基于環(huán)化腺苷的自發(fā)熒光特性用熒光光譜法直接測定注射劑的中環(huán)磷腺苷

翁文婷， 謝曉蘭， 黃曉平， 陳檐芬

(1.泉州師范學(xué)院化工與材料學(xué)院，福建泉州 362000; 2.華僑大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，福建廈門 361021)

圖1 環(huán)磷腺苷(cAMP)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of cAMP

環(huán)磷腺苷(cAMP)為6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9H-嘌呤-4′,5′-環(huán)磷酸氫酯，別名環(huán)化腺苷酸，其結(jié)構(gòu)見圖1。cAMP作為蛋白激酶致活劑，是人體內(nèi)廣泛存在的具有生理活性的一種重要物質(zhì)，它作為參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的第二信使物質(zhì)，在臨床上應(yīng)用廣泛。cAMP屬于核苷酸的衍生物，是由三磷酸腺苷(ATP)通過腺苷酸環(huán)化酶(AC)催化下反應(yīng)生成，對(duì)于多種體內(nèi)功能活動(dòng)均起到調(diào)節(jié)作用[1]。自從1998年發(fā)現(xiàn)了cAMP效應(yīng)分子Epac，使人們對(duì)cAMP信號(hào)通路中的相關(guān)分子與途徑有了新的認(rèn)識(shí)[2 - 3]。最近的研究結(jié)果顯示，受上游信號(hào)cAMP刺激時(shí)，cAMP直接激活的交換因子Epac會(huì)將小分子G蛋白酶Rap結(jié)合的無活性(GDP)置換為活性(GTP)，并激活Rap，從而使Rap發(fā)揮重要信號(hào)分子作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、基因表達(dá)或者細(xì)胞黏附和遷移等系統(tǒng)機(jī)能活動(dòng)[4]。這也證明了信號(hào)分子cAMP對(duì)于調(diào)節(jié)機(jī)體整體活動(dòng)的協(xié)調(diào)性和精確性等方面起重要作用[5 - 6]。因此，對(duì)cAMP含量的準(zhǔn)確檢測方法的研究很有意義。cAMP早前運(yùn)用較廣泛的是Gilman的蛋白結(jié)合檢測法[7]和免疫檢測法[8]，其他生物熒光方法也能較好追蹤活體細(xì)胞中cAMP的變化[9]，但是操作相對(duì)復(fù)雜。盛國榮等采用計(jì)算分光光度法建立復(fù)方cAMP中環(huán)乳膏的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[10]，但需要進(jìn)行復(fù)雜的計(jì)算分離過程，線性范圍較窄。高效液相色譜(HPLC)作為靈敏的藥物分析檢測手段被收錄在《中國藥典》(2015版)中[11]，運(yùn)用該方法對(duì)cAMP的藥理和含量檢測的研究也有報(bào)道[12 - 14]。熒光分光光度法因靈敏度高、操作簡單、快速靈敏等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于生物小分子的檢測和藥理分析的研究中[15 - 16]?；跓晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng)，可設(shè)計(jì)生物熒光傳感器用于精確研究活體細(xì)胞中cAMP的藥理和動(dòng)態(tài)變化[17 - 20]。但是，利用cAMP的自身結(jié)構(gòu)的熒光效應(yīng)，采用直接熒光光譜法測定其含量的研究罕見報(bào)道。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，cAMP水溶液具有非環(huán)狀的腺苷結(jié)構(gòu)不具備的自發(fā)熒光性質(zhì)，而且熒光光譜明顯區(qū)別于嘌呤環(huán)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)。通過加熱并進(jìn)行溶液條件的優(yōu)化后，pH=2.0的cAMP溶液在最佳激發(fā)波長285 nm條件下，于393 nm處具有最佳的熒光發(fā)射信號(hào)，熒光量子產(chǎn)率為4.28%，具有穩(wěn)定的光漂白性和光譜不依賴性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)利用cAMP的含量與熒光強(qiáng)度在一定條件下呈良好的線性關(guān)系，建立起一種直接快速的測定環(huán)磷腺苷注射劑中cAMP含量的新方法。與現(xiàn)有檢測方法相比，該直接熒光法具有準(zhǔn)確度高、操作簡單、成本低廉和綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Cary eclipse熒光分光光度計(jì)(美國，Varian公司)；UV-2600紫外-可見分光光度計(jì)(日本，Shimazu公司)；F-7000熒光分光光度計(jì)(日本，Hitachi公司)；FLS920熒光光譜儀(英國，Edinburgh Instruments)；HPLC-6460Q液-質(zhì)聯(lián)用儀(美國，Agilent公司)，配電噴霧離子(ESI)源；ZetaPALS Zeta電位及粒徑分析儀(美國，布魯克海文儀器公司)。

腺嘌呤(ANE，Mr=135.13)，腺嘌呤核苷(ANS，Mr=267.24)，腺苷一磷酸二鈉(AMP，Mr=499.19)，環(huán)磷腺苷(cAMP，Mr=329)，均為分析純試劑，購于上海阿拉丁試劑公司。準(zhǔn)確稱取ANE、ANS、AMP和cAMP的對(duì)照品，分別配制1.0×10-2mol/L的儲(chǔ)備溶液，保存于4 ℃冰箱。臨用前根據(jù)需要，用0.1 mol/L HCl和NaOH溶液將儲(chǔ)備液稀釋成不同pH的1.0×10-4mol/L工作液。pH=1.98～10.38 B-R緩沖溶液：由0.04 mol/L的H3PO4、H3BO3和HAc混合酸加入不同量的0.2 mol/L NaOH配制而成。其余的試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)所用水為超純水。

cAMP注射劑(山東濰坊制藥廠有限公司，批號(hào)：745150501，745150505，745150507)：規(guī)格為40 mg：5 mL，用超純水稀釋成40 mg/L溶液，置于冰箱中5 ℃儲(chǔ)存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1熒光光譜和紫外光譜分析移取5 mL對(duì)照品操作液，加入等量的不同pH緩沖溶液，稀釋成5.0×10-5mol/L溶液，于熒光分光光度計(jì)上，設(shè)置狹縫5.0/10.0 nm,激發(fā)波長λex=285 nm，在290～550 nm范圍內(nèi)進(jìn)行熒光光譜分析。同時(shí)在紫外分光光度計(jì)上掃描吸收光譜。設(shè)置光譜狹縫為2.5 nm，以純?nèi)軇榭瞻讌⒈纫?，?00～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行吸收光譜分析。

1.2.2cAMP的高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)分析采用ZORBAX Eclipse Plus C18(RRHD)色譜柱(50×2.1 mm，1.8 μm)，以超純水作為流動(dòng)相A，以色譜純甲醇作為流動(dòng)相B，梯度洗脫，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃；進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜采用ESI離子源；掃描方式：正、負(fù)離子同時(shí)掃描；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源溫度：350 ℃；毛細(xì)管溫度：300 ℃；毛細(xì)管電壓：正、負(fù)離子模式下均為4.0 kV；鞘氣氣流：11 L/min。取cAMP標(biāo)準(zhǔn)品和注射劑各適量，加流動(dòng)相A制成每1 L中分別含50 μg的操作溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液，進(jìn)行高效液相色譜實(shí)驗(yàn)。

1.2.3cAMP注射劑樣品的熒光光譜測定準(zhǔn)確移取cAMP注射液，稀釋200倍，制成40 μg/mL溶液后，再稀釋成0.4 μg/mL溶液，于熒光分光光度計(jì)上，設(shè)置狹縫5.0/10.0 nm，激發(fā)波長λex=285 nm，在290～550 nm范圍內(nèi)進(jìn)行熒光光譜分析，同時(shí)用水進(jìn)行空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 cAMP的內(nèi)源性熒光機(jī)理初探

按照操作步驟，分別配制不同pH條件下1.0×10-4mol/L的ANE、ANS、AMP和cAMP溶液，進(jìn)行熒光光譜測定，如圖2所示。在各種溶液體系中，只有ANE因剛性的嘌呤環(huán)平面結(jié)構(gòu)而具有自發(fā)熒光特性和穩(wěn)定的熒光強(qiáng)度，熒光光譜的激發(fā)峰位置隨著pH的增加而發(fā)生紅移并伴隨著Stocks位移的減小(表1)，這是因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)上的伯胺基團(tuán)質(zhì)子化程度不同而導(dǎo)致的。在酸性條件下，4種物質(zhì)均有明顯熒光信號(hào)，ANE的最大激發(fā)和最大發(fā)射波長分別為287、381 nm，光譜的Stokes位移是94，當(dāng)分子上連接上戊糖結(jié)構(gòu)后，無論是核苷還是腺苷結(jié)構(gòu)，熒光光譜的Stokes位移明顯增大到105以上，當(dāng)在ANS的結(jié)構(gòu)上引入磷酸形成AMP，磷酸的位阻效應(yīng)使雜環(huán)結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)，而且在強(qiáng)酸性環(huán)境下易質(zhì)子化，從而使原來熒光體的最低單線激發(fā)態(tài)S1為n、π*型轉(zhuǎn)化為π、π*，因此熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。這也進(jìn)一步解釋了在中性溶液環(huán)境中，非質(zhì)子化的非剛性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致ANS和AMP沒有熒光特性[21]。

圖2 不同pH條件下1.0×10-4 mol/L ANE、ANS、AMP和cAMP的熒光光譜圖 Fig.2 Fluorescence spectra of ANE，ANS，AMP and cAMP in different pH with 1.0×10-4 mol/L

表1 ANE、ANS、AMP和cAMP的熒光光譜特征峰數(shù)據(jù)(nm)

但是一旦磷酸鏈接到糖環(huán)上形成cAMP，兩個(gè)大雜環(huán)結(jié)構(gòu)因C-C鍵隔開，形成特殊的基態(tài)轉(zhuǎn)動(dòng)構(gòu)型，導(dǎo)致cAMP在中性環(huán)境中也具有特有的自發(fā)熒光現(xiàn)象。此時(shí)，cAMP的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為285、393 nm，具有最大的Stokes位移，可明顯區(qū)別于嘌呤體系。對(duì)應(yīng)的紫外光譜如圖3(a)所示，4種物質(zhì)的吸收峰位置均相同，說明發(fā)生紫外吸收的特征結(jié)構(gòu)沒有明顯改變。很明顯采用紫外光譜和紫外檢測器的高效液相色譜法來測定cAMP的含量，其方法選擇性不如熒光光譜。因此通過測定cAMP的熒光強(qiáng)度進(jìn)行含量分析具有較高可行性。

圖3 B-R緩沖溶液(pH=2.0)中ANE、ANS、AMP與cAMP的紫外(UV)光譜圖(a)和cAMP的色譜(b)與質(zhì)譜圖(c) Fig.3 UV spectra of ANE,ANS,AM,cAMP in B-R buffer(pH=2.0)(a)，chromatograms(b) and mass spectrum(c) of cAMP

2.2 cAMP的質(zhì)譜分析

按實(shí)驗(yàn)方法中操作步驟，對(duì)cAMP進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖3(b)所示，在最優(yōu)化條件下得到的質(zhì)譜圖上有明顯三組峰(m/z327.9、m/z133.8、m/z106.9)，分別對(duì)應(yīng)著cAMP脫去一個(gè)H+的主分子離子峰，C-C 斷裂形成的ANE碎片峰和脫去了磷酸后的戊糖分子碎片峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沒有其它雜峰存在，進(jìn)一步說明cAMP具有穩(wěn)定的兩個(gè)雜環(huán)結(jié)構(gòu)，可在強(qiáng)酸性條件下以自身特殊的構(gòu)型存在，并形成自發(fā)熒光。

2.3 cAMP熒光體系的條件優(yōu)化

2.3.1溶劑類型和用量的影響按照操作步驟，分別配制1.0×10-4mol/L cAMP的水、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯和甲醇溶液，混勻、靜置15 min后。分別在熒光分光光度計(jì)上測量熒光光譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除在純水中，其他溶劑均會(huì)干擾cAMP的熒光信號(hào)，使其熒光峰位置發(fā)生改變，強(qiáng)度下降。在純水環(huán)境下cAMP的熒光達(dá)到最強(qiáng)，所以本實(shí)驗(yàn)選擇純水作為溶劑。

2.3.2緩沖溶液類型和pH值的影響測定了不同pH值條件下cAMP水溶液的熒光光譜，結(jié)果如圖4所示。酸性條件下cAMP具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，熒光強(qiáng)度隨溶液酸性增強(qiáng)而逐漸變大，在pH=2.0時(shí)熒光強(qiáng)度最大，酸性進(jìn)一步增強(qiáng)熒光強(qiáng)度反而下降。這可能是因?yàn)榉肿咏Y(jié)構(gòu)中的磷酸根在pH=2.0左右最易質(zhì)子化而導(dǎo)致的。隨后考察pH=2.0的鄰苯二甲酸氫鉀、NaHPO4-檸檬酸、檸檬酸-NaOH-HCl和B-R緩沖溶液對(duì)熒光信號(hào)的影響。結(jié)果表明，cAMP在B-R緩沖液中熒光最強(qiáng)。所以本實(shí)驗(yàn)選擇pH=2.0的B-R緩沖溶液為最佳反應(yīng)條件。

圖4 不同pH的B-R緩沖溶液中cAMP的熒光光譜(a)、熒光強(qiáng)度(b)和熒光發(fā)射波長(c)隨pH的變化趨勢圖Fig.4 The fluorescence spectra of cAMP at different pH B-R buffer(a),relationship between fluorescentce intensity(b) and emission wavelength(c) with pH

圖5 不同激發(fā)波長下cAMP的發(fā)射光譜(a)、發(fā)射波長(b)和熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長的變化(c)趨勢圖(狹縫5.0/5.0 nm)Fig.5 The emission spectra of the cAMP solution at different excitation wavelength(a),emission wavelength(b) and relationship of fluorescentce intensity(c) with excitation wavelength(slit=5.0/5.0 nm)

2.3.3溫度的影響按照實(shí)驗(yàn)方法中的步驟，將配制好的cAMP溶液分別在不同水浴溫度下加熱2 h，冷卻到室溫法后，在熒光分光光度計(jì)上測定熒光光譜。結(jié)果顯示，體系在50 ℃溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，可有效增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度，所以本實(shí)驗(yàn)選擇50 ℃作為最佳加熱溫度。

2.3.4重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取cAMP標(biāo)準(zhǔn)操作溶液，進(jìn)行最優(yōu)化條件處理后，于熒光分光光度計(jì)上測定熒光強(qiáng)度[16]，平行測定10次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.08%。說明該體系具有較好的重現(xiàn)性。

2.3.5cAMP溶液的熒光光譜性能按實(shí)驗(yàn)方法，采用不同激發(fā)波長對(duì)cAMP進(jìn)行發(fā)射光譜掃描，結(jié)果如圖5所示。在不同波長激發(fā)下cAMP的熒光發(fā)射光譜的最大發(fā)射峰位置沒有明顯改變，但是熒光強(qiáng)度先增后降，在激發(fā)為285 nm時(shí)達(dá)到最高。這種激發(fā)光譜不依賴性質(zhì)和熒光染料分子發(fā)光的特性是一致的，這也進(jìn)一步驗(yàn)證cAMP自發(fā)熒光的可行性。

2.4 工作曲線與檢出限

按照實(shí)驗(yàn)方法，準(zhǔn)確移取一系列不同濃度的cAMP標(biāo)準(zhǔn)溶液，于熒光分光光度計(jì)上測定熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明：cAMP在1.0×10-6～1.0×10-5mol/L濃度范圍與其熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性方程為：F=44.87+1.897×107ccAMP(mol/L)，相關(guān)系數(shù)r=0.9991,檢出限(3S0/K)為1.708×10-9mol/L。將該熒光法測定所得結(jié)果與高效液相色譜法[11]相比較，結(jié)果一致。

2.5 共存物質(zhì)的影響

2.6 注射劑中CAMP的含量測定

取稀釋后注射劑樣品溶液，分別添加低、中、高3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下目標(biāo)化合物的回收率在98.3%～110.0%之間，RSD≤4.9%(表2)，可滿足實(shí)際分析的要求。

表2 注射劑樣品測定結(jié)果與加標(biāo)回收率(n=6)

3 結(jié)論

環(huán)磷腺苷在酸性至中性溶液環(huán)境中會(huì)呈現(xiàn)穩(wěn)定的熒光光譜，最佳激發(fā)/發(fā)射波長為285/393 nm。在pH=2.0的B-R緩沖溶液中，50 ℃水浴加熱2 h后達(dá)到最佳熒光強(qiáng)度，量子產(chǎn)率為4.28%。由此建立了一種直接熒光法測定cAMP的新方法。實(shí)驗(yàn)表明，本法操作簡便，重現(xiàn)性好，精確度高等優(yōu)點(diǎn)，測定結(jié)果較準(zhǔn)確，可用于注射劑中環(huán)磷腺苷含量的測定。