場流分離及其在環(huán)境納米粒子分析中的應(yīng)用

彭詩琪， 陳貝貝， 何 蔓， 胡 斌

(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點實驗室，湖北武漢 430072)

1 引言

場流分離法(Field Flow Fractionation，F(xiàn)FF)是由Giddings[1]在1966年提出的一種類似于色譜的分離技術(shù)。依據(jù)物質(zhì)的分子量、電荷、密度或尺寸的不同，該技術(shù)可用于大分子、膠體、納米顆粒、微米顆粒的分離；它也被用于分子量、密度、水合粒徑、電荷、普通擴散系數(shù)、熱擴散系數(shù)、水動升力甚至是膠質(zhì)的表面組成等物理特性的分析。FFF能對1 nm～100 μm(1 kDa～100 MDa)范圍內(nèi)的物質(zhì)進行高分辨的連續(xù)尺寸分離[2]，在生物、醫(yī)藥、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用不斷增多，已被用于蛋白質(zhì)[3]、磷脂[4]、病毒[5]、細(xì)菌[6]、納米粒子[7]、聚合物[8]等的分離。

與傳統(tǒng)的顆粒分離技術(shù)如超濾、離心、過濾等相比，F(xiàn)FF具有高分辨率、對樣品顆粒擾動小等優(yōu)點，可以對顆粒物進行連續(xù)分離。將尺寸排阻色譜法(SEC)[9]或水動力色譜法(HDC)[10]用于顆粒物的分析時，由于固定相與樣品顆粒之間存在剪切力作用[11]，會導(dǎo)致樣品的形貌發(fā)生改變，粒徑分布(PSD)分析不夠準(zhǔn)確，尺寸依賴的回收率降低；而FFF沒有固定相，分離條件溫和，適合于分析易損壞或變形的樣品，如蛋白質(zhì)聚合物、超分子組裝體、細(xì)胞等。分離高分子量的物質(zhì)時，SEC由于孔徑排阻的作用，無法將其分開；而FFF對高分子量的物質(zhì)(>10 MDa)具有更高的選擇性和分辨率。與透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)、動態(tài)光散射(DLS)、多角度光散射(MALS)等表征手段相比，F(xiàn)FF具有獨特的優(yōu)勢[11]：TEM和SEM表征前需對樣品進行脫水干燥處理，表征過程在高真空干燥環(huán)境下進行，可能導(dǎo)致樣品顆粒聚集，難以反映樣品的原始狀態(tài)；電鏡表征結(jié)果局限于有限的區(qū)域內(nèi)，不能給出全部樣品的尺寸分布信息；DLS不適合多分散性、基質(zhì)復(fù)雜不均勻的樣品或低濃度樣品的分析[12]；FFF則具有較寬的分離范圍，能與UV、MALS、MS等儀器聯(lián)用實現(xiàn)制備級的分離。

2 場流分離法的分類

根據(jù)施加場種類的不同，F(xiàn)FF可分為以下幾類[1]：熱場流分離法(Thermal Field Flow Fractionation,ThFFF)、電場流分離法(Electrical Field Flow Fractionation,ElFFF)、沉降場流分離法(Sedimentation Field Flow Fractionation,SdFFF)、流場流分離法(Flow Field Flow Fractionation,FlFFF)。其中，F(xiàn)lFFF又可以分為對稱流場流分離法(Symmetric Flow Field Flow Fractionation,SFFFF或 F4)、非對稱流場流分離法(Asymmetric Flow Field Flow Fractionation,AsFFFF或AF4)和中空纖維流場流分離法(Hollow-Fiber Flow Field Flow Fractionation,HF5)。其中，應(yīng)用最廣泛的是FlFFF、SdFFF和ThFFF[13]。

2.1 熱場流分離法(ThFFF)

ThFFF應(yīng)用的場是上下壁面溫差形成的溫度梯度[1]。分離通道兩側(cè)是兩個可以單獨控溫的導(dǎo)熱塊，呈三明治形狀。在分離通道上端加熱使上端溫度升高，下端則采用循環(huán)水或冷卻劑使溫度降低。上下兩壁面的溫差約100 K，通道厚度約0.01 cm，溫度梯度約104K/cm。這一溫度梯度趨使待分離的物質(zhì)向低溫壁面聚集，即熱擴散作用。在熱擴散作用和自身擴散作用下，樣品達到平衡位置。擴散系數(shù)與樣品的粒徑有關(guān)，熱擴散系數(shù)與物質(zhì)的化學(xué)組成和尺寸有關(guān)。ThFFF是一種適合于聚合物摩爾質(zhì)量、熱擴散系數(shù)的測定和化學(xué)組成分析的技術(shù)[14]。對于均聚物來說，低分子量的聚合物由于具有更高的擴散系數(shù)，更易平衡在拋物線型流體的流速較高的層面，越快被洗脫。對于共聚物來說，由于熱擴散系數(shù)與聚合物和溶劑間的相互作用有關(guān)，可依據(jù)化學(xué)組成的不同而進行分離。ThFFF主要用于有機溶劑中合成聚合物的分離，較少用于納米粒子的分離分析[15]。

2.2 電場流分離法(ElFFF)

ElFFF應(yīng)用的場是垂直于流動方向上的電場，依據(jù)物質(zhì)的電泳淌度和尺寸大小(或擴散作用)比例的不同而實現(xiàn)分離。在電場作用下，當(dāng)物質(zhì)的電泳淌度和其擴散作用達到平衡時，不同微粒將處于距積聚面不同距離的位置，因流速不同而分開。選擇更小的電場(電壓為0～2 V)或微米級別的分離通道能有效減少樣品損失。但是，在ElFFF中存在著雙電層效應(yīng)，使得系統(tǒng)的有效電場強度損失巨大。此外，電極在水相的流動相中易被極化，樣品與流動相電導(dǎo)率的不同會影響組分的保留性質(zhì)。ElFFF最初常用于蛋白質(zhì)的分離，目前已被用于納米粒子的分離。Somchue等[16]將ElFFF成功用于納米粒子的表征，但在電壓較高時，存在著對銀納米粒子(Ag NPs)的吸附作用。Gigault等[17]采用循環(huán)電場流分離法(CyElFFF)分離納米粒子。在CyElFFF中，電場方向周期性反轉(zhuǎn)，每一次反轉(zhuǎn)樣品顆粒便會重新建立一個新的平衡分布。與傳統(tǒng)的ElFFF相比，CyElFFF具有更有效的電場。因為隨著頻率的增加，交流電場使與平行板電極有關(guān)的大電容短路。此外，在傳統(tǒng)的ElFFF中，電壓過高(>1.7 V)會誘導(dǎo)水電解，產(chǎn)生氣泡。而CyElFFF中，由于頻率增高會減少來自氣泡的擾動，故采用的電壓可高達8 VPP(volts peak to-peak)。采用CyElFFF 分離粒徑小于100 nm的顆粒時，由于物質(zhì)擴散速率非?？?，導(dǎo)致分離效率急劇降低。Tasci等[18]通過選擇合適的電壓波形，抑制了微粒擴散作用造成的不利影響，成功地將CyElFFF用于水合粒徑均為50 nm、不同涂層磁性納米粒子的分離。之后，Tasci等[19]又通過選擇離散的電器元件如電阻、二極管等，對ElFFF的電路系統(tǒng)進行改造，實現(xiàn)了對15 nm和40 nm Au NPs的高分辨率分離。Tasci等[20]采用偏循環(huán)電場流分離法(BCyElFFF)對不同粒徑Au NPs進行分離，通過采用超過50%的工作周期來實現(xiàn)電壓波形的偏差，使電壓的正循環(huán)具有比負(fù)循環(huán)更長的持續(xù)時間，拓展了CyElFFF在分離小于50 nm的顆粒物中的應(yīng)用。

2.3 沉降場分離法(SdFFF)

SdFFF的外加場可以是重力(重力場流分離)，也可以是離心力(離心場流分離)。在離心場流分離中，分離通道圍繞著一個旋轉(zhuǎn)的離心轉(zhuǎn)筒，該離心轉(zhuǎn)筒可以使不同粒徑的粒子獲得不同的加速度。當(dāng)樣品組分的密度大于周圍流動相密度時，樣品顆粒會向外側(cè)壁面移動，反之向內(nèi)側(cè)壁面移動。水相流動相可以通過加入有機溶劑使其密度減小，也可以通過加入鹽或糖類物質(zhì)使其密度增大，以此改變樣品與流動相之間的密度差。SdFFF是根據(jù)物質(zhì)的等效球體直徑和密度進行分離的技術(shù)。與其他FFF技術(shù)相比，雖然SdFFF 的分離下限較高，但該技術(shù)具有非常高的選擇性，可用于微米范圍內(nèi)物質(zhì)的分離。從選擇性、保留機理、分離范圍的角度來看，SdFFF是對其他FFF(尤其是FlFFF)的補充。Deering等[21]先用酶消化小鼠的肺和肝臟組織，離心后采用SdFFF得到了組織中未標(biāo)記的SiO2NPs的尺寸分布，實現(xiàn)了組織中納米和微米級顆粒物的分離。Soto-Alvaredo等[22]將SdFFF與電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜(ICP-MS/MS)聯(lián)用，用于21 nm和50 nm的TiO2的分離和檢測，并成功用于湖水的分析中，檢出限為10 ng/L(Ti)。Contado 等[23]先根據(jù)光學(xué)吸收光譜(OAS)中表面等離子體共振波長(SPRMAX)得到Ag NPs的粒徑，然后將SdFFF與OAS聯(lián)用以得到Ag NPs 的粒徑分布信息，將這兩種方法對比，突出了SdFFF的優(yōu)勢。此外，SdFFF也可以作為一種測量技術(shù)，Tadjiki等[24]將SdFFF和SP-ICP-MS聯(lián)用，根據(jù)SdFFF中保留時間計算出Ag NPs的質(zhì)量，結(jié)合由TEM結(jié)果得到的Ag NPs的尺寸信息，最終可計算得到Ag NPs的密度；計算結(jié)果與由SP-ICP-MS得到的結(jié)果吻合良好。該方法可用于密度分布范圍較寬(1 050～19 300 kg·m-3)的納米粒子的測定，以及均質(zhì)材料和復(fù)合納米結(jié)構(gòu)、多分散樣品的測定。

2.4 流場流分離法(FlFFF)

FlFFF的外加場為垂直于流動方向的橫向流體。理論計算證明，典型的FlFFF橫向流速不會干擾拋物線型的縱向流體。ThFFF和SdFFF的分離通道是由堅固的金屬材料構(gòu)成，而FlFFF的分離通道是膜材料，需要定期更換。由于樣品組分會在膜表面附近聚集，故膜材料會與樣品組分發(fā)生吸引或排斥作用，導(dǎo)致測到的粒徑分布信息不夠準(zhǔn)確，故膜材料的選擇十分重要[25]。若膜的孔結(jié)構(gòu)不太均勻，也會影響分離性能。理論上FlFFF適用于所有的分析物，實際上分離的尺寸下限是由膜的孔徑大小決定的，這不僅決定了通道內(nèi)可保留的分析物類別，也決定了能選擇的最高橫向流速。與SdFFF相比，F(xiàn)lFFF的分離下限低，可以在聚焦過程中移除樣品中的一些離子或小分子。與液相色譜法相比，F(xiàn)lFFF在樣品遷移過程中的稀釋倍數(shù)較高，限制了檢測的靈敏度；與SEC相比，F(xiàn)lFFF無法有效分離粒徑小于5 nm的顆粒[26]。由于FlFFF具有可選擇的流動相種類多、操作簡單等優(yōu)點，與其他模式的FFF技術(shù)相比，目前在環(huán)境納米粒子的分析中FlFFF的應(yīng)用最多。

3 FlFFF的基本原理及其在納米粒子分析中的應(yīng)用

3.1 FlFFF的基本操作模式

根據(jù)試樣的相對分子質(zhì)量或顆粒物的直徑范圍不同，F(xiàn)lFFF的分離模式可分為常規(guī)模式、空間模式/超多層模式[1]。

在常規(guī)模式中，樣品進入分離通道后將受到場的作用和與場方向相反的分子擴散作用，最終使得樣品顆粒形成指數(shù)變化的濃度分布。不同樣品顆粒在分離通道中所達到的平衡位置只和自身的擴散系數(shù)有關(guān)，小顆粒的擴散系數(shù)較大，靠近分離通道的中間位置，速度較快，會先于大顆粒而被洗脫出來。該模式下分離的顆粒粒徑一般小于1 μm。

當(dāng)樣品顆粒的粒徑超過1 μm時，其布朗運動可以忽略不計。理想的空間模式是顆粒在外場的作用下緊緊貼在積聚壁面，而它們沿分離通道的移動速度取決于顆粒物的粒徑。與小顆粒相比，大顆粒的最高點距離積聚壁更遠(yuǎn)，可達到更高的速度層面，優(yōu)先被洗脫。一般來說，在空間模式中樣品顆粒會受到水舉力的作用，使得顆粒物無法直接接觸積聚壁，而是在積聚壁上方一定距離處形成平衡帶，即超多層模式。大顆粒比小顆粒形成的平衡位置距離積聚壁較遠(yuǎn)，因此較大顆粒會先洗脫出。

分離模式發(fā)生改變的物質(zhì)臨界粒徑常常與許多因素有關(guān)，如通道厚度、流速、場強、微粒形狀等[27]。如橫向流速降低會導(dǎo)致臨界粒徑增大。兩種分離模式的結(jié)合使得FlFFF可應(yīng)用于1 nm～100 μm粒徑范圍內(nèi)的物質(zhì)的分離，但樣品的粒徑分布范圍過寬時，分離過程會受到影響，小粒徑粒子(以常規(guī)模式洗脫)和粒徑非常大的粒子(以空間模式洗脫)被同時洗脫出來，降低了FlFFF的選擇性。

3.2 FlFFF的分類

3.2.1對稱流場流分離法(F4) 在F4中，流道的上下壁均為溶劑可通過的多孔熔塊，積聚壁通常覆蓋有一層孔徑為1～10 kDa的超濾膜。分析物被橫向流體推向積聚壁，并被多孔熔塊隔離在積聚壁處。橫向流體使樣品中不同成分處于流道中的不同流速層面上，從而實現(xiàn)分離。橫向流體和縱向流體都由HPLC泵驅(qū)動，在大多數(shù)情況下橫向流體由一個雙活塞注射泵維持在一個閉合的回路中。采用雙活塞注射泵對橫向流體進行閉合流路循環(huán)輸送的優(yōu)點是更易維持穩(wěn)定的流體流速，流動相用量少。缺點是物質(zhì)會通過頂部的熔塊，穿過膜進入通道進行再循環(huán)，可能會造成檢測器的基線不穩(wěn)，對測量造成誤差[28]。

圖1 對稱流場流分離法操作流程[28]Fig.1 Operational process for symmetric flow field flow fractionation[28]

圖2 非對稱流場流分離法操作過程[14]Fig.2 Operational process for asymmetric flow field flow fractionation[4]

分離過程如圖1所示，樣品通過進樣閥進入分離系統(tǒng)。幾秒后，當(dāng)樣品到達通道內(nèi)幾厘米處，縱向流速調(diào)為零，橫向流速不變。在這個聚焦過程中，樣品在橫向流體的驅(qū)動和自身布朗運動作用下達到平衡。聚焦時間通常選擇為使體積流量為通道體積三倍的橫向流體流過通道所需的時間。聚焦結(jié)束后，重新開啟縱向流體，樣品沿著分離通道被洗脫至檢測器。

3.2.2非對稱流場流分離法(AF4) 在AF4中，流道的上壁面是透明的玻璃板，下壁面由多孔的熔塊和流動相可以透過的半透膜組成。與F4相比，AF4具有更高的分離效率和分析速度，對樣品的稀釋更少[2]，故AF4的應(yīng)用更為廣泛。流動相從入口處進入通道(Vin)后分為兩部分，透過積聚壁(Vc)流出和沿著通道從出口處流出(Vout)，滿足Vin=Vc+Vout的關(guān)系式。為了補償沿著分離通道方向流動相體積流量的減少，維持縱向流速不變，AF4的通道被設(shè)計為梯形，從通道入口到通道出口處，通道寬度不斷減少。

AF4操作過程如圖2所示，樣品被注射到通道后先經(jīng)過聚焦：在聚焦過程中，流動相從通道入口和聚焦口兩端流入，通過調(diào)整這兩個相對流動的流體流速，使樣品在聚焦區(qū)域內(nèi)聚焦，流速滿足關(guān)系式(1)。

Vinletflow+Vfocusflow-Vcrossflow=Vdetectorflow

(1)

洗脫過程中，流動相從通道入口進入，通過積聚壁流出和從通道出口流出，流速滿足關(guān)系式(2)，根據(jù)樣品具有不同的保留時間被洗脫進檢測器。

Vinletflow=Voutlet+Vcrossflow

(2)

3.2.3中空纖維流場流分離法(HF5) 作為最新的FlFFF的一種，HF5成本低廉、分析速度快、適用范圍廣，可提供連續(xù)的、高分辨的分離。HF5的分離原理與AF4類似，但HF5的分離腔室是由半透性的中空纖維膜構(gòu)成，并鑲嵌在一開放的玻璃或金屬管內(nèi)。HF5中橫向流體是呈放射狀施加的，而AF4中橫向流體是垂直于分離通道施加的。此外，HF5的通道體積小，對樣品的稀釋減少，樣品和流動相的消耗量少，有助于靈敏度的改善。HF5中流動相的流速較低，易于與后續(xù)檢測器聯(lián)用。中空纖維膜是一次性使用的，可以有效解決交叉污染和記憶效應(yīng)等問題[29]。

(1)HF5的基本原理 Stokes-Einstein方程：

(3)

(4)

(5)

(6)

其中，D是樣品的擴散系數(shù)，k是玻爾茲曼常數(shù)，T是絕對溫度，η是流動相的黏度，dh是樣品的水合粒徑，t0、tr分別是溶劑峰和樣品峰的保留時間。w是腔室的厚度，Vc是橫向流動的體積流量，而V0是管道的空隙體積。結(jié)合公式(3)和公式(6)得到

(7)

當(dāng)實驗條件確定后，根據(jù)式(7)可以由測量的保留時間得到dh值，也可以根據(jù)已知直徑的顆粒預(yù)測其保留時間，從而實現(xiàn)粒徑表征。

圖3 中空纖維流場流分離法分離過程Fig.3 Separation process in hollow-fiber flow field flow fractionation

(2)HF5的分離過程 HF5的分離過程分為兩步：聚焦過程和洗脫過程(圖3)。聚焦過程(A狀態(tài))中，一部分流動相從分離腔室入口流入，朝著出口流動。另一部分流動相從腔室出口進入，朝著入口流動。聚焦點的位置取決于入口流速Vin與出口流速Vout的比值，這由一個四通閥控制。在聚焦點，縱向流動的流動相流速為零。橫向流體驅(qū)使顆粒向中空纖維的內(nèi)壁面移動，同時流動相通過腔室壁面的小孔流出。在場的作用和顆粒自身布朗運動下，樣品達到穩(wěn)定狀態(tài)，即完成聚焦。聚焦完成后，進入洗脫模式(B狀態(tài))，切換三通閥位置，流路不經(jīng)過四通閥。流動相從分離通道入口進入，分為兩路，一路將樣品顆粒送至檢測器，一路從廢液出口流出。

(3)HF5的主要影響因素 HF5技術(shù)分離條件的優(yōu)化主要考慮以下操作條件的影響：聚焦時間、橫向流速、進樣量、流動相的種類和中空纖維膜的選擇等[30]。

中空纖維膜的材質(zhì)和孔徑大小對分離精度有著重要的影響，它決定了適用的樣品種類以及所分離樣品的最小尺寸。中空纖維膜壁必須要非常平滑，孔徑大小均勻，有已知的內(nèi)徑和明確的橫截面輪廓，才能確保不同批次的纖維膜間分離重現(xiàn)性良好。分析物的尺寸和化學(xué)性質(zhì)也影響了中空纖維膜的最佳孔徑和表面成分的選擇。當(dāng)分析物和中空纖維膜內(nèi)壁之間的相互作用最小的時候，分離性能最佳。一般來說，極性較強的中空纖維膜適用于非極性物質(zhì)的分析，極性適中的中空纖維膜適用于極性物質(zhì)的分析[29]。不同材料的中空纖維膜的比較見表1。樣品的損失主要是由于分析物通過中空纖維膜孔，或分析物與中空纖維膜間不可逆的相互作用。因此，在選擇使用的中空纖維膜時，需要綜合考慮膜的材質(zhì)、內(nèi)外徑以及膜孔徑等因素。

表1 不同中空纖維膜的比較

流動相中，離子強度、pH和化學(xué)組成等因素都會影響樣品與中空纖維膜之間的相互作用[37]。因此應(yīng)該選擇同懸浮的樣品顆粒的物化性質(zhì)相近的流動相，以防止顆粒的表面電荷聚集或解離。一般來說，流動相的選擇要使樣品顆粒和中空纖維膜帶有相同電性，使得樣品顆粒與中空纖維膜之間有足夠的靜電排斥作用，減少樣品對膜的吸附，同時控制雙電層的厚度防止因排斥緩沖作用造成樣品顆粒被提前洗脫出來。去離子水可以作為流動相，但大多數(shù)情況下都會調(diào)節(jié)pH、加入表面活性劑以控制或反轉(zhuǎn)樣品和膜的表面電荷、加入鹽以控制雙電層厚度，使樣品能在流動相中更好的分散、不易吸附在中空纖維膜上，更有利于分離。可以往流動相中加入一些殺菌劑，如疊氮化鈉等可以有效抑制細(xì)菌生長。此外，還要考慮所選擇的流動相可滿足后續(xù)檢測器的要求，如在紫外波長小于280 nm時，疊氮化物有很強的紫外吸收。

在HF5技術(shù)中，樣品的平衡位置離積聚壁的距離主要取決于橫向流速和樣品顆粒的擴散系數(shù)之間的關(guān)系。因此，橫向流速是影響HF5分離度的最重要的因素。如果橫向流速過小，會導(dǎo)致樣品中不同粒徑的顆粒無法離開。反之，如果橫向流速過大，樣品顆粒與中空纖維膜的作用力強，可能使得一部分顆粒吸附在膜上，造成樣品峰擴寬，分離時間增加，可能直到橫向流速為零時樣品才能從腔室內(nèi)洗脫出來。實驗過程中，應(yīng)該根據(jù)目標(biāo)分析物的粒徑大小來選擇橫向流速[28]。大的橫向流速適用于較小的樣品顆粒的分離，而小的橫向流速適合于較大樣品顆粒的分離。當(dāng)目標(biāo)分析物的尺寸分布范圍較寬時，采用梯度變化的橫向流速，可以縮短分析時間，得到更好的分離效果。若聚焦時間太短，樣品在沒有達到平衡位置就被提前洗脫出來。這不僅會影響分離度，也會使部分樣品殘留在樣品環(huán)中影響下次進樣。反之，若聚焦時間過長，樣品可以得到充分松弛，但分離時間延長。當(dāng)進樣量較少時，樣品顆粒的洗脫時間會延長，許多顆?？赡茉跈M向流速為零時才被洗脫出來；當(dāng)進樣量過多時，會發(fā)生樣品過載現(xiàn)象。

3.3 FlFFF在納米粒子分析中的應(yīng)用

目前，F(xiàn)lFFF在環(huán)境納米粒子中的一些分析應(yīng)用歸納于表2。

表2 FlFFF用于環(huán)境中納米粒子分析的比較

Reschiglian課題組[46]將AF4與MALS聯(lián)用對合成的聚合物涂層的Au NPs、熒光SiO2NPs、量子點進行了基于尺寸的分離純化，經(jīng)過分離后得到了粒徑分布窄的樣品，體現(xiàn)了AF4能進行半制備級分離純化的優(yōu)點。FlFFF常常與多種檢測器聯(lián)用，對粒徑的尺寸進行快速表征，其應(yīng)用主要可分為以下三類：(1)研究表面的相互作用。如Siripinyanond課題組[47]將FlFFF-ICP-MS方法用于研究Ag NPs和蛋白質(zhì)之間的相互作用。以BSA、球蛋白、纖維蛋白原為模型蛋白質(zhì)，考察了Ag NPs的濃度和孵育時間對Ag NPs與蛋白質(zhì)相互作用的影響，計算得到蛋白質(zhì)與Ag NPs結(jié)合的化學(xué)計量比。(2)研究由一些變量如溫度、pH、離子強度等引起的納米粒子水合粒徑的動態(tài)變化過程或聚集行為。Siripinyanond課題組[48]將AF4與UV聯(lián)用，考察了α-生育酚濃度及孵育時間對Au NPs粒徑的影響，以AF4作為一種對Au NPs尺寸分布進行動態(tài)監(jiān)測的手段，從AF4得到的信息可用于指導(dǎo)制備特定粒徑、滿足特定要求的Au NPs。Xiao等[49]先以60 nm和100 nm的PS NPs為目標(biāo)分析物，優(yōu)化好HF5-UV的分離條件。再以優(yōu)化好的HF5為粒徑表征工具，考察了攪拌速率、反應(yīng)溫度、乳化劑用量和復(fù)合乳化劑配比等因素對合成的聚醋酸乙烯酯納米乳球顆粒(PVAc NPs)粒徑的影響，并監(jiān)控了在8 h內(nèi)，隨時間的延長PVAc NPs的粒徑增長的過程。Hadri等[50]系統(tǒng)性優(yōu)化了CPE對Au NPs的富集條件，將該方法應(yīng)用于土壤樣品中Au NPs的分析，濃縮后的Au NPs采用AF4-SP-ICP-MS進行粒徑表征，結(jié)果表明CPE不會影響納米粒子的粒徑分布。(3)對納米粒子的結(jié)構(gòu)進行分析。Reschiglian等[51]構(gòu)建了AF4-MALS的方法對合成的功能化納米粒子進行了純化，由AF4得到納米粒子的水合粒徑Rh，再通過MALS檢測得到Rg，計算出形狀系數(shù)ρ=Rg/Rh，可對樣品顆粒形狀進行表征。

圖4 AF4與ICP-MS聯(lián)用界面分流裝置圖Fig.4 Split diagram between AF4 and ICP-MS (a)Scheme of instrumental setup;(b)Detailed scheme of the split between the AF4 and ICP-MS

此外，F(xiàn)lFFF常與ICP-MS聯(lián)用，將FlFFF對納米粒子的分離能力與ICP-MS靈敏度高、檢出限低、元素特異性檢測的優(yōu)點相結(jié)合，實現(xiàn)對環(huán)境中低濃度納米粒子的尺寸表征和定量分析。Dubascoux等[2]對FFF與ICP-MS聯(lián)用的歷史、發(fā)展進行了介紹，并對FFF與ICP-MS連接界面進行了研究。由于AF4中常用的縱向流速較大，在引入ICP-MS之間需要進行分流以減少進樣流速。此外，還可以通過分流引入內(nèi)標(biāo)[52]或酸[12]。Hagendorfer等[38]采用AF4與UV、DLS、MALS、ICP-MS多檢測器聯(lián)用，建立了一種快速、元素特異性的方法用于不同粒徑Au NPs的分離、定量和表征。盡管AF4通道中的稀釋倍數(shù)高達200，但由于不同檢測器靈敏度的差異，采用光散射檢測器分析小粒徑物質(zhì)時所需的樣品濃度高，在引入高靈敏度的ICP-MS中時，需采用分流的方法減少進樣至ICP-MS的濃度，以免造成記憶效應(yīng)或因連續(xù)的高信號強度造成檢測器壽命減短，AF4與ICP-MS的連接裝置如圖4所示。ICP-MS對霧化器流速非常敏感，其靈敏度與分流連接處有很大關(guān)系，分流連接處對反壓的微小變化非常敏感。為了解決這個問題，通常是在場流流速與霧化器流速相匹配時(0.1～1.0 mL/min)，加入少量酸或內(nèi)標(biāo)；若不采用分流系統(tǒng)，可以直接將場流流體的管道與霧化器相連[12]。Bolea課題組[53]將AF4-ICP-MS對堆肥瀝出液中的微粒、納米膠束、大分子進行了分離，并考察了這三種組分中金屬離子的含量分布情況。之后，該課題組[39]將AF4與ICP-MS聯(lián)用對四種不同粒徑的Ag NPs進行分離并定量檢測，詳細(xì)考察了流動相濃度、pH、離子強度、膜的種類等條件對Ag NPs分離和回收的影響，并對兩種消費品中的Ag NPs進行檢測。

AF4被廣泛用于分布范圍寬的納米粒子的分析中，但存在著回收率較低、因膜污染導(dǎo)致膜的使用壽命短等缺點。Linder課題組[43]采用磷化氫對Au NPs表面功能化，AF4膜的表面采用帶負(fù)電荷的聚苯乙烯磺酸功能化，改善了 Au NPs的分離效果，回收率高達99.1±0.5%，檢出限為6 μg/kg。之后，該課題組[54]將此方法用于膳食補充劑中Au NPs的分析中，與TEM觀察的結(jié)果相比，該方法對Au NPs尺寸分布分析的結(jié)果偏差小于5%。針對AF4分析過程中流動相消耗量大和樣品分析時間長的問題，You等[55]采用微型化AF4通道，用紫外檢測器，分別對不同粒徑的PS NPs和Au NPs進行了分析。實驗結(jié)果顯示，與常規(guī)AF4通道分析相比，微型化AF4通道分析得到的分離度較低，但是分析時間和樣品、流動相消耗量大大減少，檢出限和定量限有顯著降低，說明微型化AF4通道更適合于環(huán)境中納米粒子的痕量分析。Müller等[56]采用超臨界流體反萃取法移除防曬霜中基質(zhì)組分，再將包含有TiO2NPs的剩余防曬霜組分重新分散，采用微型化AF4對TiO2NPs進行了分離和粒徑的測定。Bria等[57]設(shè)計了一個半制備型的AF4(SP-AF4)通道，并對該通道的分離性能進行了評價。與常規(guī)的AF4通道相比，SP-AF4通道更寬，能有效減少樣品過載現(xiàn)象，提高分離度和樣品通量，適合大體積樣品的分析。

在FlFFF分析中，離子會透過分離膜的膜孔進入廢液中，為了實現(xiàn)對納米粒子和離子的同時測定，常常需要對通道進行一定的改裝。Tan等[45]將HF5與微柱濃縮法(MCC)在線聯(lián)用，采用多種檢測器(UV-Vis、DLS、ICP-MS)首次實現(xiàn)了對Ag+、Ag+與半胱氨酸絡(luò)合物和不同粒徑的Ag NPs的定性、定量分析。在該方法中，HF5用于不同粒徑Ag NPs的分級，而MCC用于富集從隨HF5橫向流體流出的Ag+，小于2 nm的Ag NPs被H2O2氧化為Ag+后再被微柱捕獲，采用硫代硫酸鈉作為洗脫劑，通過差減法得到Ag-Cys 含量。該方法分析速度快，檢出限1.2～3.2 μg/L，RSD為1.9%～6.3%，最終被應(yīng)用于河水和湖水中Ag NPs和Ag+的檢測，回收率為70.7%～108%。該方法后續(xù)被用于環(huán)境中Ag NPs和Ag+之間相互轉(zhuǎn)化過程的研究[58]。

Mudalige等[59]采用BSA對Ag NPs的表面進行功能化，明顯提高了納米粒子在分離通道內(nèi)的穩(wěn)定性和回收率。Ag+可以與BSA表面的半胱氨酸殘基結(jié)合，實現(xiàn)了對Ag+的富集。而青霉胺通過與Ag+形成絡(luò)合物而將Ag+與BSA分開，青霉胺與Ag+絡(luò)合物可以通過分離膜的膜孔，從而實現(xiàn)與Ag NPs的分離和檢測，該方法不需要對分離裝置進行改造，操作簡單，檢出限為4 ng/kg。

4 小結(jié)與展望

根據(jù)分離外場力的不同，F(xiàn)FF可分為ThFFF、ElFFF、SdFFF和FlFFF。不同F(xiàn)FF技術(shù)的分離條件、適用的目標(biāo)分析物也存在較大差異。其中，F(xiàn)lFFF具有操作簡單、可選擇的流動相種類多、分離通道多樣化等優(yōu)點，非常適用于納米粒子的分析。

盡管早在上個世紀(jì)，F(xiàn)FF就被提出，但其在納米粒子的分析中應(yīng)用不多，主要存在以下問題：(1)分離膜對納米粒子的吸附高，導(dǎo)致納米粒子大量損失，回收率低;(2)不同廠家、不同批次的同種材料的分離膜的性能差異大，實驗結(jié)果重現(xiàn)性差;(3)由于分離通道體積大、流動相消耗多，樣品的稀釋倍數(shù)高，需要采用高靈敏的檢測器如ICP-MS等才能進行檢測;(4)FFF無法對納米粒子和離子進行同時檢測，需要對裝置進行復(fù)雜的改裝。在今后的工作中，F(xiàn)FF的分離通道將朝著微型化的方向發(fā)展，或通過與樣品前處理方法聯(lián)用可有效減少樣品的稀釋；尋找合適的改性劑對分離膜進行改性可有效減少納米粒子的吸附，提高納米粒子的回收率。