柳曉磊,齊 釗,閆 臻,徐 敏,陳劍山,張曼麗,駱 娟,熊 睿,程 玉,李 陽,何文婭,李 鵬,湯 華*
(1.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院,熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室,海南 ???570228;2.海南省植物保護總站,海南 海口 571100)
良好的土壤環(huán)境是作物生長的重要前提。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,不僅是生態(tài)系統(tǒng)的分解者,也是物質(zhì)循環(huán)與能量流動的承擔(dān)者[1]。它們參與土壤有機質(zhì)的分解,腐殖質(zhì)的合成,土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化與循環(huán)而促使土壤肥力增加[2]。土壤微生物多樣性代表著微生物群落的穩(wěn)定性,也可反映土壤的生態(tài)機制和土壤脅迫對微生物群落的影響[3]。微生物群落多樣性與土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能密切相關(guān),在維持土壤肥力和土壤生態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用[4]。
近20年來,中國農(nóng)業(yè)的肥料投入量過大(主要以復(fù)合肥為主),施肥不合理,造成農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境問題及土壤問題日益嚴(yán)重。目前,影響耕地土壤的障礙因素包括有機質(zhì)含量低、微量元素缺乏、土壤肥力差,供肥能力弱、土壤酸化、土壤生物活性下降、養(yǎng)分利用率低、根結(jié)線蟲危害及土傳病害等[5]。隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展和社會對環(huán)境保護的日益重視,探索新型肥料(尤其是生物菌肥)彌補和改善傳統(tǒng)肥料不足的研究倍受關(guān)注[6]。復(fù)合微生物菌劑含有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等大量的有益活菌物質(zhì)及多種天然發(fā)酵活性物質(zhì),能在根部土壤繁殖形成有利于作物生長的微生物優(yōu)勢菌群,調(diào)節(jié)根部的營養(yǎng)環(huán)境,恢復(fù)土壤微生態(tài)平衡,而且在其生命活動過程中還能產(chǎn)生各類植物生長激素,刺激植物生長。氨基酸水溶肥易于被作物吸收,也能為枯草芽孢桿菌等提供營養(yǎng)物質(zhì),有利于土壤微生物菌擴繁[7]。土壤中需要植物所必需的各種元素才能使植物發(fā)育良好,氨基酸水溶肥中含有的微量元素Mn、Zn、B、Fe等,均為植物所需的必需微量元素,能夠改善土壤營養(yǎng)狀況,保證植物對養(yǎng)分的需求,是植物健康生長的又一保障。土壤微生物通過微生物-土壤-植物模式影響植物的生長和發(fā)育[8]。復(fù)合微生物菌劑與氨基酸水溶肥組合施用在豇豆上,可以改善土壤理化性質(zhì),提高土壤肥力,對豇豆的枯萎病及根系線蟲都有明顯的抑制作用[7,9]。
香蕉枯萎病是典型的土傳病害,一旦感染,對香蕉園是毀滅性的。根結(jié)線蟲是一類在植物上危害極為嚴(yán)重的寄生線蟲[10-11],其種類繁多,分布較廣,致病性強,已引起世界各國的關(guān)注[12-14]。根結(jié)線蟲在香蕉根部造成大量傷口,為枯萎病菌的入侵提供途徑,促進(jìn)了病害發(fā)生。組合施用復(fù)合微生物菌劑和氨基酸水溶肥,是否有利于防控香蕉枯萎病及根結(jié)線蟲,未見相關(guān)報道。本研究通過香蕉大田試驗,開展混合施用復(fù)合微生物菌劑與氨基酸水溶肥的試驗,研究土壤理化性質(zhì)及土壤微生物菌群的變化情況,為香蕉枯萎病的防控提供新的思路。
試驗于2016年在海南省東方市紅泉農(nóng)場一隊的香蕉種植示范區(qū)進(jìn)行,試驗香蕉品種為“南天黃”,第一造蕉種植面積14 hm2,試驗地為紅土坡地,坡度≤15℃,肥力中等,排灌設(shè)施良好,為滴灌。供試復(fù)合微生物菌劑的有效成分:枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌+解淀粉芽孢桿菌約2億/mL,氨基酸水溶肥的有效成分:氨基酸=100 g/L,Mn+Zn+B+Fe=30 g/L。
本次大田試驗共設(shè)2組處理,10 hm2地平均分成3部分并混合施用復(fù)合微生物菌劑與氨基酸水溶肥,為處理組(BE),處理組在香蕉的苗期、中期、孕蕾期3個階段分別灌溉一次復(fù)合微生物菌劑(15 kg/hm2)和氨基酸水溶肥(15 kg/hm2);另外4 hm2為對照組(BC),同期處理時滴灌清水;其它的水肥管理和病蟲害防控相同。在第3次處理結(jié)束后30 d,對兩組處理分別采用5點取樣法取樣,選取5~15 cm土樣混合,每個處理設(shè)置3個重復(fù)。
土壤堿解氮的測定采用堿解蒸餾法,有效磷的測定參照NY/T 1121.7-2014,速效鉀的測定參照NY/T 889-2004,有機質(zhì)的測定參照 NY/T 1121.6-2006,pH值的測定參照NY/T 1121.6-2016。線蟲的檢測采用改良貝曼漏斗法分離24 h,用體視顯微鏡和生物顯微鏡對分離出的根結(jié)線蟲進(jìn)行數(shù)量檢測,每個樣品均測定3次。
土壤微生物的DNA提取采用Genebank土壤微生物DNA提取試劑盒,取質(zhì)量合格的DNA樣品,采用Illumina Miseq 測序平臺進(jìn)行高通量測序。
使用 FLASH v1.2.7軟件進(jìn)行序列的拼接,然后使用 Trimmomatic v0.33 軟件,對拼接得到的 Raw Tags進(jìn)行過濾,最后使用 UCHIME v4.2軟件,鑒定并去除嵌合體序列,得到有效數(shù)據(jù)。采用Excel 2016和 SPSS 21 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。
混合施用復(fù)合微生物菌劑與氨基酸水溶肥的為處理組(BE);滴灌清水的為對照組(BC)。對試驗地土壤的堿解氮(Alk-hydr. N)、有效磷(AP,available phosphorus)、速效鉀(AK,available potassium)、有機質(zhì)(OM,organic matter)、pH 值以及根結(jié)線蟲(RN,root-knot nematode)的檢測表明(表1):相比于對照組,BE組土壤pH值沒有明顯變化;BE組有機質(zhì)含量比BC組增加了80.34%;BE組土壤中堿解氮的含量顯著上升(P<0.05),有效磷和速效鉀的含量極顯著上升(P<0.01)。根結(jié)線蟲的數(shù)量顯著下降(P<0.05)??梢姡⑸锞鷦┖桶被崴芊实穆?lián)合使用對提高土壤中氮磷鉀的含量影響顯著,從而改善了土壤的營養(yǎng)情況。植物在微量元素充足的情況下,生理機能就會十分旺盛,因此氨基酸水溶肥中含有的微量元素,有利于香蕉對大量元素的吸收和利用。復(fù)合微生物菌劑與氨基酸水溶肥組合施用對土壤中根結(jié)線蟲的繁殖具有抑制作用,根結(jié)線蟲數(shù)量的減少對抑制香蕉枯萎病的發(fā)生具有積極意義。
在土壤微生物的高通量測序中,真菌和細(xì)菌的覆蓋率可以反映土壤微生物的狀況和測序數(shù)據(jù)可靠性。稀釋曲線可以作為對各樣本測序量是否充分的判斷,曲線急劇上升表明測序量不足,需要增加序列條數(shù);反之,則表明樣品序列充分,可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究的細(xì)菌稀釋曲線和真菌稀釋曲線都基本趨于平緩,說明測序量充足,覆蓋率高。
表1 不同處理下土壤的理化性質(zhì)及線蟲數(shù)量變化
香蕉土壤微生物測序結(jié)果表明,細(xì)菌和真菌分別獲得有效序列573 433和488 444條。細(xì)菌獲得的分類單元OTU數(shù)是1 375個,真菌獲得OTU數(shù)是668個(表2)。真菌和細(xì)菌的覆蓋率都達(dá)到了99%以上,說明土壤中微生物的菌群結(jié)構(gòu)和種類很穩(wěn)定。從豐富度指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)可以看出,香蕉土壤中細(xì)菌的種類和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌,進(jìn)一步證明細(xì)菌是土壤微生物的主體部分,與其他相關(guān)報道結(jié)果一致[1,3]。
表2 香蕉土壤微生物OTUs多樣性分析
土壤細(xì)菌測序結(jié)果中,每個測序樣品所得到的序列數(shù)約為79 916~ 80 223條,OTU數(shù)目在1 083~1 275條之間。如圖1(左)所示,處理組BE和對照組BC之間在OTU的數(shù)量和種類上都存在差異。兩組共有的OTU數(shù)為1 353個,BE特有的OTU數(shù)為18個,而BC特有的OTU數(shù)僅4個。
土壤真菌測序結(jié)果中,每個測序樣品所得到的序列數(shù)約為79 881~ 80 152條,OTU數(shù)目在299~437條之間。如圖1(右)所示,處理組BE和對照組BC之間在OTU的數(shù)量和種類上都存在差異。兩組共有的OTU數(shù)為342個,BE特有的OTU數(shù)為51個,而BC特有的OTU數(shù)為42個。
圖1 香蕉土壤細(xì)菌和真菌的OTU-Venn圖
Ace和Chao1指數(shù)都是衡量物種豐度的指標(biāo),其值越高,物種的豐富度越高。如表3所示,香蕉地土壤細(xì)菌測序結(jié)果中,BC組的Ace和Chao1均高于BE組,說明BC組細(xì)菌菌群的物種豐富度高于BE組;真菌測序結(jié)果中,BC組的Ace和Chao1均低于BE組,說明了BE組真菌菌群的物種豐富度高于BC組。綜上所述,不同處理下的香蕉地土壤細(xì)菌和真菌的物種豐富度均發(fā)生了變化,施肥后土壤細(xì)菌菌群豐富度降低的同時真菌菌群豐富度增加。
表3 香蕉土壤微生物的多樣性分析
相同物種豐度的情況下,群落中各物種具有越大的均勻度,則認(rèn)為群落具有越大的多樣性,即香農(nóng)指數(shù)(Shannon)值越大,辛普森指數(shù)(Simpson)值越小,說明樣品的物種多樣性越高。如表3所示,細(xì)菌測序結(jié)果中,BE組的Shannon高于BC組,Simpson低于BC組,說明了BE組的物種多樣性高于BC組,這與真菌測序結(jié)果中Shannon與Simpson的指數(shù)對比情況相同。綜上所述,不同處理下的香蕉地土壤細(xì)菌和真菌的物種多樣性的變化規(guī)律保持一致,相較于BC組,BE組的物種多樣性增加。
土壤的細(xì)菌測序,獲得573 433條序列,隸屬于23門59綱79目130科148屬。在門水平上(圖2),對照組BC中,相對豐度≥1%的菌門包括Proteobacteria(變形菌門)41.62%和Acidobacteria(酸桿菌門)25.85%,兩者占比最高,是土壤中的優(yōu)勢菌種;其他分別為Actinobacteria(放線菌門)10.88%、Chloroflexi(綠彎菌門)8.12%、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)3.51%、Firmicutes(厚壁菌門)2.99%、Verrucomicrobia(疣微菌門)2.58%。而在處理組BE中,相對豐度≥1%的優(yōu)勢菌門仍然是Proteobacteria(變形菌門)42.65%和Acidobacteria(酸桿菌門)23.86%,其他菌門與對照組BC大致相同。
圖2 香蕉土壤細(xì)菌門水平物種分布柱狀圖
在綱水平上(表4),BC組相對豐度≥2%的有Alphaproteobacteria(α-變形桿菌綱)25.63%、Acidobacteria(酸桿菌綱)17.36%、Betaproteobacteria(β-變形菌綱)8.91%、Thermoleophilia(嗜熱油菌綱)6.68%、Gammaproteobacteria(丙型變形菌綱)5.14%、JG37-AG-4(分類未定)4.58%、Gemmatimonadetes(芽單胞菌綱)3.51%、Solibacteres(擬桿菌綱)3.71%、Clostridia(梭狀芽胞桿菌綱)2.94%、Subgroup_2(分類未定)2.91%。BE組相對豐度≥2%的菌群種類與BC組沒有明顯差異,但在相對豐度上則存在較大差異:Acidobacteria(酸桿菌綱)相對豐度下降了13.47%;Betaproteobacteria(β-變形菌綱)下降了19.30%,Gammaproteobacteria(丙型變形菌綱)下降了45.52%;Gemmatimonadetes(芽單胞菌綱)增長了33.05%;Clostridia(梭狀芽胞桿菌綱)則增長了11.90%。其中,BC和BE組中Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Clostridia的相對豐度存在顯著性差異。
表4 綱和目水平細(xì)菌菌群組成及其相對豐度 (%)
在目水平上(表4),BC組相對豐度≥2%的前10位中,Acidobacteriales(酸桿菌目)17.36%、Rhodospirillales(紅螺菌目)11.92%、Bacterium(桿菌目)11.4%是優(yōu)勢菌目;BE組相對豐度≥2%的前10位菌群與BC組相比,Sphingomonadales(鞘脂單胞菌目)相對豐度增長了34.3%;Rhizobiales(根瘤菌目)增長了12.23%;Xanthomonadales(黃單胞菌目)增長了52.61%;Gemmatimonadales(芽單胞菌目)增長了33.05%;Acidobacteriales(酸桿菌目)、Rhodospirillales(紅螺菌目)、Burkholderiales(伯克霍爾德氏菌目)則分別下降了13.48%、16.02%和30.15%。其中BC組與BE組中的Acidobacteriales、Bacterium、Sphingomonadales、Gemmatimonadales的相對豐度呈顯著性差異。
BC組真菌菌群隸屬11門20綱44目66科106屬。在門水平上(圖3),對照組BC的土壤真菌主要有Ascomycota(子囊菌門)33.11%、Basidiomycota(擔(dān)子菌門)6.64%、Rotifera 0.99%,還有豐度極少的 Mortierellomycota 0.15%、Glomeromycota(球囊菌門)0.19%、Mucoromycota(毛霉亞門)0.09%、Cercozoa(蟲門)0.03%、Neocallimastigomycota(新麗鞭毛菌門)0.03%、Kickxellomycota(梳霉亞門)0.01%、57.04%的未知真菌和1.71%未能分類真菌。處理組BE的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)在門水平上出現(xiàn)了明顯的變化,主要包括Ascomycota(子囊菌門)占38.51%,明顯上升,Basidiomycota(擔(dān)子菌門)占2.19%,明顯下降。
圖3 香蕉土壤真菌門水平物種分布柱狀圖
在綱水平上(表5),BC組占優(yōu)勢的是子囊菌門的Sordariomycetes(子囊菌綱)23.76%和Eurotiomycetes(散囊菌綱)4.21%,以及擔(dān)子菌門的Agaricomycetes(傘菌綱)5.80%。相較于BC組,BE組占優(yōu)勢的是子囊菌門的Sordariomycetes(子囊菌綱),物種豐度增加了15.32%,Dothideomycetes(座囊菌綱)升高了58.20%,而擔(dān)子菌門的Agaricomycetes(傘菌綱)物種豐度降低了75%。但BC組和BE組的優(yōu)勢菌綱豐度并沒有顯著差異。
表5 香蕉土壤綱和目水平真菌菌群組成及其相對豐度 (%)
在目水平上(表5),BC組豐富度≥1%的前5菌目有子囊菌門的Eurotiales(散囊菌目)2.21%和Chaetothyriales(刺盾炱目)1.99%、Hypocreales(肉座菌目)5.06%、Sordariales(糞殼菌目)1.12%、Hypocreomycetidae_ord_Incertae_sedis 2.11%。BC 組中85.18%都是目前尚不知曉的屬,物種豐度≥1%的菌群不多,主要包括Boothiomyces 1.45%、Colletotrichum(炭疽菌屬)1.93%、Penicillium(青霉菌屬)1.13%。BE組相對豐度≥1%前5的優(yōu)勢菌目有Eurotiales(散囊菌目)7.12%、Hypocreales(肉座菌目)4.18%、Chaetothyriales(刺盾炱目)1.28%、Sordariales(糞殼菌目)1.99%、Pleosporales(腔菌目)1.65%。其中BC組和BE組中Eurotiales、Hypocreomycetidae_ord_Incertae_sedis的相對豐度存在顯著性差異。
香蕉枯萎病的病原菌為古巴尖鐮孢菌4號小種[15](Fuaarium oxysporum f. sp. cubense Race 4),本次檢驗中,對照組和處理組土壤中并沒有檢測到含有此類病原菌,土壤狀況良好,有利于香蕉的生長。測序結(jié)果分類顯示,83.22%都是目前尚不知曉的屬,其中Penicillium(青霉菌屬)為5.66%,相較于BC組上升了400.88%,呈顯著性差異;Colletotrichum(炭疽菌屬)為0.03%,相較于BC組下降了98.45%,呈顯著性差異。
土壤環(huán)境因子5個,分別為AN(堿解氮)、AP(有效磷)、AK(速效鉀)、OM(有機質(zhì))和RN(根結(jié)線蟲)。RDA相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),處理組與對照組樣品分別分布在坐標(biāo)圖的兩側(cè),微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差異,AK、AN、AP與處理組呈正相關(guān),而RN則與對照組呈正相關(guān)。圖4左為細(xì)菌群落-土壤環(huán)境因子,其軸1特征值為64.15%,軸2特征值為17.14%,基本覆蓋了土壤的環(huán)境信息。其中,AP對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響最大,Rhodanobacter與AP呈正相關(guān),Bradyrhizobium、Variibacter、Acidibacter、Burkholderia-Paraburkholderia 與AP呈負(fù)相關(guān)。AK和AN對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大;OM和RN對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也具有一定影響。Sphingomonas對芳香化合物具有生物降解作用,具有高的代謝能力,存在于營養(yǎng)豐富的土壤中,與AK、AN、AP、OM呈正相關(guān)。
圖4 香蕉土壤細(xì)菌群落-土壤環(huán)境因子(左)與真菌群落-土壤環(huán)境因子(右)相關(guān)性分析
圖4 右是真菌群落-土壤環(huán)境因子,其軸1特征值為51.34%,軸2特征值為18.66%,基本上覆蓋了大部分的土壤環(huán)境信息。其中,AP、AK、AN對真菌群落結(jié)構(gòu)影響最大。Penicillium與三者呈正相關(guān),Talaromyces、Boothiomyces、Colletotrichum與三者呈負(fù)相關(guān)。OM和RN對真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大。Penicillium與OM呈 正 相 關(guān),Talaromyces與OM呈負(fù)相關(guān);Talaromyces、Boothiomyces、Colletotrichum與RN呈正相關(guān),Penicillium與RN呈負(fù)相關(guān)。由相關(guān)性可知,RN與AK、AN、AP、OM之間對真菌的影響恰恰相反,說明通過調(diào)節(jié)真菌菌群結(jié)構(gòu)能夠有效降低土壤線蟲含量。
氨基酸水溶肥和微生物菌劑的聯(lián)合使用,有效改善了香蕉土壤的理化性質(zhì),降低了根結(jié)線蟲的數(shù)量,香蕉土壤中微生物的菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化,通過調(diào)節(jié)土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)來改善土壤性質(zhì),減少根結(jié)線蟲的含量。
本研究表明,香蕉土壤中細(xì)菌的種類和豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌,細(xì)菌是土壤微生物組成的主要成員。在兩個不同處理間(圖2),在門水平上細(xì)菌占主要優(yōu)勢的是Proteobacteria、Acidobacteria和Actinobacteria,其中Proteobacteria是土壤中最廣泛的優(yōu)勢菌門,該結(jié)果和國內(nèi)外很多土壤多樣性的研究結(jié)果相一致[16-20]。
也有研究發(fā)現(xiàn)Acidobacteria是土壤細(xì)菌群落中豐度最高的優(yōu)勢類群[6,21],Acidobacteria多存在于營養(yǎng)貧瘠的土壤環(huán)境中[21-22]。根際土壤較非根際土壤 pH 值低(分泌有機酸),有利于酸桿菌某些亞群細(xì)菌的生長,但根際的高營養(yǎng)環(huán)境又不利于酸桿菌細(xì)菌的定殖和繁殖[23]。在本研究中,Acidobacteria是第二大優(yōu)勢菌門,在處理組BE的土壤中,從門、綱、目水平上,Acidobacteria的物種豐度顯著性降低,這可能是由于氮、磷、鉀等營養(yǎng)環(huán)境改善引起的。
Proteobacteria中的Alphaproteobacteria中包括一些有益菌目,比如根瘤菌目,根瘤菌能夠促進(jìn)植物固氮;而β-變形菌綱和丙型變形菌綱中則包括了多數(shù)重要的病原菌,尤其是Betaproteobacteria中的伯克霍爾德氏菌目。處理組的土壤中,可能是有害的Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的物種豐度都有明顯降低,Alphaproteobacteria的物種豐度則基本不變,但根瘤菌目的物種豐度增長了12.23%,Burkholderiales則下降了13.48%。
在本研究中,香蕉土壤中真菌的優(yōu)勢菌門是Ascomycota和Basidiomycota(圖3),其中,Ascomycota的豐度最高,且遠(yuǎn)高于第二位的Basidiomycota。子囊菌門的真菌多為腐生菌,對降解土壤有機質(zhì)起著重要作用[24]。在處理組中,子囊菌門的子囊菌綱、座囊菌綱的物種豐度都有較大升高,對提高微生物分解有機質(zhì)的能力具有促進(jìn)作用。有研究表明,Colletotrichu中大部分為致病菌,可引起炭疽病[25],Penicillium真菌能產(chǎn)生許多具有抗菌、抗腫瘤和抗病毒功能的活性次生代謝產(chǎn)物,分泌多種高活性的水解酶類,降解多種單環(huán)和多環(huán)芳香類環(huán)境污染物[26]。在處理組中Colletotrichu物種豐度明顯下降,而抗菌能力強的Penicillium則顯著提高,說明復(fù)合微生物菌劑和氨基酸水溶肥的組合施用,提高了有益菌群的豐度,降低了有害菌群豐度。
通過組合施用復(fù)合微生物菌劑與氨基酸水溶肥,有效地改善了土壤的營養(yǎng)成分,土壤有效磷、速效鉀和堿解氮顯著增加,土壤根結(jié)線蟲數(shù)量呈顯著下降。土壤微生物高通量測序結(jié)果表明:土壤菌群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定,土壤有害細(xì)菌豐度明顯下降,有益細(xì)菌豐度都明顯升高;土壤真菌方面,炭疽菌屬含量降低,青霉菌屬的豐度有所升高。可見,采用復(fù)合微生物菌劑和氨基酸水溶肥組合處理,對香蕉土壤理化性狀和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有明顯的改良和改善作用,有利于香蕉枯萎病的防治。