反向膠束電動毛細管色譜-直接紫外檢測法測定康復新液中氨基酸

蘇 慧， 周鑫悅， 陳 莉， 賴 昕， 李 琦， 余麗雙

(福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州 350122)

氨基酸是構成酶、肽、蛋白質(zhì)等生物大分子的基本結構單位，生命體內(nèi)許多生理過程和新陳代謝都離不開氨基酸的參與。因此，氨基酸分析技術在生命科學、食品科學、臨床醫(yī)學等領域研究中都起著至關重要的作用[1 - 2]。傳統(tǒng)的氨基酸分析檢測，主要是運用氨基酸自動分析儀進行，但是存在著試劑消耗多、操作成本高、分析方法復雜、分析時間長等問題。隨后，人們不斷發(fā)展新的氨基酸分析方法，如：柱前衍生反向高效液相色譜法、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測法、氣相色譜法等，然而這些方法需要復雜的衍生過程。

康復新液為美洲大蠊干燥蟲體的提取物，具有通利血脈，養(yǎng)肌生肌的功效[3]。目前報道美洲大蠊中的化學成分主要為信息素類及氨基酸和各種昆蟲神經(jīng)肽類[4]?，F(xiàn)行衛(wèi)生部藥品標準康復新液中以測定總氨基酸的含量來控制質(zhì)量。近年來，文獻報道的康復新液中氨基酸質(zhì)量控制研究方法主要為高效液相色譜法(HPLC)，如：建立二硝基氟苯柱前衍生化法同時測定康復新液中主要游離氨基酸[5]；采用半制備液相色譜研究康復新液的氨基酸化學成分[6]等。但常規(guī)實驗室大型儀器多配備紫外檢測器，目前文獻報道的方法均需對氨基酸進行衍生化處理，操作復雜且容易引入雜質(zhì)，干擾檢測。因此，建立一種無需衍生、簡單、快速的氨基酸測定新方法具有現(xiàn)實意義。

本文建立了一種同時分離測定亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸和脯氨酸等5種氨基酸的反向毛細管膠束電動色譜-直接紫外檢測新方法。該新方法結合了反向遷移電泳與毛細管膠束電動色譜模式，并采用直接紫外檢測方法，既省去了衍生化過程且重現(xiàn)性好，具有簡單、快速的優(yōu)點[7 - 8]。運用該方法對康復新液中所含人體必需氨基酸亮氨酸、纈氨酸進行測定，結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Beckman PA 800plus型毛細管電泳儀(美國，Beckman Coulter公司)，配以二極管陣列檢測器及32Karat軟件；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；QL-861型渦旋儀(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；Starter 3C型pH酸度計(上海精密科學儀器有限公司)，XS105型電子分析天平(梅特勒-托利多國際股份有限公司)。

標準品：甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸，均購自北京萊耀生物科技有限公司(純度≥98%)；苯甲酸、對氨基苯磺酸、KH2PO4、NaOH、乙腈為分析純試劑(國藥集團化學試劑有限公司)；煙酸、磺基水楊酸、異丙醇、正丁醇、β-環(huán)糊精為分析純試劑(上海阿拉丁試劑有限公司)；十四烷基三甲基氯化銨(TTAB)、十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)為分析純試劑(北京百靈威科技有限公司)；十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)為分析純試劑(源葉生物科技有限公司)。所有實驗用水均經(jīng)Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore公司)制備。

1.2 溶液配制

對照品溶液制備：精密稱取5種氨基酸各1 mg，用超純水溶解并定容至1 mg/mL。

樣品溶液：康復新液(批號:160411、151216、160407)。分析時的樣品溶液由康復新液加超純水稀釋得到。

1.3 電泳工作條件

新毛細管使用前分別用水，0.1 mol/L HCl，水，0.1 mol/L NaOH溶液，水各沖洗20 min；舊毛細管使用前分別用水，0.1 mol/L NaOH溶液，水，運行緩沖溶液各沖洗8 min。

未涂層毛細管：60 cm×75 μm(有效長度為49.5 cm)；運行電壓-20 kV，檢測波長200 nm，壓力進樣34.5 kPa×5 s，操作溫度為25 ℃；每次進樣前，需用運行緩沖溶液沖洗3 min，0.1 mol/L NaOH溶液沖洗2 min，緩沖溶液沖洗2 min。

反向膠束電動毛細管色譜-直接紫外法電泳條件：壓力進樣34.5 kPa×5 s，分離電壓-20 kV(反向遷移)，檢測波長200 nm。

2 結果與討論

2.1 檢測方式的選擇

本文基于大部分氨基酸在波長190～205 nm下有紫外吸收[9]，實驗嘗試采用直接紫外檢測方法。選擇運行電解質(zhì)溶液為磷酸鹽和KH2PO4-NaOH溶液，結果顯示，當運行電解質(zhì)溶液為KH2PO4-NaOH溶液，峰形較好，基線穩(wěn)定。

2.2 遷移模式的的優(yōu)化

實驗首先考慮采用常規(guī)正向遷移(施加正向分離電壓)的分離模式，結果顯示5種目標氨基酸在30 min內(nèi)均未出峰。因此，實驗考慮采用反向遷移的膠束電動毛細管色譜模式(施加正向分離電壓)，結果顯示，5種氨基酸在15 min內(nèi)出峰且峰形良好。

2.3 運行電解質(zhì)溶液優(yōu)化

2.3.1緩沖體系濃度的優(yōu)化緩沖溶液的濃度主要對毛細管管壁Zeta電位、溶質(zhì)的粘度和擴散系數(shù)產(chǎn)生影響。實驗考察了不同濃度的緩沖溶液對待測組分分離的影響，結果見圖1。隨著緩沖溶液濃度的增加，甘氨酸和纈氨酸分離度先增大后減小，且各分析物峰形變好，當緩沖溶液為40 mmol/L(KH2PO4-110 mmol/L NaOH時，甘氨酸和纈氨酸分離度最佳。選擇40 mmol/L(KH2PO4)-110 mmol/L NaOH為緩沖溶液的最佳濃度。

2.3.2緩沖溶液pH的選擇緩沖溶液pH的改變會影響待測組分的電離度，進而影響電泳遷移行為以及分離效率。實驗考察了不同pH的緩沖溶液對各分析物分離效果和峰形的影響。結果見圖2，當緩沖溶液的pH值低于11時，丙氨酸、亮氨酸和甘氨酸各峰形很差且重疊在一起，不能分離，當緩沖溶液的pH值大于11時，甘氨酸和纈氨酸的分離度變小，當緩沖溶液的pH值為11時，5種氨基酸全部出峰，且峰形好，因此實驗選擇pH值為11。

2.3.3緩沖溶液中陽離子表面活性劑的優(yōu)化氨基酸成分的毛細管電泳通常是在堿性溶液中，而在堿性電解質(zhì)溶液中，氨基酸的主要存在形式為陰離子。因此考慮在緩沖溶液中添加陽離子表面活性劑構建膠束體系從而縮短分離時間。實驗考察加入陽離子表面活性劑TTAB、CTAC、DTAB在堿性條件下對5種氨基酸分離分析行為的影響。結果發(fā)現(xiàn)，添加CTAC時分析物的分離效果最好。因此，實驗選擇CTAC陽離子表面活性劑，并進一步考察了CTAC的濃度為0～1.2 mmol/L范圍變化對分析物分離的影響，隨著CTAC含量的增加，分析物遷移時間減小，峰形改善，但當CTAC的含量大于0.4 mmol/L時，亮氨酸和甘氨酸分離度變小，不能完全分離。因此，選擇最佳的CTAC的含量為0.4 mmol/L。

圖1 緩沖液濃度對分析物分離的影響Fig.1 Effect of buffer concentration on the separation of analytes a-d (corresponds to KH2PO4-NaOH concentration):20 mmol/L - 90 mmol/L,30 mmol/L - 100 mmol/L,40 mmol/L - 110 mmol/L,50 mmol/L - 120 mmol/L.Experimental conditions:running buffer:3%(V/V)acetonitrile+0.2 mmol/L CTAC+KH2PO4-NaOH(pH=11);hydrodynamic injection:34.5 kPa×5 s; separation voltage:-20 kV; detection wavelength:200 nm.Peak identifications:1.leucine; 2.alanine; 3.valine; 4.glycine; 5.proline.Sample concentration:40 μg/mL.

圖2 pH值對分析物遷移行為的影響Fig.2 Effect of buffer pH on analyte migration behavior a.10;b.10.5;c.11;d.11.5;e.12.Experimental conditions：running buffer:3%(V/V)acetonitrile+40 mmol/L KH2PO4-110 mmol/L NaOH+0.2 mmol/L CTAC.Sample concentration:100 μg/mL; The other experimental conditions was shown in Fig.1.

2.3.4緩沖溶液內(nèi)有機添加劑對分離效果的影響有機添加劑能降低電解質(zhì)溶液的介電常數(shù)，從而降低電滲流，延長分析時間，改善分離。實驗研究了在電解質(zhì)溶液內(nèi)添加有機添加劑(異丙醇、乙腈、正丁醇)對各組分分離效果的影響。結果表明添加乙腈，各分析物峰形改善，可以得到有效分離且基線較為平穩(wěn)，因此，實驗選擇乙腈作為有機添加劑，并進一步考察了在含0.4 mmol/L CTAC的40 mmol/L KH2PO4-110 mmol/L NaOH溶液(pH=11)中添加不同量的乙腈(0～9%(V/V))對分離的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著乙腈濃度含量的增加，分析物的峰型改善，但當乙腈含量超6%時，甘氨酸與纈氨酸未完全達到基線分離。因此，乙腈含量3%(V/V)為最佳選擇。

經(jīng)過上述條件優(yōu)化后，實驗選擇的最佳運行電解質(zhì)溶液為：40 mmol/L KH2PO4-110 mmol/L NaOH(pH=11)，CTAC含量為0.4 mmol/L，乙腈含量為6%(V/V)。

2.4 儀器條件對分離的影響

2.4.1進樣方式的優(yōu)化以40 μg/mL 5種氨基酸為分析對象，考察進樣方式對分離的影響。電動進樣：在10 kV下進樣5 s；壓力進樣：在34.5 kPa下進樣5 s。對比兩種進樣方法，電動進樣在30 min內(nèi)未出峰，因此實驗選擇壓力進樣34.5 kPa×5 s。

2.4.2分離電壓的優(yōu)化分離電壓的大小影響毛細管中的場強，柱效，焦耳熱和遷移時間等，進而影響各組分的分離效果。實驗考察了-15～-25 kV之間變化時對5種氨基酸分離效果的影響。當分離電壓低時，氨基酸的遷移時間過長；當分離電壓太高時，峰面積減小。綜合考慮，本實驗選擇-20 kV為最佳分離電壓。

經(jīng)過上述儀器條件優(yōu)化后，選擇最佳的實驗條件為：壓力進樣34.5 kPa×5 s，分離電壓-20 kV,檢測波長200 nm。

2.5 方法學驗證

2.5.1線性關系在最佳實驗條件下，對一系列不同對照品溶液進行分析測定，以電泳譜圖的峰面積(Y)與對應的化合物濃度(X，μg/mL)進行線性回歸，并確定其檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。結果表明5種氨基酸的峰面積和濃度呈良好的線性關系(表1)。

2.5.2精密度實驗取一定濃度的對照品混合液，在最優(yōu)電泳條件下連續(xù)進樣5次，計算峰面積和遷移時間的相對標準偏差(RSD，%)，實驗結果符合痕量分析要求(表1)。

表1 5種氨基酸的線性關系和精密度

2.5.3加對照品回收率實驗為評價該方法用于康復新液實際樣品的可行性，對實際樣品進行加入回收率實驗，各組分的回收率如表2所示，加標回收率在77.41%～112.6%之間，說明該方法較為可靠。

表2 亮氨酸和纈氨酸加入回收率結果

2.6 樣品的含量分析

在最佳實驗條件下，對不同批次的康復新液進行分析測定。結果見表3，其電泳譜圖如圖3所示。

表3 亮氨酸、纈氨酸含量測定結果(n=3)

圖3 康復新液(a)及其加標樣品(b)電泳譜圖Fig.3 Electropherograms of kangfuxin liquid(a) and spiked reference substance (b) The experimental conditions was shown in Fig.1.

3 小結

本文建立了一個同時分離測定亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸、脯氨酸5種氨基酸的反向膠束電動毛細管色譜-直接紫外檢測法，并采用該方法對康復新液中含量較高且穩(wěn)定的亮氨酸、纈氨酸進行測定。本實驗所建立的方法簡單、快速、有效，可為康復新液中氨基酸的直接測定提供新方法。