紅棗白蘭地中特征風(fēng)味物質(zhì)的感官組學(xué)

任曉宇，鎖 然*，裴曉靜，王 頡，王珺瑫，張少云，謝立娜

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

紅棗白蘭地[1]是一種蒸餾酒，它以紅棗為原料，經(jīng)過發(fā)酵、蒸餾、橡木桶貯藏陳釀而成，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)40%～80%[2]。它在制作過程中不經(jīng)過任何的勾兌，大多數(shù)是由家庭式作坊制造，并且在制造過程中，產(chǎn)生了豐富而且復(fù)雜的香氣物質(zhì)。

香氣成分是影響酒品質(zhì)的一個重要因素，它主要受一些復(fù)雜芳香化合物的影響。夏亞男等[3]采用頂空固相微萃?。╤eadspace-soild phase microextraction，HSSPME）鑒定出紅棗白蘭地中85 種香氣化合物，其中以酯類最多。張文葉等[4]采用同時蒸餾萃取鑒定出干紅棗酒中53 種香氣化合物。李樹萍等[5]通過氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）聯(lián)用技術(shù)共鑒定出了56 種香氣化合物，其中酯類物質(zhì)較多。李丹等[6]采用液液萃取法鑒定出金絲小棗酒中35 種香氣化合物，其中以醇類物質(zhì)最多。

采用HS-SPME與GC-MS聯(lián)用測定紅棗白蘭地的香氣成分的研究較少，而且用感官組學(xué)分析方法對紅棗白蘭地的研究鮮有報道。感官組學(xué)[7]是近年提出來的，在分子水平上研究食品感官質(zhì)量的多學(xué)科交叉技術(shù)。它的核心內(nèi)容是在分子水平上定性、定量和描述分析，并精確構(gòu)建食品的風(fēng)味重組物[8]。目前，對于香氣的研究技術(shù)不僅包括GC-O和定量分析，而且包括一些感官組學(xué)研究，比如香氣活性值（odor activity value，OAV）、香氣描述分析、香氣萃取物稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）[9]、香氣重組與香氣遺漏實驗[10]。它們被廣泛而且成功應(yīng)用于研究食品中的特征香氣成分，如威士忌、啤酒、中國米酒及其他食物[11-14]。

本實驗通過GC-O-MS聯(lián)用對紅棗白蘭地中的香氣成分進(jìn)行分析，通過香氣描述分析、AEDA確定紅棗白蘭地中的香氣成分，并且結(jié)合內(nèi)標(biāo)法測定每種化合物在酒中的含量，得出紅棗白蘭地的主要組成成分；同時通過OAV確定每種香氣化合物的貢獻(xiàn)值，以及通過香氣重組、香氣遺漏/添加實驗進(jìn)一步確定紅棗白蘭地中的特征香氣成分。該結(jié)果為紅棗白蘭地特征風(fēng)味和品質(zhì)控制提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗白蘭地成品酒（乙醇體積分?jǐn)?shù)46%）生產(chǎn)于河北保定阜平；氯化鈉、碳酸氫鈉、硫酸、無水硫酸鈉（均為分析純） 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司； 無水乙醇（色譜純） 美國阿拉丁試劑有限公司；3-辛醇（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷（分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；庚酸乙酯、月桂酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯甲醛、壬酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、苯丙酸乙酯、辛酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、癸酸甲酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、正丁醇、正戊醇、苯甲醇、苯乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、月桂酸、癸酸、辛酸、戊酸、苯乙酸、蘑菇醇、糠醛、庚酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國TCI公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977A GC-MS聯(lián)用儀、HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司； ODP3嗅聞儀 德國Gerstel公司；二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭、萃取手柄 美國Supelco公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；JJ200型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

1.3.1.1 液液萃取樣品處理

參考文獻(xiàn)[15]方法，取50 mL酒樣于分液漏斗中用煮沸的去離子水稀釋至乙醇體積分?jǐn)?shù)10%，添加氯化鈉至飽和。用二氯甲烷在分液漏斗中分別萃取3 次，收集合并有機(jī)相。為便于GC-O和GC-MS分析，將濃縮后的有機(jī)相分成酸性/水溶性組分、中性組分、堿性組分3 個部分。

將萃取液氮吹濃縮至100 mL，加煮沸的去離子水50 mL。用加有氫氧化鈉的10%碳酸氫鈉溶液（pH 11）調(diào)整pH值至10，靜置分層，將水相記為萃取物1，有機(jī)相記為萃取物2。

萃取物1用2 mol/L H2SO4溶液調(diào)整pH值至2，用10 g NaCl飽和，用二氯甲烷萃取2 次，每次10 mL，合并萃取物，加入5 g無水硫酸鈉置于冰箱中干燥過夜后，氮吹至1 mL，記為“酸性/水溶性組分”。萃取物2用20 mL煮沸的去離子水洗一次，靜置分層，在分液漏斗中分離出水相和有機(jī)相，水相記為萃取物3，有機(jī)相記為萃取物4。萃取物3用二氯甲烷萃取2 次，每次10 mL，合并萃取物，加入無水硫酸鈉置于冰箱中干燥過夜后，氮吹至1 mL，記為堿性組分。萃取物4加入無水硫酸鈉，置于冰箱中干燥過夜后，氮吹至1 mL，記為中性組分。所有的萃取液供GC-O和GC-MS分析。

1.3.1.2 HS-SPME樣品處理

用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行萃取。酒樣用煮沸的去離子水稀釋至乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%。在20 mL頂空瓶準(zhǔn)確加入7.5 mL稀釋樣品，并加入25 μL的3-辛醇（300 mg/L）作為內(nèi)標(biāo)化合物，將已經(jīng)老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入頂空瓶中。樣品在50 ℃預(yù)熱15 min，萃取吸附40 min，吸附完成后，GC解吸6 min。

1.3.2 GC-O與GC-MS分析條件

GC條件：HP-INNOWAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣；升溫程序：50 ℃保持2 min，以6 ℃/min升溫至230 ℃，并保持15 min；載氣為高純氦氣，恒定流速為1.45 mL/min。

MS條件：離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z30～450。

1.3.3 香氣強(qiáng)度測定

由4 名經(jīng)過培訓(xùn)的評價員在嗅聞口記錄得到風(fēng)味的特征和強(qiáng)度，強(qiáng)度分別為0、1、2、3、4五個等級，其中0表示未聞到，1表示聞香程度微弱，2表示聞香程度中等，3表示聞香程度明顯，4表示聞香程度非常明顯，同時將聞到的香味進(jìn)行描述，最終的聞香強(qiáng)度為每次記錄的聞香強(qiáng)度的平均值[16]。對香氣強(qiáng)度大于2的物質(zhì)進(jìn)行定量分析及OAV分析。

1.3.4 AEDA測定

參考文獻(xiàn)[17]方法，用二氯甲烷將濃縮萃取液按照體積1∶2n（n=1, 2, 3……）進(jìn)行系列稀釋，每次稀釋后自動進(jìn)樣1 μL用于GC-O分析，直到評價員在嗅聞口感覺不到氣味則停止稀釋。在最低的濃度條件下仍能聞到的成分被確定為樣品的關(guān)鍵香氣成分，通過AEDA法確定呈味化合物的稀釋因子。

1.3.5 香氣化合物的定性定量分析

定性分析：通過與NIST 14.L中的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行比對，并結(jié)合GC-O共同確定香氣化合物。

定量分析：由于DVB/CAR/PDMS萃取頭對一些強(qiáng)極性的脂肪酸以及不易揮發(fā)物質(zhì)的吸附性較差，因此選擇液液萃取對脂肪酸以及不揮發(fā)的物質(zhì)進(jìn)行定量[18]。參考文獻(xiàn)[18]的方法，將酒樣用煮沸的去離子水稀釋至乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%，取18 mL的稀釋液于密封性良好的20 mL樣品瓶中，加NaCl飽和，加入54 μL 3-辛醇（最終質(zhì)量濃度為3 μg/mL），加入1 mL二氯甲烷進(jìn)行萃取，取1 μL提取液進(jìn)行GC-MS分析。HS-SPME定量易揮發(fā)的香氣成分，采用3-辛醇做內(nèi)標(biāo)，建立相應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對香氣物質(zhì)進(jìn)行定量。

1.3.6 OAV的計算

OAV是用來評價各個香氣成分對酒的總體香氣貢獻(xiàn)，OAV是香氣物質(zhì)的濃度與該物質(zhì)的閾值之比[19]。通常情況下，OAV不小于1的物質(zhì)對酒的總體風(fēng)味具有貢獻(xiàn)[20]。根據(jù)文獻(xiàn)[21-24]查找每個香氣物質(zhì)的閾值，再根據(jù)其含量進(jìn)行計算得到香氣物質(zhì)的OAV。

1.3.7 紅棗白蘭地的香氣重組實驗

以46%乙醇溶液作為重組基質(zhì)，將紅棗白蘭地中OAV不小于1的香氣物質(zhì)以自然濃度溶解在基質(zhì)中[25]，最后在室溫條件下平衡10 min，得到一個完整的重組樣品。

選取10 名評價人員進(jìn)行香氣成分描述（5 名男性和5 名女性，平均年齡30 歲），其中6 名來自GC-O分析的人員，另外4 名是熟悉白酒特征風(fēng)味的實驗室工作人員。選擇7 個相關(guān)味道來描述酒中的香氣：水果、乙醇、蘑菇、酸味、花香、甜味、草味。評價人員根據(jù)香氣的強(qiáng)度進(jìn)行評定（0～4），其中0表示未聞到，1表示香氣微弱，2表示香氣中等，3表示香氣較強(qiáng)，4表示香氣最強(qiáng)。每種香氣的強(qiáng)度值為10 名品評人員所聞強(qiáng)度的算術(shù)平均值，最后將所得結(jié)果做成雷達(dá)圖。

1.3.8 遺漏/添加實驗

根據(jù)文獻(xiàn)[26]的方法，通過3 組樣品測定確定某些化合物的顯著性。因此，準(zhǔn)備14 種香氣遺漏模型，每一種模型是重組模型省略一個或者多個組分。給評估人員呈現(xiàn)3 個樣品，即一個省略模型和2 個完整重組模型。所有的樣品隨機(jī)編碼，要求評價人員通過嗅聞確定不同的樣品。根據(jù)文獻(xiàn)描述的方法[26]確定省略模型和完全重組模型之間差異的顯著性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棗白蘭地中香氣成分的GC-MS分析

表1 GC-O確定紅棗白蘭地中的香氣成分Table 1 Aroma compounds identi fied by GC-O in jujube brandy

續(xù)表1

由表1可知，在紅棗白蘭地中共檢測出63 種香氣化合物，包括酯類25 種、醇類14 種、酸類12 種、醛類5 種、酮類2 種、其他5 種。結(jié)果表明，在紅棗白蘭地香氣物質(zhì)中酯類、醇類物質(zhì)較多。根據(jù)文獻(xiàn)[27]可知，在酒的發(fā)酵、蒸餾和老化過程中醇和脂肪酸不斷形成酯類物質(zhì)，而這些酯類物質(zhì)對酒的香氣具有重要的作用。醇類物質(zhì)是由原料中的蛋白質(zhì)、氨基酸和糖類在發(fā)酵過程中生成[28]，它們賦予酒體醇香。醛酮類物質(zhì)屬于不穩(wěn)定的中間化合物，其數(shù)量較少，但也賦予酒體一定的香氣。酸類物質(zhì)主要影響酒的口感。

由表1可知，乙酸異戊酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸二乙酯、3-苯丙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇具有較高的香氣強(qiáng)度，香氣強(qiáng)度為3。其中，3-苯丙酸乙酯（＞2 048）具有較高的稀釋因子，庚酸乙酯、丁二酸二乙酯稀釋因子分別為512、256，這些酯類物質(zhì)都顯出較強(qiáng)的水果香氣；然而3-甲基-1-丁醇表現(xiàn)出不愉快的味道。丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、壬酸乙酯、苯乙酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯等酯類香氣強(qiáng)度都為2.75，其中丁酸乙酯（＞2 048）、2-甲基丁酸乙酯（＞2 048）都具有較高的稀釋因子，它們分別表現(xiàn)出橘子香味和水果香味；己酸乙酯、壬酸乙酯也具有相對高的稀釋因子（512），它們賦予酒體檸檬味、花香味；苯乙酸乙酯（256）表現(xiàn)出蜂蜜味；月桂酸乙酯（64）、異戊酸乙酯（32）、辛酸乙酯（32）和大多數(shù)酯類一樣，都賦予酒體水果香味。然而，月桂酸乙酯、己酸乙酯在其他酒中則表現(xiàn)出了較高的香氣強(qiáng)度[29-30]。其他一些香氣物質(zhì)，如癸酸（難聞氣味）、萘（衛(wèi)生球味）、亞油酸乙酯（奶油味）、苯甲醛（苦杏仁味），它們呈現(xiàn)出較低的香氣強(qiáng)度但同時也賦予酒體不同的風(fēng)味，然而，在其他研究中也發(fā)現(xiàn)了這些風(fēng)味物質(zhì)[21]。

2.2 紅棗白蘭地中香氣成分的定量分析

表2 34 種香氣成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及在紅棗白蘭地中的含量Table 2 Standard curves and concentrations of 34 odorants in jujube brandy

盡管GC-O能有效測定紅棗白蘭地中的香氣成分，但是它不能確定關(guān)鍵香氣成分。為進(jìn)一步研究紅棗白蘭地中的香氣物質(zhì)，將香氣強(qiáng)度大于2的34 種物質(zhì)進(jìn)行定量。如表2所示，在紅棗白蘭地中，異丁醇與3-甲基-1-丁醇的質(zhì)量濃度最高，分別為2 024.38、1 359.48 mg/L，它們賦予酒樣醇香。同時，月桂酸乙酯（118.27 mg/L）、苯甲酸乙酯（34.69 mg/L）、丁酸乙酯（30.44 mg/L）、癸酸乙酯（26.34 mg/L）、苯甲醛（20.94 mg/L）、丁二酸二乙酯（14.89 mg/L）具有較高的含量，賦予酒體水果、甜香味。然而一些含量不高的香氣物質(zhì)卻賦予酒體特殊的香氣，比如糠醛（8.42 mg/L），它賦予酒體苦杏仁味；亞油酸乙酯（3.12 mg/L）賦予奶油、花香味；1-辛烯-3-醇（2.12 mg/L）賦予蘑菇味；苯乙醇（1.2 mg/L）賦予玫瑰香味。因此，不同含量的物質(zhì)賦予酒樣不同的香氣。

2.3 香氣成分的OAV分析

表3 紅棗白蘭地中34 種香氣成分的閾值以及OAVTable 3 Orthonasal thresholds and OAVs of 34 odorants in jujube brandy

由表3所示，在定量的34 種香氣物質(zhì)中，有21 種化合物的OAV大于1，其中酯類物質(zhì)13 種，醇類物質(zhì)4 種，酸類物質(zhì)3 種，醛酮類物質(zhì)1 種。它們對紅棗白蘭地中的風(fēng)味具有重要作用。其中2-甲基丁酸乙酯的OAV最大，具有水果香味，對紅棗白蘭地的香氣貢獻(xiàn)最大；其次是異戊酸乙酯（OAV=872.28）、辛酸乙酯（OAV=559.69）。丁酸乙酯、戊酸乙酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯OAV分別為373.5、222.76、184.8、182.28，共同賦予酒樣水果香味。1-辛烯-3-醇賦予酒樣蘑菇味，其OAV為346.41。3-苯丙酸乙酯（OAV=44.96）、苯乙酸乙酯（OAV=12.38）分別賦予酒樣花香味、蜂蜜味。然而對于OAV不大于1的香氣物質(zhì)，對于酒樣整體香氣并沒有很大貢獻(xiàn)。

2.4 香氣重組與遺漏/添加實驗分析

表4 紅棗白蘭地完整重組中的遺漏/添加實驗Table 4 Omitted odorants in complete recombinant test

圖1 紅棗白蘭地的特征香氣與完整香氣重組的特征香氣Fig. 1 Aroma profile of jujube brandy and complete aroma recombinants

為進(jìn)一步證實紅棗白蘭地中的特征香氣物質(zhì)，根據(jù)定量結(jié)果進(jìn)行香氣重組與遺漏/添加實驗。在46%乙醇溶液中分別加入OAV大于1的21 種香氣物質(zhì)，構(gòu)成重組模型，具體遺漏/添加香氣物質(zhì)如表4所示。該評價小組由10 名經(jīng)過訓(xùn)練的評價者組成，通過對香氣強(qiáng)度的描述比較重組模型以及原液的香氣性質(zhì)。結(jié)果如圖1所示，重組的香氣成分顯示出水果、草味、甜味、花香、酸味、蘑菇，乙醇味較原酒稍低。因此，重組模型與原液的香氣具有一定的相似性。結(jié)果表明，重組模型成功表現(xiàn)出所研究的紅棗白蘭地中的香氣。

由表4可知，所有的評價者都能夠識別出缺乏所有酯類物質(zhì)的模型（模型1），從而可以判斷出省略模型1和完整重組之間具有高度差異性。因此，結(jié)果表明酯類所表現(xiàn)出來的水果香味對酒的整體香氣具有重要的作用。

由表3可知，2-甲基丁酸乙酯具有較高的OAV，但是當(dāng)對其進(jìn)行省略實驗時，10 個評估者只有4 個能正確識別出該化合物的缺失，與完全重組之間無顯著性差異，因此2-甲基丁酸乙酯不能作為紅棗白蘭地中的特征香氣物質(zhì)。

研究結(jié)果表明，異戊酸乙酯、辛酸乙酯具有較高的OAV，因此，建立省略模型進(jìn)行進(jìn)一步的研究。當(dāng)省略這2 種物質(zhì)之外的所有酯（模型1E）時，無顯著性差異，因此可以表明這2 種物質(zhì)對酒的整體香氣具有重要作用。當(dāng)缺少異戊酸乙酯、辛酸乙酯（模型1D）時，具有極顯著差異。然而，當(dāng)僅缺少異戊酸乙酯（模型1B）時無顯著性差異，但當(dāng)缺少辛酸乙酯（模型1C）時具有高度顯著性差異，因此辛酸乙酯比異戊酸乙酯對酒的整體香氣具有更重要的作用。

當(dāng)省略所有醇（模型2）時只有6 個評估者感覺到，因此無顯著性差異。但由表3可知，1-辛烯-3-醇、異丁醇具有較高的OAV，因此對他們分別做省略模型。當(dāng)省略1-辛烯-3-醇時（模型2A），有7 個評價者能感覺到，因此可知1-辛烯-3-醇的蘑菇味對酒的香氣具有顯著影響。當(dāng)省略異丁醇（模型2B）時只有4 個評價者能感覺到，因此異丁醇對酒的香氣并沒有很大的作用。雖然3-甲基-1-丁醇、正丁醇OAV較低，但缺少這2 種物質(zhì)時（模型2C）具有極顯著差異，因此可知3-甲基-1-丁醇、異丁醇的醇香味對酒的風(fēng)味具有一定的作用。

脂肪酸賦予酒酸味以及奶酪味，由表4可知，當(dāng)缺少所有脂肪酸（模型3）時無顯著性差異。但是缺少戊酸（模型3A）時具有極顯著性差異，因此可知戊酸對酒的香氣具有重要的作用。當(dāng)缺少3-甲基丁酸（模型3B）時無顯著性差異，由此可知它對酒的香氣并沒有重要作用。

當(dāng)缺少芳香族化合物（模型4）時無顯著性差異，可能是由于過多的酯類物質(zhì)掩蓋其芳香物質(zhì)所特有的香氣，所以不能被評價者識別出來。在GC-O過程中，苯甲醛賦予酒苦杏仁味并且具有一定的強(qiáng)度，因此對苯甲醛（模型5）做遺漏實驗，但只有3 個評估人員覺察到它的缺失，因此可知苯甲醛對酒的香氣并沒有重要的作用。

3 結(jié) 論

本研究采用液液萃取、GC-O時間強(qiáng)度法、AEDA結(jié)合OAV、香氣重組與遺漏/添加實驗的相關(guān)分析，對紅棗白蘭地中的香氣成分進(jìn)行分析。通過GC-MS與GC-O共同鑒定出63 種香氣化合物，其中包括酯類25 種、醇類14 種、酸類12 種、醛類5 種、酮類2 種、其他5 種。通過香氣強(qiáng)度實驗和AEDA實驗可以確定3-苯丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯具有較高的香氣強(qiáng)度和稀釋因子，它們對酒的整體香氣具有一定的貢獻(xiàn)。對香氣強(qiáng)度大于2的34 種香氣物質(zhì)進(jìn)行定量分析及OAV分析可知，2-甲基丁酸乙酯具有較高的OAV，其次是丁酸乙酯、戊酸乙酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯，它們共同賦予酒體水果香味。用OAV大于1的21 種香氣物質(zhì)進(jìn)行重組實驗，該重組實驗成功模擬紅棗白蘭地。通過香氣遺漏/添加實驗最終確定出辛酸乙酯是紅棗白蘭地中的特征香氣，其次是2-甲基丁酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、正丁醇、戊酸。通過感官組學(xué)方法研究紅棗白蘭地中的特征香氣成分，明確了特征香氣成分對紅棗白蘭地整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)，為紅棗白蘭地酒品質(zhì)的調(diào)控提供理論依據(jù)。