一步法微滴數(shù)字PCR檢 測生菜中GII型諾如病毒

陳嘉茵，方 苓，吳詩微，唐書澤，張志強，李 暉,*，吳希陽,*

（1.暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2.廣東省疾病預(yù)防控制中心病原微生物檢驗所，廣東 廣州 511430；3.香港中文大學生命科學學院食品及營養(yǎng)學部，香港）

食源性病毒疾病是一個正在受到關(guān)注的問題。在世界范圍內(nèi)，有大于50%的急性腸胃炎事件是由諾如病毒所造成[1]。諾如病毒是單鏈RNA病毒，由3 個閱讀框架（OF1、OF2與OF3）組成，并根據(jù)其基因組可以分為GI～GV 5 種基因型，而GI、GII和GIV對人類有感染性，其中導(dǎo)致世界性諾如病毒疫情爆發(fā)的基因型為GII[2-6]。諾如病毒最早在1972年被Kapikan等[7]所檢出，它具有感染劑量低、能忍受大范圍溫度變化等特點[8-9]。它主要傳播途徑為“糞—口”傳播，可通過人與人之間直接傳播，或接觸到被污染的水和食物而進行傳播[10]，常受到污染的食品有蔬菜、軟質(zhì)水果、貝類等[11-15]。

生菜作為飯桌上常見的生熟食均可的菜品，近年來人類為了追求健康，對蔬菜沙拉的需求增大，生吃生菜的人群逐漸增多，因受灌溉用水的潔凈度與廚工的安全衛(wèi)生意識水平影響，生食生菜使得人類的患病風險也在提高。2012年馬來西亞爆發(fā)了第一起感染源為生菜的諾如病毒疫情[16]。2010—2015年美國疾病預(yù)防與控制中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，因生菜原因造成的諾如病毒疫情達到93起，患病人數(shù)共2 028 人[17]。丹麥2016年也曾因輸入法國的染毒生菜導(dǎo)致1 個月內(nèi)就有23 起諾如病毒疫情爆發(fā)[18]。

目前諾如病毒的檢測方法有多種，主要分成3 部分：電鏡、免疫電鏡觀察法，免疫學檢測和核酸水平上的檢測方法。其中電鏡檢測結(jié)果受主觀因素影響較大（如電子顯微鏡質(zhì)量，操作者熟練程度等），同時靈敏度不高，不適用于爆發(fā)性疫情的大規(guī)模檢查[19]。酶聯(lián)免疫吸附測定主要針對諾如病毒的蛋白質(zhì)外殼進行檢測，但因病毒蛋白的變異性強，導(dǎo)致該方法敏感性，特異性較弱[8]。核酸水平上諾如病毒的檢測方法主要有逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法包括常規(guī)RT-PCR、多重RT-PCR、巢式PCR等及逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法，但RT-PCR法在電泳過程中容易出現(xiàn)交叉污染問題，造成假陽性結(jié)果[19]。多重RT-PCR盡管可以同時檢測多種目標分子，減少反應(yīng)時間，但其靈敏度較低，實驗條件較為苛刻，容易出現(xiàn)非特異性擴增，因此RT-PCR法大多作為定性分析及判別病毒基因型用[20]。目前RT-qPCR法是檢測諾如病毒的“金標準”，它具有特異性強，靈敏度較高的特點，可以對樣品中的病毒數(shù)量進行較為精確的定量[21-24]。然而在RT-qPCR檢測中，若樣品存在PCR抑制物，則會降低其靈敏度和準確性，易造成假陰性[23,25]。同時RT-qPCR法需要依賴Ct值和標準曲線的準確性才能對樣品進行定量分析，存在一定的不確定性[26]，難以檢測微小的拷貝數(shù)變化，靈敏度有限也是qPCR的一個缺點[27]。鑒于諾如病毒是一種高感染性病毒，在食品中的病毒量通常偏低，因此如何提高對諾如病毒檢測的靈敏度，建立可信的檢測方法，科學評估受感染食品的安全風險是一個急需解決的問題。

微滴數(shù)字聚合酶鏈式反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）是一種與qPCR不同的定量技術(shù)，相比qPCR，它有著不一樣的優(yōu)點。ddPCR對檢測目標的定量無需標準曲線，它是通過在反應(yīng)前將體系與微滴產(chǎn)生油混合，由微滴生成儀生成上萬個液滴，每個液滴中不包含或包含一個或數(shù)個目的核酸，而每個液滴可看作一個PCR，在反應(yīng)完畢后讀取儀將讀取液滴的熒光強度與液滴數(shù)目，根據(jù)泊松分布從而進行拷貝數(shù)定量的技術(shù)[28]。通過微滴的離散技術(shù)，它能減少樣品PCR抑制物對檢測的影響，從而提高了靈敏度和擴增效率，檢測可達個位拷貝數(shù)，適合用于檢測低濃度或抑制物含量高的樣品[29-30]。

本實驗建立一種快速、靈敏、準確檢測生菜中GII型諾如病毒（norovirus genegroup II，NoV GII）的RT-ddPCR方法，能檢測到低含量的病毒，為諾如病毒檢測提供了新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶油生菜（染毒用食品材料）購自廣州美思佰樂太陽新天地超市，并保存于4 ℃冰箱。

質(zhì)粒制備：Primescript One step RT-PCR kit ver.2（RR055A），TaKaRaMiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（9762），TaKaRaMiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 （9761）QuickCut? Kpn I（1618） 寶生物工程（大連）有限公司；pEASY-T1 Cloning Kit（CT101-01） 北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒（DP103） 天根生化科技（北京）有限公司。

病毒洗脫：T r i s/甘氨酸/牛肉浸膏緩沖液（TGBE）：Trisbase 12 g、甘氨酸 3.8 g、牛肉膏 10 g、無RNase超純水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值到9.5；4×聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）/NaCl溶液：PEG 8000 400 g、NaCl 69.6 g、無RNase超純水定容至 1 000 mL；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）：Na2HPO4·12H2O 1.15 g、 KH2PO40.2 g、NaCl 8 g、KCl 0.2 g、無RNase超純水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 7.3。以上溶液均經(jīng)高壓滅菌。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

病毒核酸提取：QIAamp viral RNA mini kit（52904）德國QIAGEN公司；RT-qPCR：One step primescript RT-PCR kit （Perfect Real Time）（RR086A） 寶生物工程（大連）有限公司；RT-ddPCR：One-step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes（186-4021）、RT-ddPCR Droplet Generation Oil（1863005）、RT-ddPCR Droplet Reader Oil （1863004）、Droplet Generator DG8 Cartndge （1864008）、Droplet Gene rator DG8 Gasket（1863009）、Droplet Generator Cartridge Holder（1863051）、Pierceable Foil Heat Seal（1814040）美國Bio-Rad公司；Twin.tec PCRPlate 96 德國Eppendorf公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QX200 Droplet Digital PCR System、PX1? PCR Plate Sealer、CFX96熒光定量PCR儀、C1000梯度PCR儀 美國Bio-Rad公司；X3FR超微量分光光度計、ST16R高速冷凍離心機 美國Thermo Scientific公司；SK-O180-Pro搖床美國Scilogex公司。

1.3 方法

1.3.1 陽性參照樣品的制備

經(jīng)測序確定為NoV GII的糞便標本，加入pH 7.0的PBS制成10%的便懸液，混勻，再用PBS依次稀釋至10－3并命名為高、中、低濃度（高濃度糞便樣本核酸經(jīng)RT-ddPCR測定值為1.70×104copies/μL，中濃度測定值為1 725 copies/μL，低濃度測定值為160 copies/μL），用于后續(xù)的食品染毒，每濃度留200 μL用于提取RNA。其中糞便標本及用于特異性檢測的常見腸道病毒核酸（GI型諾如病毒、札如病毒、輪狀病毒、星型病毒、腺病毒）均由廣東省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗所提供。

1.3.2 引物的設(shè)計與合成

按照Loisy中NoV GII的上游引物和探針序列及Kageyama中的NoV GII下游引物合成引物探針[31-32]，該引物探針是根據(jù)GenBank上登錄的Lordsdale病毒（登錄號x86557）中的5 012～5 100的位置設(shè)計，上游引物QNIF2：5’-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’；下游引物COG2R：5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’；探針QNIFs：5’-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-3’，探針5’端標記熒光報告集團FAM，3’端標記熒光淬滅基團為BHQ1，上述引物和探針均由上海閃晶公司合成及標記。

1.3.3 質(zhì)粒標準品的制備

利用熒光定量PCR檢測的引物對提取的RNA進行RT-PCR擴增，條件為50 ℃、30 min（逆轉(zhuǎn)錄），94 ℃、2 min（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶及激活聚合酶），94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)40 次，72 ℃、10 min（滅活酶）結(jié)束，目標長度為89 bp，將擴增產(chǎn)物通過凝膠電泳，切膠回收后按照質(zhì)粒制備試劑盒說明書進行操作。將制備成功的質(zhì)粒再用質(zhì)粒提取試劑盒提取，后用qPCR進行分析鑒定；將篩選的陽性重組質(zhì)粒測序。測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST分析，序列正確的陽性質(zhì)粒即為NoV GII的標準品。陽性標準品用限制性內(nèi)切酶Kpn I進行酶切，體系為：10 μL標準品，1 μL Kpn I酶，5 μL 10×QuickCut Buffer，用無RNase超純水補至50 μL，37 ℃孵育6 h。取5 μL產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，確認全部酶切完成后，用DNA產(chǎn)物回收試劑盒回收線性質(zhì)粒，并用超微量分光光度計進行定量讀數(shù)，計算出拷貝數(shù)后進行10 倍連續(xù)梯度稀釋，于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 樣品處理

食品染毒：將生菜每份25 g分裝，每份生菜中加入100 μL NoV GII陽性糞便染毒液，點狀涂布于菜葉表面約20 個點，并放于4 ℃干燥過夜以增加附著量，每個濃度做3 個重復(fù)，同時準備未染毒生菜樣品作為陰性對照。

病毒洗脫步驟（參考ISO/TS 15216-1∶2013[31]）：將生菜切成約2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm的小塊，裝入250 mL錐形瓶中，加入40 mL TGBE緩沖液，用錫紙蓋好瓶口。室溫250 r/min振蕩20 min。振蕩液轉(zhuǎn)移至離心管，4 ℃、10 000 r/min離心30 min。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，用1 mol/L的HCl溶液調(diào)pH 7.0。加入1/3體積的4×PEG 8000/NaCl溶液，使終質(zhì)量濃度達到100 g/L PEG 8000，0.3 mol/L NaCl。60 s搖勻，在4 ℃、100 r/min孵育60 min后4 ℃、10 000 r/min離心30 min。棄上清液，再4 ℃、10 000 r/min離心5 min，緊實沉淀并棄上清液。加入1 000 μL PBS進行沉淀重懸。將重懸后的懸浮液均分為2 份，其中一份加入等體積的氯仿-正丁醇溶液（1∶1，V/V），渦旋混合，室溫孵育5 min，于4 ℃、10 000 r/min離心15 min。轉(zhuǎn)移上層水相到新離心管中。將未經(jīng)氯仿-丁醇處理的懸浮液和處理后的富集液放于－20 ℃保存準備提取RNA。

1.3.5 病毒RNA 的提取

按QIAamp viral RNA mini kit提取方法操作說明書提取RNA，置于－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 RT-ddPCR體系優(yōu)化

RT-ddPCR體系（20 μL）：采用One-step RT-RT-ddPCR Advanced Kit for Probes試劑推薦的20 μL體系，以同一樣品的RNA核酸，分別對引物濃度（0.2～1.0 μmol/L）、探針濃度（0.05～0.5 μmol/L）、退火溫度（50～60 ℃）進行研究。根據(jù)信號讀取結(jié)果判斷最優(yōu)體系。

1.3.7 敏感性實驗

通過10 倍梯度稀釋的NoV GII線性陽性質(zhì)粒確定RT-ddPCR的檢測范圍。將連續(xù)梯度倍比稀釋好的陽性質(zhì)粒按照優(yōu)化后的RT-ddPCR條件進行反應(yīng)。使用SPSS 22.0（IBM軟件公司）對RT-ddPCR的標準曲線進行線性回歸分析。

1.3.8 特異性實驗

用該對引物和建立的RT-ddPCR方法對NoV GII、GI型諾如病毒、札如病毒、星狀病毒、輪狀病毒、腺病毒進行檢測，驗證該方法的特異性。

1.3.9 重復(fù)性實驗

為確定該反應(yīng)體系的重復(fù)性，對樣品進行組內(nèi)（n=5）以及組間（n=3）實驗。在3 周內(nèi)進行檢測，每周檢測一次，計算組內(nèi)與組間檢測結(jié)果的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），判斷該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.3.10 人工染毒樣品病毒回收率計算

利用本實驗建立RT-ddPCR方法分別對從不同染毒濃度蔬菜樣品處理后懸浮液所提取的病毒RNA連同用于染毒的不同濃度糞便樣本（高、中、低3 個水平）提取的病毒RNA進行檢測，同時將樣品通過RT-qPCR進行檢測，通過公式計算病毒回收率判斷更適合用于食品中病毒含量檢測的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理及圖像處理

實驗結(jié)果通過SPSS 22.0軟件采用雙因素方差分析法進行差異顯著性方差分析，同時圖像處理利用QX200 Droplet Digital PCR System提供的Quantasoft軟件（Bio-Rad）進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因片段的擴增及重組質(zhì)粒標準品的制備

采用RT-qPCR的上下游引物進行常規(guī)PCR，得到大約89 bp的目的片段。構(gòu)建的重組質(zhì)粒p-ng2標準品核苷酸測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，顯示其插入的基因片段為NoV GII.17，說明成功構(gòu)建了陽性標準品。標準品酶切后，經(jīng)超微量分光光度計測量濃度并換算得標準品拷貝數(shù)為8.47×109copies/μL。

2.2 RT-ddPCR條件的優(yōu)化

根據(jù)軟件在各濃度下檢測出的核酸拷貝數(shù)，最終選用終濃度為0.9 μmol/L的引物和0.35 μmol/L探針濃度，模板添加量為2 μL。最佳循環(huán)條件：逆轉(zhuǎn)錄42 ℃、60 min，95 ℃、10 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，95 ℃變性30 s，54 ℃退火及延伸1 min，45 個循環(huán)，98 ℃、10 min（滅活酶），爬坡速率為1 ℃/s。

2.3 RT-ddPCR的特異性

本實驗建立RT-ddPCR方法對NoV GII有典型擴增曲線，對其他病毒均無擴增，表明這對引物在這RT-ddPCR方法上特異性良好（圖1）。

圖1 RT-ddPCR NoV GII特異性實驗Fig. 1 Specificity of RT-ddPCR for NoV GII

2.4 RT-ddPCR的敏感性實驗

R T-d d P C R對低濃度的陽性質(zhì)粒p-n g 2有擴增，最低檢測限為2.12 copies/μL，最高檢測限為8.47×104copies/μL，濃度過高時液滴全部為陽性（8.47×105、8.47×106copies/μL），說明超過檢測上限（圖2）。將連續(xù)梯度稀釋好的陽性標準品進行RT-ddPCR分析，RT-ddPCR標準曲線的R2值為0.997 3，擴增效率為95.44%，表明RT-ddPCR具有良好的線性關(guān)系。

圖2 RT-ddPCR檢測NoV GII敏感性實驗Fig. 2 Sensitivity of RT-ddPCR for NoV GII

2.5 RT-ddPCR的重復(fù)性實驗

表1 一步法微滴數(shù)字RT-PCR檢測NoV GII重復(fù)性分析Table 1 Repeatability analysis of one-step RT-ddPCR detection of NoV GII

如表1所示，3 周內(nèi)組內(nèi)CV均小于4%，組間CV結(jié)果為1.75%，說明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 RT-ddPCR和RT-qPCR回收率計算結(jié)果

將樣品中提取的病毒RNA及各濃度染毒用糞便稀釋液中提取的病毒 RNA通過RT-ddPCR和RT-qPCR進行分析，計算病毒回收率，結(jié)果見表2。

表2 RT-qPCR與RT-ddPCR對不同染毒濃度和方法 回收率計算結(jié)果對比Table 2 Mean percentage recovery calculated for three inoculum levels of NoV GII detected by quantitative PCR and RT-ddPCR%

根據(jù)不同染毒濃度和處理辦法在兩種檢測儀器上得出的回收率數(shù)據(jù)在SPSS 22.0軟件中采用雙因素方差分析法進行Tukey差異顯著性方差分析，表2表明高、中濃度下，4 種檢測方法沒有顯著性差異。低濃度下，未經(jīng)氯仿處理的qPCR結(jié)果與另外3 種方法均存在顯著性差異（低濃度下方法1平均回收率僅1.43%，方法2平均回收率為9.71%，方法3平均回收率為11.80%，方法4平均回收率為12.53%，P＜0.05）。而各種濃度下，方法2、方法3、方法4之間沒有顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)有的RT-qPCR技術(shù)檢測NoV GII等食源性腸道病毒存在因樣品染毒濃度低，經(jīng)富集后仍難以檢測出的問題，反映出RT-qPCR靈敏度的局限性。同時也存在檢測過程中受抑制物影響而導(dǎo)致無法檢測的情況[25]。雖然RT-qPCR法具有步驟簡便節(jié)省時間等好處，但其自身因需要標準品制定標準曲線去判定樣品中目標基因的數(shù)量，容易因時間地點和抑制物的原因而導(dǎo)致結(jié)果的偏差[25]。本研究將檢測NoV GII的RT-qPCR引物探針運用到RT-ddPCR上，其擴增效率超過95%及良好的線性關(guān)系表明RT-ddPCR具有定量檢測實際樣品的潛力。它通過將反應(yīng)體系微滴化，再利用終點檢測的方法，盡量減少了抑制物對反應(yīng)體系的影響，能有效檢測低濃度的病毒量。本研究顯示RT-ddPCR最低檢測限為2.12 copies/μL，并且檢測方法顯示出了良好的重復(fù)性。

盡管病毒在蔬菜中不能繁殖，但如何從蔬菜樣品中有效富集和洗脫病毒，減少抑制物帶來的影響，提取出高純度的RNA，對后續(xù)的樣品檢測是不可或缺的。在ISO/TS 15216-1∶2013標準中，食品中諾如病毒RNA的提取方法里蔬菜不用像軟質(zhì)水果經(jīng)過氯仿-丁醇的去抑制物處理，猜測是因為相比較軟質(zhì)水果等容易在處理過程中釋放糖分果膠等PCR抑制物，而蔬菜中釋放的該類抑制物較少[23]。為去除生菜中可能含有的PCR抑制物，本實驗將懸浮沉淀后得到的懸浮液分為兩份并對其中一份進行氯仿-丁醇處理以對比處理前后抑制物對RT-qPCR與RT-ddPCR的影響。通過本實驗結(jié)果顯示，隨著病毒數(shù)量的減少，蔬菜中的葉酸、色素等抑制物百分比含量上升，利用氯仿-丁醇去除抑制物的步驟顯得愈發(fā)重要，對比RT-qPCR與RT-ddPCR的回收率結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，RT-ddPCR在存在抑制物的影響下，檢測結(jié)果與去除抑制物后的回收率相差不大，沒有顯著性差異，且較低濃度下檢測結(jié)果均值比去除抑制物后的RT-qPCR結(jié)果要高，說明RT-ddPCR能有效抵抗PCR抑制物對反應(yīng)的影響，能代替RT-qPCR進行日常食品樣品的檢測，且可以省略使用氯仿-丁醇去抑制物的步驟，節(jié)省時間同時有利于環(huán)境保護。

本實驗針對諾如病毒疫情爆發(fā)的元兇主要為NoV GII[2-6]，且蔬菜作為其病毒的有效載體的情況成功建立了一步法RT-ddPCR檢測蔬菜中NoV GII的方法。該方法特異性良好，避免了兩步法中可能出現(xiàn)的污染，節(jié)省了時間，同時測定了該方法的最低檢測限達到個位拷貝數(shù)，具有極高的靈敏度，為食品中諾如病毒量小難以檢測這一難題提供了可行的解決方法，更切實地保障了食品安全性。