離子色譜法測定土壤中單糖含量

李國強(qiáng)，譚卓杰，李韻儀，羅 釘，王 林，李煥勇

（1．佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000；2．暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632；3．暨南大學(xué)分析測試中心，廣東 廣州 510632）

糖作為土壤中碳水化合物的組成之一，是土壤有機(jī)質(zhì)的重要組分，能夠在促進(jìn)土壤形成良好團(tuán)聚結(jié)構(gòu)的同時(shí)為微生物的活動(dòng)提供有效的碳源，對土壤的質(zhì)量有重要的影響［1］。目前，糖的測定主要是通過氣相色譜-質(zhì)譜［2-3］、氣相色譜［4-6］、液相色譜［7-8］、液相色譜-質(zhì)譜［9-10］以及毛細(xì)管電泳［11-12］等方法來進(jìn)行，均需要衍生處理。采用離子色譜法測定具有快速方便、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，本研究通過優(yōu)化檢測條件可方便、快速地對土壤中的單糖進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ICS-2500型色譜儀（美國），主要配置：含在線脫氣裝置的四元梯度泵GP50、柱溫箱LC30、淋洗液自動(dòng)發(fā)生器EG50、電化學(xué)檢測器ED50（Au為工作電極，Ag/AgCl為參比電極）、糖分離柱（CarboPACRTM PA10，2×250 mm）、 糖 保 護(hù) 柱（CarboPACRTM PA10，2×50 mm）、氨基酸捕集柱（AminoPACRTrap，2×50 mm）、色譜工作站 Chromeleon 6.0、一次性濾頭（0.2 μm）、移液槍（Eppendorf，10、100、1 000 μL 各一支）。

250 mmol·L-1氫氧化鈉溶液（美國）、超純水（Millipore 超純水系統(tǒng)制備）、單糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、果糖，德國）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及工作曲線溶液的配制

分別稱取5.0 mg的鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖，用15 mL超純水溶解后定容至50 mL容量瓶中，制得濃度為100.0 mg·L-1的各對照品儲(chǔ)備液。再用超純水配制質(zhì)量濃度分別為 0.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg·L-1的各工作曲線溶液。

1.3 檢測電位

在脈沖安培檢測器上電極間使用的脈沖電位波形見表1，其中在200～400 ms之間是積分檢測時(shí)間，410～420 ms之間是電極表面的清洗時(shí)間。

1.4 樣品處理［3，13］

土壤樣品先冷凍干燥，然后用瑪瑙研缽研磨，研磨后的樣品過篩（孔徑 0.180 mm），稱取樣品4.0 mg，加入 4 mol·L-1的三氟乙酸 1.0 mL，封口，在90℃條件下水解反應(yīng)60 min，離心后將上清液移至試管中，沉淀洗滌3次后合并上清液，然后通氮?dú)獯蹈?，?1.0 mL 水溶解并用 0.4 mol·L-1KOH調(diào)pH值至6，離心后將上清液及沉淀洗滌液合并后通氮?dú)獯蹈?，用水溶解后定容?0 mL，上機(jī)測定。

表1 Au電極和Ag/AgCl電極之間的電位隨時(shí)間的變化

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相對單糖分離的影響

在流速和溫度保持不變的條件下，調(diào)節(jié)淋洗液NaOH溶液的濃度分別為2.5、7.5、12.5、17.5、25.0 mmol·L-1，在糖分離柱（CarboPACRTM PA10，2×250 mm）上分析含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖和果糖等7種單糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

隨著淋洗液NaOH濃度的增大，各種糖的保留時(shí)間都有所減小，峰形變窄，半乳糖和葡萄糖的分離效果變差，甘露糖與木糖無法分離而合并成一個(gè)峰。綜合考慮各種糖的分離情況，選用12.5 mmol·L-1NaOH溶液作為分離的流動(dòng)相。淋洗液NaOH對糖保留時(shí)間的影響結(jié)果見圖1。

圖1 NaOH對糖保留時(shí)間的影響

2.2 流速對單糖分離的影響

在流動(dòng)相組成和溫度保持不變的條件下，調(diào)節(jié)流動(dòng)相流速分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL·min-1，在糖分離柱上考察上述7種單糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離情況。

隨流動(dòng)相流速增大，保留時(shí)間減小，峰形變窄，甘露糖與木糖無法分離而合并成一個(gè)峰；流速減小時(shí)有利于甘露糖與木糖的分離但作用較弱，而流速減小時(shí)分析時(shí)間明顯延長。綜合考慮各種糖的分離情況，選取0.20 mL·min-1作為分析流速。流速對糖保留時(shí)間的影響結(jié)果見圖2。

圖2 流速對糖保留時(shí)間的影響

2.3 溫度對單糖分離的影響

在流速和流動(dòng)相組成保持不變的條件下，分別在23、27、30、35、40、45℃的柱溫條件下，考察各單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離情況。

溫度增加時(shí)，保留時(shí)間減小，半乳糖和葡萄糖的分離效果變差，甘露糖與木糖無法分離而合并成一個(gè)峰，40℃以上時(shí)半乳糖和葡萄糖重疊成一個(gè)峰。因此，選擇30℃作為分離時(shí)的最佳柱溫。溫度對糖保留時(shí)間的影響結(jié)果見圖3。

綜上所述，綜合考慮流速、柱溫、流動(dòng)相組成等以上各種因素對分析效果與分析時(shí)間等的影響，確定分析單糖的最佳條件為：淋洗液NaOH的濃度12.5 mmol·L-1、柱溫為 30℃、流速為 0.20 mL·min-1。

2.4 工作曲線繪制及檢出限

圖3 溫度對糖保留時(shí)間的影響

按照優(yōu)化的離子色譜條件，將工作曲線溶液依次進(jìn)樣測定，以各單糖標(biāo)準(zhǔn)的濃度單位為橫坐標(biāo)（x，μg·L-1），采用色譜峰的峰高作為縱坐標(biāo)（y，nC），繪制單糖的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在優(yōu)化的分離條件下，甘露糖和木糖無法分離，因相同濃度的甘露糖和木糖其色譜峰高比約為1∶1［14］，故將二者作為一個(gè)單峰，將兩種單糖等比例配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（每種糖濃度為0.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg·L-1），以單種糖的濃度對應(yīng)甘露糖和木糖合并色譜峰峰高繪制工作曲線。

在優(yōu)化的分離條件下測定各單糖的工作曲線溶液，繪制其工作曲線回歸方程，見表2。采用對標(biāo)準(zhǔn)樣品連續(xù)5次進(jìn)樣分析考察精密度，單糖各峰保留時(shí)間差別在0.20 min以內(nèi)，峰高相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.46%～1.63%之間，方法重復(fù)性較好。

表2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的離子色譜工作曲線、相關(guān)系數(shù)

2.5 土壤樣品分析

在優(yōu)化后的分離條件下，即流動(dòng)相濃度為12.5 mmol·L-1、柱溫為 30℃、流速為 0.20 mL·min-1的條件下進(jìn)樣分析，檢測得到的土壤樣品水解液的離子色譜圖見圖4，單糖標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖5。結(jié)果表明，土壤樣品中含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖、果糖，圖中各峰分離情況較好，滿足定量要求。土壤樣品水解液中單糖的相對含量參見表3。

圖4 土壤樣品的離子色譜圖

圖5 7種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖

由表3可知，土壤樣品中含有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖、果糖，其中半乳糖和葡萄糖含量較高，其次是阿拉伯糖、甘露糖和木糖，鼠李糖和果糖含量相對較低。

2.6 回收試驗(yàn)

選擇3個(gè)土壤樣品對其進(jìn)行單糖的回收試驗(yàn)，因甘露糖和木糖無法分開，故該兩種單糖采用合并的方法計(jì)算。從表4可知，土壤樣品中各單糖的加標(biāo)回收率在97.8%～115.1%之間。

表3 土壤樣品中單糖的相對含量

表4 土壤樣品中單糖的回收率

3 結(jié)論

本研究建立了基于積分安培離子色譜法同時(shí)測定土壤中單糖含量的分析方法，分別考察了不同流動(dòng)相、柱溫、流速因素對單糖的分離效果。利用優(yōu)化后的色譜條件檢測土壤樣品水解液中的單糖，因甘露糖和木糖色譜峰保留時(shí)間一致，故采用合并計(jì)算，其余5種單糖均能很好分離，方法耗時(shí)較短，30 min內(nèi)即實(shí)現(xiàn)多種單糖的分離。該方法簡單快捷，可廣泛應(yīng)用于土壤樣品中單糖組成分析。