜交替。

1.2儀器和試劑 活血通腑方由大黃10 g、桃仁10 g、延胡索10 g、萊菔子10 g、紅花6 g和芒硝10 g組成，均購(gòu)自江西濟(jì)世堂藥業(yè)有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：170106020)；四磨湯口服液購(gòu)自湖南漢森制藥股份有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：1607206)；氟伐他汀膠囊購(gòu)自北京諾華制藥有限公司(產(chǎn)品批號(hào)：X1497)；生理鹽水購(gòu)自山東華魯制藥有限公司(產(chǎn)品批號(hào)：C15082702)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自南京金益柏生物科技有限公司，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)：Allegra 64R)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，酶標(biāo)儀(型號(hào)：Victor X3)購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)ABI StepOne Plus。TRIzol Reagent(產(chǎn)品批號(hào)：15596026)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)：K1622)購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司，Taq酶試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)：Q341-02)購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3藥物制備 取大黃50 g、桃仁50 g、延胡索50 g、萊菔子50 g，加飲片總量15倍(3 000 ml)的70% 乙醇，回流提取2 h，分2次進(jìn)行，藥液濾過(guò)，合并兩次提取液，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，濃縮至無(wú)醇味。上述藥渣與紅花30 g合并，加飲片總量20倍水煎煮，分3次煎煮，每次煎煮1 h，藥液濾過(guò)后合并，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至相對(duì)密度為1.00～1.10(60℃)，藥液冷卻后，進(jìn)行醇沉，加乙醇至含醇量50%，攪勻后靜置48 h，取上清液加入芒硝50 g，藥液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至相對(duì)密度1.00～1.10(60℃)，4℃冷藏備用〔11〕。

1.4方法

1.4.1造模方法 使用銼刀法建立大鼠術(shù)后腹腔粘連模型。造模前，全部大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，修剪腹部皮毛，仰臥位固定于鼠板，碘伏溶液消毒后，酒精脫碘，無(wú)菌操作下前正中開(kāi)口，輕輕將盲腸拉出腹腔，在盲腸端用什錦銼刀反復(fù)摩擦5 min，摩擦至表面出現(xiàn)針尖狀出血點(diǎn)，將盲腸納入腹腔，恢復(fù)原狀，逐層縫合肌肉層和表皮，75%酒精消毒。假手術(shù)組大鼠，腹部開(kāi)口后，空氣中充分暴露5 min，逐層縫合傷口，酒精消毒〔8〕。

1.4.2分組及給藥 將50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、四磨湯組、氟伐他汀組和活血通腑方組，每組10只。假手術(shù)組大鼠，腹部開(kāi)口后，空氣中暴露5 min，不予造模，逐層縫合傷口。模型組、四磨湯組、氟伐他汀組和活血通腑方組常規(guī)造模，術(shù)后第2天開(kāi)始灌胃給藥，灌胃藥液預(yù)熱，溫度37℃左右。四磨湯組給予四磨湯口服液，0.54 ml/100 g灌胃，1次/d，連續(xù)7 d；氟伐他汀組給予氟伐他汀膠囊生理鹽水，2 mg/kg，0.4 ml/100 g灌胃，1次/d，連續(xù)7 d；活血通腑方組給予活血通腑方水煎液，按大鼠體重1.044 g/100 g計(jì)算(等效量)，1 ml/100 g用藥量灌胃，1次/d，連續(xù)給藥7 d。模型組和假手術(shù)組均用生理鹽水灌胃，1 ml/100 g，連續(xù)7 d。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1粘連評(píng)分 觀察造模后動(dòng)物的一般情況及切口愈合狀況，術(shù)后第8天劍突下“U”形切口進(jìn)腹，采取血液和粘連組織，根據(jù)Phillips分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)〔12〕觀察組織粘連情況。0級(jí)：無(wú)粘連，計(jì)0分；Ⅰ級(jí)：少量粘連，粘連面積<20%，疏松易分，計(jì)1分；Ⅱ級(jí)：中度粘連，粘連面積<40%且≥20%，計(jì)2分；Ⅲ級(jí)：粘連廣泛，粘連面積在40%～60%，分離后局部有損傷和滲血，計(jì)3分；Ⅳ級(jí)：粘連成團(tuán)，粘連面積>60%，分離困難，引起腸梗阻，計(jì)4分。

1.5.2Masson染色 取大鼠腸創(chuàng)面處粘連組織，放入10%甲醛溶液固定，組織脫水后，進(jìn)行石蠟包埋，切片；切片脫蠟至蒸餾水；用weiger鐵蘇木精液染核10 min；鹽酸乙醇分化；用Masson復(fù)合染液染5～10 min；使用蒸餾水沖洗；磷鉬酸浸泡5 min后甩干；苯胺藍(lán)浸泡10 min，蒸餾水稍沖洗；分化液分化2次，每次30 s；使用蒸餾水沖洗2 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后樹(shù)脂封片，鏡下觀察病理改變。

1.5.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè) 取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液，全血室溫靜置1 h，-4℃過(guò)夜，離心機(jī)3 000 r/min，20 min，提取血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟對(duì)IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-4、IL-10、IL-13細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.4RT-PCR檢測(cè)IL-6、TNF-α、精氨酸酶(Arg)-1 mRNA表達(dá)水平 按照PCR RNA提取實(shí)驗(yàn)步驟，提取粘連組織RNA，按照PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟逆轉(zhuǎn)錄cDNA。引物序列：IL-6：正向5′-CCACTGCCTTCCCTACTTCA-3′，反向5′-ACAGTGCATCATCGCTGTTC-3′；TNF-α：正向5′-GCCAATGGCATGGATCTCAA-3′，反向5′-CCCTTGAAGAGAACCTGGGA-3′；Arg-1：正向5′-ACCCTGACCTATGCGTCATT-3′；反向5′-ATTCCCAGAGCTGGTTGTCA-3′；GAPDH：正向5′-GCTACACTGAGGACCAGGTT-3′，反向5′-CCCAGCATCAAAGGTGGAAG-3′。

1.6統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，各組均無(wú)死亡。術(shù)后24 h各組一般狀態(tài)較差，活動(dòng)少；術(shù)后48 h各組狀態(tài)尚可，活動(dòng)量較前有所增加；術(shù)后72 h各組狀態(tài)正常，活動(dòng)、飲食正常。術(shù)后切口愈合良好，無(wú)紅腫感染。

2.2Phillips分級(jí)結(jié)果 假手術(shù)組7只腹腔未見(jiàn)粘連形成，3只見(jiàn)少量粘連，疏松易分；模型組均見(jiàn)大片粘連，難以分離；四磨湯組、氟伐他汀組及活血通腑方組均有不同程度粘連；與模型組相比，四磨湯組、氟伐他汀組及活血通腑方組的粘連評(píng)分均有不同程度的減輕(P<0.05，P<0.01)，其中活血通腑方組和四靡湯組粘連評(píng)分降低顯著(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組術(shù)后7 d Phillips分級(jí)(n=10，n)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；下表同

2.3粘連組織Masson染色結(jié)果 粘連組織鏡下呈藍(lán)色的為膠原纖維，呈紅色的為肌纖維。假手術(shù)組局部可見(jiàn)少量淺藍(lán)色；模型組則呈現(xiàn)為大片密集的深藍(lán)色，提示組織存在大量膠原纖維，粘連明顯；四磨湯組、氟伐他汀組及活血通腑方組呈現(xiàn)較模型組少而稀疏的淺藍(lán)色，提示膠原纖維增生較模型組減少，見(jiàn)圖1。

圖1 各組粘連組織Masson染色觀察(×200)

2.4ELISA檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著增多，IL-4、IL-10、IL-13含量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，活血通腑方組、四磨湯組、氟伐他汀組IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05)，IL-4、IL-10、IL-13表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組IL-1、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13及TNF-α表達(dá)量

2.5RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，活血通腑方組、四磨湯組、氟伐他汀組IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 各組IL-6、TNF-α、Arg-1 mRNA表達(dá)量

3 討 論

研究表明活血化瘀藥具有促進(jìn)腸管蠕動(dòng)，防止組織缺血，改善腹腔血液循環(huán)，抑制結(jié)締組織增生等西藥所無(wú)法替代的作用〔13，14〕?；钛ǜ街饕委燄鲅Y，特別是腹部術(shù)后瘀血癥，多用于防治術(shù)后粘連性腸梗阻，對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化〔15～17〕,形成現(xiàn)在的活血通腑方，其中大黃、桃仁為主藥皆入大腸經(jīng)，通里攻下，瀉下通腑、活血化瘀；芒硝入胃、大腸經(jīng)，瀉下潤(rùn)燥軟堅(jiān)；萊菔子歸脾、胃經(jīng)，降氣除脹；合用理氣活血藥紅花、延胡索等增強(qiáng)行氣逐瘀之能。研究發(fā)現(xiàn)，活血通腑方能夠治療術(shù)后粘連性腸梗阻〔7〕，抑制腹腔粘連〔18，19〕，其含藥血清可降低CD40、CD40L表達(dá)，抑制單核細(xì)胞趨化蛋白-1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β的mRNA表達(dá)水平，抑制炎癥反應(yīng)，減少纖維蛋白的沉積和粘連帶的形成，降低粘連的發(fā)生〔8〕。

炎癥細(xì)胞的特異性炎癥反應(yīng)貫穿于整個(gè)粘連形成過(guò)程。在粘連形成過(guò)程中，巨噬細(xì)胞的自分泌和旁分泌作用會(huì)加重腹腔微環(huán)境的惡化，從而促進(jìn)粘連形成〔20〕。受腹腔微環(huán)境影響，巨噬細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化成不同功能的M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞可分泌多種炎癥因子和趨化因子，例如IL-6、TNF-α等，這些細(xì)胞因子可清除微生物，促進(jìn)炎癥反應(yīng)〔21,22〕，導(dǎo)致機(jī)體正常組織的炎癥損傷〔23〕，M2型巨噬細(xì)胞分泌的IL-4、IL-13等細(xì)胞因子則具有相反的功能，可通過(guò)抗炎細(xì)胞和抗炎因子抑制促炎細(xì)胞和促炎因子，降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)〔24〕。

本研究提示活血通腑方治療后，由M1型巨噬細(xì)胞分泌出的促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α含量的降低，由M2型巨噬細(xì)胞分泌的抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13的升高，提示可以通過(guò)巨噬細(xì)胞入手來(lái)防治術(shù)后腹腔粘連。

本研究發(fā)現(xiàn)活血通腑方能夠防治大鼠術(shù)后腹腔粘連，與術(shù)后腹腔粘連部位的巨噬細(xì)胞關(guān)系密切，活血通腑方可以通過(guò)重塑腹腔微環(huán)境，調(diào)控腹腔巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向不同表型極化；因此，通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化來(lái)觀察巨噬細(xì)胞影響術(shù)后腹腔粘連的作用機(jī)制將成為下一步研究的主要目的。