中藥復(fù)方筋脈通對高糖培養(yǎng)SD大鼠背根神經(jīng)元凋亡及NGF表達(dá)的影響

吳亞楠 梁曉春 楊丹

(1北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100730；2昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

神經(jīng)元的凋亡及神經(jīng)再生修復(fù)能力的減弱是糖尿病神經(jīng)病變發(fā)生的根本原因之一〔1〕。因此如何減少神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)神經(jīng)的修復(fù)與再生是糖尿病神經(jīng)病變防治的重要內(nèi)容〔2,3〕。高糖狀態(tài)下神經(jīng)生長因子(NGF)水平的降低是導(dǎo)致神經(jīng)元再生修復(fù)障礙或細(xì)胞凋亡的重要原因之一〔4～6〕。本研究擬觀察中藥筋脈通含藥血清對神經(jīng)元中NGF的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心購置孕15天(E15)的SPF級SD大鼠，動物許可證號：SCXK-(軍)2012-0004，從胎鼠中提取背根神經(jīng)節(jié)用于培養(yǎng)原代細(xì)胞。SPF級雄性SD大鼠，體重280～320 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001，用于制備含藥血清。

1.2實驗用藥 筋脈通膠囊(由菟絲子、女貞子、水蛭、桂枝、元胡、細(xì)辛等組成)，由北京九龍制藥廠加工生產(chǎn)，每粒含生藥0.35 g，批準(zhǔn)文號(97)京衛(wèi)藥制加字〔48〕第F-292號，生產(chǎn)批號061019。牛磺酸，產(chǎn)品編號T457l，購自Sigma公司。

1.3主要試劑和儀器 Neurobasal培養(yǎng)基(Gibco)，0.05%胰蛋白酶，0.25%胰蛋白酶，1%膠原酶Ⅱ(國家細(xì)胞資源平臺)，胎牛血清(FBS，Hyclone)，多聚賴氨酸(Sigma)，B27(Gibco)，淋巴細(xì)胞分離液(北京中杉金橋公司)，5-氟尿嘧啶、聚乙二醇單辛基苯基醚(TritonX-100)(Sigma)，NGF(Merck Millipore)，抗NGF抗體兔來源多克隆(Abcam)，微管相關(guān)蛋白(MAP)-2兔來源多抗(Millipore)，辣根過氧化物標(biāo)記羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)，熒光標(biāo)記原位末端轉(zhuǎn)移酶(TUNEL)試劑盒(Roche)，蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)配制試劑盒(Sigma)，原位逆轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒 (Invitrogen)，光學(xué)顯微鏡、倒置相差顯微鏡(Olympus)，Line-gene熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(杭州博日科技有限公司)，電泳儀(北京六一儀器廠)，激光共聚焦顯微鏡(Leica)。

1.4方法

1.4.1含藥血清的制備 取20只雄性SD大鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，將大鼠隨機(jī)分為筋脈通(JMT)組5只，牛磺酸(Tau)組5只，正常對照(Con)組10只，治療組給藥劑量按成人劑量的15倍計算〔即JMT:1.31 g/(kg·d)；Tau:1.2 g/(kg·d)〕；Con組給予等體積蒸餾水。每日灌胃2次，連續(xù)7 d。于末次灌胃后2 h內(nèi)頸動脈插管取血。室溫靜置2 h后，低溫離心機(jī)4 000 r/min離心10 min分離血清，水浴滅活后分裝為1 ml/支，-80℃冰箱保存，0.22 μm濾器過濾滅菌后使用。

1.4.2DRGn的原代培養(yǎng)、純化及鑒定 12%烏拉坦按1 ml/100 g的劑量腹腔注射深度麻醉孕鼠，消毒孕鼠下腹部，剪開腹部取出子宮，無菌條件下逐個將胎膜剪破取出胚胎，在5倍解剖顯微鏡下用顯微鑷剖開胎鼠背部的皮膚，縱向分離組織，打開髓腔，小心分離椎管內(nèi)的脊髓，然后摘取脊髓兩側(cè)呈串珠狀的背根神經(jīng)節(jié)，預(yù)冷的去離子平衡鹽溶液(D-Hanks)液沖洗，眼科剪充分剪碎組織至1 mm3，加入混合消化酶10 ml(配制比例為0.1%膠原酶：0.125%胰蛋白酶=3∶1)消化10～15 min，用完全培養(yǎng)基終止消化，尖頭吸管小心反復(fù)吹打，直至細(xì)胞懸液呈云霧狀，200目篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞懸液。在15 ml離心管中加入淋巴細(xì)胞分離液6 ml，將4 ml細(xì)胞懸液沿管壁緩慢滴加于分層液面上，2 000 r/min離心20 min；用細(xì)吸管插入中層絮狀區(qū)吸取細(xì)胞，置入另一50 ml離心管中，D-Hanks液重懸，再次離心棄上清。完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并置于T75培養(yǎng)瓶中進(jìn)行差速貼壁1 h，將貼壁較慢的神經(jīng)元細(xì)胞吸出，吸取10 μl細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)。按2×106/孔接種于6孔板中。4～6 h后棄完全培養(yǎng)基，換用無血清神經(jīng)元專用培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MAP-2蛋白免疫熒光鑒定。剛接種的DRGn在顯微鏡下較為均勻，胞體呈圓形，有折光性。培養(yǎng)6 h后,神經(jīng)元貼壁,少量死亡細(xì)胞漂浮，部分神經(jīng)元開始長出短小突觸。換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，貼壁的神經(jīng)元體積較前明顯變大，胞體成近圓形,向四周發(fā)出樹枝狀軸突,軸突相互連接形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)狀。培養(yǎng)48 h后神經(jīng)元胞體進(jìn)一步增大,胞體可呈類圓形或三角形,同時胞體相互聚集，呈簇狀分布，周圍折光性強(qiáng),軸突進(jìn)一步增多，并相互交錯形成更加密集的纖維網(wǎng)絡(luò)。

1.4.3細(xì)胞鑒定 將DRGn細(xì)胞懸液以2×106/孔的密度接種于放置蓋玻片〔預(yù)先包被多聚賴氨酸(PDL)〕的6孔板中，細(xì)胞生長至第2天，取出蓋玻片進(jìn)行細(xì)胞鑒定。4%多聚甲醛固定，漂洗后滴加0.1% Triton-X100常溫孵育，然后加入山羊血清封閉液與非特異性蛋白結(jié)合，漂洗后每個蓋玻片加入20 μl 1∶200稀釋的MAP-2抗體，4℃過夜，陰性對照組以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。先后加入20 μl 1∶100稀釋的異硫氰酸酯(FITC)耦聯(lián)山羊抗兔IgG及二脒基苯基吲哚(DAPI)工作液常溫孵育。用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察及照相，隨機(jī)選取10個視野照相，以MAP-2陽性細(xì)胞的數(shù)目占總細(xì)胞的比例為DRGn純度。DRG神經(jīng)元胞質(zhì)及軸突經(jīng)MAP-2抗體免疫熒光染色后可呈現(xiàn)綠色熒光，而其他非神經(jīng)細(xì)胞則未見綠色熒光，經(jīng)復(fù)染后所有細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。本實驗DRGn的純度達(dá)(92±0.73)%，可為后續(xù)實驗研究提供可靠的細(xì)胞模型。

1.4.4試驗分組 根據(jù)既往研究結(jié)果分為以下4個實驗分組，正常對照(Con)組、高糖(45 mmol/L葡萄糖)組(HG)、筋脈通含藥血清(JMT)組、牛磺酸含藥血清(Tau)組，設(shè)定45 mmol/L葡萄糖為高糖濃度，血清添加濃度均為10%。

1.4.5TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 DRGn細(xì)胞按2×106細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中，更換條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。漂洗后用4%多聚甲醛固定樣本，加入0.1%Triton X-100室溫孵育。陽性對照組滴加50 μl TUNEL反應(yīng)液，陰性對照組僅滴加標(biāo)記液。熒光顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞可見綠色熒光標(biāo)記。先后滴加50 μl過氧化物酶(POD)轉(zhuǎn)換劑及50 μl二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液，細(xì)胞核有棕黃色顆粒出現(xiàn)時停止反應(yīng)。然后經(jīng)蘇木素復(fù)染，充分沖洗返藍(lán)，鏡下觀察凋亡的細(xì)胞可出現(xiàn)特異性棕黃色顆粒。采集圖片，每組隨機(jī)選取10個視野，最少計數(shù)500個細(xì)胞，運用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件分析圖片，計算出細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率%=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.4.6Western印跡檢測DRGn中NGF蛋白的表達(dá) 接種DRGn于6孔板中，不同條件干預(yù)24 h后細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞樣品，提取總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度，制備SDS-PAGE電泳，每泳道加總蛋白量80 μg，進(jìn)行70 V/100 V恒壓電泳，經(jīng)濕轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入兔抗鼠NGF多克隆抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，加入山羊抗兔IgG(1∶3 000)室溫孵育60 min，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，分析蛋白條帶，讀取條帶面積、寬度和灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)的灰度比值作為目的蛋白表達(dá)的相對量，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4.7qRT-PCR法檢測DRGn中NGF mRNA的表達(dá) 接種DRGn于6孔板，分別加入不同的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，采用Trizol一步法提取不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞總RNA，按照cDNA合成試劑盒使用說明操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green I核酸染料和Line-gene熒光定量PCR檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，擴(kuò)增循環(huán)：95℃ 2 min，95℃ 20 s(40個循環(huán))，58℃ 20 s，72℃ 20 s。應(yīng)用Primer 6.0軟件設(shè)計引物，上游引物：5′-GGCATTGACTCCAAGCACTG-3′下游引物：5′-ACACGCAGGCTGTATCTATCC-3’。根據(jù)繪制的梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，生成目的基因和管家基因的濃度結(jié)果。此樣品此基因的校正后的相對含量為每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度。

1.4.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行非參數(shù)檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞凋亡率比較 與Con組(28.54±8.10)%比較，HG組的細(xì)胞凋亡率顯著升高〔(71.82±11.87)%，P<0.01〕；與HG組比較，JMT組〔(32.98±7.08)%〕、Tau組〔(37.51±8.53)%〕細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P<0.01)。

2.2各組NGF蛋白表達(dá)比較 與Con組比較，HG組及Tau組的NGF蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)，JMT組NGF蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與HG組比較，JMT組NGF蛋白的表達(dá)顯著升高，而Tau組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Tau組比較，JMT組NGF蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。見表1、圖1。

2.3各組NGF mRNA表達(dá)比較 與Con組比較，HG組的NGF mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，JMT組及Tau組NGF mRNA的表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；與HG組比較，JMT組及Tau組NGF mRNA的表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；Tau組與JMT組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

圖1 各組DRGn中NGF蛋白的表達(dá)

3 討 論

研究表明〔4～6〕糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)發(fā)生時，胰島素作用的減弱、蛋白激酶特異性亞型的變化及神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的降低等多種因素均可能導(dǎo)致神經(jīng)修復(fù)再生能力的降低。20世紀(jì)90年代，動物實驗及臨床研究即表明，神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏或有效性的減弱是DPN的發(fā)病原因之一〔7〕。神經(jīng)營養(yǎng)因子是一具有神經(jīng)營養(yǎng)活性的蛋白質(zhì)，對神經(jīng)元的發(fā)育成熟、神經(jīng)損傷后的修復(fù)、功能的維持均有重要作用。它包含不同的種類，NGF就是其中一種對周圍神經(jīng)系統(tǒng)具有神經(jīng)營養(yǎng)活性的蛋白質(zhì)，它能夠促進(jìn)DRGn發(fā)育，維持其正常功能〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)在背根神經(jīng)節(jié)受損后很快就出現(xiàn)NGF水平及mRNA的變化〔9〕。在動物實驗中觀察到，NGF能夠降低由紫杉醇誘導(dǎo)的胎鼠背根神經(jīng)元的損傷〔10〕。在細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)，在NGF低水平的條件下，紫杉醇可導(dǎo)致交感及感覺神經(jīng)元軸突生長受到抑制，但提高NGF水平后，則神經(jīng)元的軸突生長加速〔11〕，可見NGF在保護(hù)神經(jīng)元功能及形態(tài)方面的作用。

NGF除了在維持神經(jīng)元功能及形態(tài)方面的作用外，與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡還有密切聯(lián)系。神經(jīng)元受損后最嚴(yán)重的結(jié)局就是發(fā)生凋亡，凋亡也是神經(jīng)元受損后難于逆轉(zhuǎn)的病理基礎(chǔ)。研究表明，神經(jīng)細(xì)胞受損后發(fā)生凋亡的機(jī)制涉及眾多途徑，其中NGF的缺乏是其中的原因之一〔12,13〕。NGF缺乏導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能包括以下方面：①NGF的缺乏可以通過NGF受體途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。NGF受體家族統(tǒng)稱為酪氨酸激酶受體(Trk)，神經(jīng)營養(yǎng)因子通過與神經(jīng)元上不同親和力的受體結(jié)合對不同的神經(jīng)元有特定的營養(yǎng)作用。小的感覺纖維及自主神經(jīng)元主要表達(dá)高親和力的受體TrkA，還有一種低親和力的受體p75NTR，兩種受體均能調(diào)節(jié)NGF的生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，在TrkA受體表達(dá)水平降低時，NGF與大鼠血旺細(xì)胞p75NTR受體結(jié)合可激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB〔14,15〕，NF-κB廣泛存在于包括神經(jīng)細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞中，是一個調(diào)節(jié)凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子。氧化應(yīng)激、缺氧、NGF的缺乏等多種條件下均能使其表達(dá)增加〔16〕。NF-κB通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)促凋亡蛋白Bcl-x 基因的表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡〔17〕。②高親和力TrkA受體信號通路的激活主要是使TrkA中的酪氨酸殘基Y490磷酸化，磷酸化的TrkA-Y490進(jìn)一步激活其下游磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路，使NGF產(chǎn)生維持神經(jīng)細(xì)胞存活的功能〔18〕。高糖狀態(tài)下氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，大量產(chǎn)生的活性氧簇及活性氮簇阻礙了TrkA受體磷酸化過程，使NGF的TrkA受體中的酪氨酸殘基Y490發(fā)生硝基化，抑制NGF/TrkA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時使NGF低密度受體p75NTR表達(dá)增加，通過p75NTR信號通路誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡〔19〕。③Bax是Bcl-2蛋白家族的促凋亡成員，NGF水平的降低可導(dǎo)致Bax的激活，使線粒體外膜的通透性增加，細(xì)胞色素C由線粒體內(nèi)膜流至胞質(zhì)，在胞質(zhì)內(nèi)刺激形成凋亡小體，最終激活凋亡效應(yīng)器半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡〔12〕。由此可見，NGF缺乏與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。課題組既往研究表明，筋脈通含藥血清干預(yù)50 mmol/L高糖培養(yǎng)的DRGn 24 h后，可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA及其蛋白的表達(dá)，下調(diào)Caspase-3 mRNA及其蛋白的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡，其作用優(yōu)于對照藥維生素C〔20〕。此外，筋脈通含藥血清還具有促進(jìn)高糖培養(yǎng)血旺細(xì)胞的增殖，增加睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)表達(dá)的作用〔21,22〕。本實驗也發(fā)現(xiàn)，筋脈通含藥血清能夠明顯減少45 mmol/L高糖培養(yǎng)24 h DRGn細(xì)胞凋亡率，同時可增加NGF蛋白及mRNA的表達(dá)，且升高NGF蛋白表達(dá)的作用優(yōu)于對照藥?；撬帷？梢娊蠲}通含藥血清能抑制DRGn的凋亡，其抗凋亡的作用可能與增加NGF的表達(dá)有關(guān)。