醬香型白酒大曲和糟醅的細(xì)菌多樣性分析

戴奕杰，李宗軍*，田志強(qiáng)

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州 貴陽(yáng) 550016）

白酒是中國(guó)的傳統(tǒng)酒類，是世界六大蒸餾酒之一。其中，醬香型白酒以其“醬香突出、優(yōu)雅細(xì)膩、柔綿醇厚、回味悠長(zhǎng)”的獨(dú)特風(fēng)味，受到廣大消費(fèi)者的青睞，馳名中外[1-2]。研究者認(rèn)為，特殊的風(fēng)格離不開(kāi)獨(dú)特的釀造工藝和釀造方法：“四高二長(zhǎng)、一大一小”，即高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、貯存時(shí)間長(zhǎng)、大用曲量、多輪次（發(fā)酵）取酒，每一個(gè)環(huán)節(jié)在醬香酒的釀造生產(chǎn)中都是不可或缺的，時(shí)間以1 a為1 個(gè)生產(chǎn)周期[3-6]。

白酒中最重要且研究最多的微生物類群是細(xì)菌，其主要來(lái)自于高溫制曲和堆積工序。方心芳先生認(rèn)為，醬香白酒的典型-茅臺(tái)曲是一種細(xì)菌曲[7]。固態(tài)發(fā)酵的微生物變化及生化反應(yīng)主要發(fā)生在高溫制制曲、堆積發(fā)酵工序。高溫制曲中，細(xì)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，有90%以上的數(shù)量，以獲得所需香味物質(zhì)[3,8-9]。高溫堆積又網(wǎng)羅了空氣環(huán)境中的有益微生物，相當(dāng)于“二次制曲”[10-12]。細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物在高溫操作過(guò)程中強(qiáng)化了糟醅自身形成醬香的原動(dòng)力，促進(jìn)醬香物質(zhì)的進(jìn)一步生成，研究最多的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌被認(rèn)為是利用糖類和氨基酸促成美拉德反應(yīng)而大量產(chǎn)生呈香物質(zhì)[13]。窖池發(fā)酵是將前者的代謝產(chǎn)物進(jìn)行積累利用的過(guò)程，產(chǎn)酸細(xì)菌（乳酸菌、醋酸菌等）成為主力，產(chǎn)乙醇和二氧化碳的同時(shí)，也是酸類、酯類物質(zhì)（乳酸、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯等）形成的基礎(chǔ)[14]。

高溫大曲是優(yōu)質(zhì)醬香白酒重要的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑，具有原料易得、工藝簡(jiǎn)單、功能性強(qiáng)的特點(diǎn)[2]。大曲在白酒釀造中有著舉足輕重的作用，其中棲息著大量微生物種屬，如細(xì)菌、霉菌及酵母等[15]。微生物成為決定大曲品質(zhì)的核心因素。20世紀(jì)80年代后期，人們對(duì)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒的再認(rèn)識(shí)，使得大曲微生物的研究逐漸進(jìn)入高潮[16]。王忠彥[17]、施安輝[18]、廖建民[19]等利用傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法對(duì)大曲中的微生物進(jìn)行探索和研究，揭示了大曲微生物優(yōu)勢(shì)菌群的種屬分布，得到的微生物分為霉菌、細(xì)菌、酵母菌等，數(shù)量上以細(xì)菌菌群最多，霉菌次之，酵母菌則較少。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)于21世紀(jì)初運(yùn)用到大曲微生物的研究中，使人們可以更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)曲酒中的微生物。Chen Tingtao等[20]醬香酒大曲中的細(xì)菌主要有芽孢桿菌、乳酸細(xì)菌、醋酸細(xì)菌等，它們是酒曲蛋白酶和淀粉酶的重要來(lái)源，對(duì)后續(xù)發(fā)酵和風(fēng)味成型均具有重要影響[21]。

糟醅堆積發(fā)酵階段又稱為“二次制曲”[1,22]，在高溫環(huán)境下，高溫大曲的曲藥微生物能在糟醅上增殖、發(fā)酵，同時(shí)高溫堆積網(wǎng)羅、富集環(huán)境空氣中的微生物，生成醬香或醬香前體物質(zhì)，為入窖發(fā)酵創(chuàng)造條件[23-24]。在堆積過(guò)程中，細(xì)菌和霉菌數(shù)量減少，而酵母快速生長(zhǎng)，這一過(guò)程極大增加了酵母數(shù)量，使得窖池發(fā)酵正常進(jìn)行。窖池發(fā)酵階段是產(chǎn)酒的過(guò)程，此時(shí)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物數(shù)量下降，酵母和霉菌在發(fā)酵后期無(wú)法檢測(cè)到[25-26]。由于堆積溫度在50 ℃左右，極端釀造環(huán)境中的微生物多屬于中溫嗜熱菌[27]。其中，細(xì)菌以芽孢桿菌屬為主，包括地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、同時(shí)還有葡萄球菌屬、土壤桿菌屬等。正是由于醬香型白酒釀造過(guò)程中微生物的多樣性特點(diǎn)，共同推動(dòng)了產(chǎn)品生產(chǎn)的順利進(jìn)行，對(duì)醬香白酒品質(zhì)、風(fēng)味的形成具有重要作用。

Illumina HiSeq 2500測(cè)序系統(tǒng)采用pair-end邊合成邊測(cè)序技術(shù)，對(duì)環(huán)境微生物的分析已經(jīng)趨向成熟，相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中的菌種分類也更加全面具體。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)（HiSeq測(cè)序）及生物信息學(xué)方法，對(duì)大曲和糟醅樣本中的細(xì)菌多樣性分析，以期更全面地解析醬香型白酒釀造過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以及不同工藝階段菌群組成的差異[28]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 大曲樣本采集

本實(shí)驗(yàn)樣本是跟蹤醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)實(shí)地生產(chǎn)過(guò)程中，選取醬香高溫制曲3 個(gè)階段的曲塊，采用5 點(diǎn)取樣法：以曲塊對(duì)角線的中點(diǎn)作為中心抽樣點(diǎn)，再于對(duì)角線上選擇4 個(gè)與中心樣點(diǎn)距離相等的點(diǎn)作為抽樣點(diǎn)，5 個(gè)樣點(diǎn)取相同體積的曲塊。將上述采樣位點(diǎn)的樣品直接破碎并混勻后，分裝于無(wú)菌袋封裝標(biāo)記，于－80 ℃冰箱中保存。具體采樣信息見(jiàn)表1。

表1 高溫大曲樣本信息Table 1 Information about samples of high-temperature Daqu

1.1.2 糟醅樣本采集

表2 發(fā)酵釀酒糟醅樣本信息Table 2 Information about samples of fermented grains

按照傳統(tǒng)醬酒的釀造工藝，采用上述準(zhǔn)備的大曲，在酒廠進(jìn)行醬酒的釀造。選取整個(gè)醬香白酒發(fā)酵工藝的下沙、造沙和7 輪次發(fā)酵過(guò)程的高溫堆積、窖池發(fā)酵工序的糟醅，具體取樣時(shí)間如表2所示，采用如圖1、2中的位置對(duì)高溫堆積和窖池發(fā)酵糟醅進(jìn)行取樣，每個(gè)取樣的量保持一致。將每次取樣點(diǎn)糟醅直接混勻后分裝于無(wú)菌袋封裝標(biāo)記，于－80 ℃冰箱中保存。

圖1 高溫堆積過(guò)程取樣點(diǎn)位示意圖Fig. 1 Schematic diagram of sampling points during high-temperature stacking fermentation

圖2 窖池發(fā)酵糟醅取樣示意圖Fig. 2 Sampling points of fermented grains in the pit

1.1.3 試劑

DNA提取試劑盒 美國(guó)MP Biomedicals公司； HiSeq Rapid SBS Kit v2測(cè)序試劑盒（FC-402-4023 500 Cycle）及文庫(kù)構(gòu)建TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit（FC-121-3001/3003） 美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Qubit 2.0熒光定量?jī)x 美國(guó)Thermo Fisher公司；NanoVue系統(tǒng) 美國(guó)GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取7 g大曲和糟醅樣品，用20 mL滅菌后的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）懸浮，加入玻璃珠，旋渦振蕩5 min。300×g離心5 min，取上清液，沉淀用PBS重復(fù)洗滌3 次，離心后收集上清液。全部上清液于10 000×g離心15 min，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀。再用5 mL PBS洗3 次，每次以10 000×g離心15 min，收集沉淀。最后將沉淀重新懸浮于2 mL PBS中，－20 ℃保存[29]。

1.3.2 樣品DNA提取及16S rDNA測(cè)序分析

采用環(huán)境樣本D N A提取試劑盒進(jìn)行基因組D N A抽提后，使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。使用細(xì)菌的16S rDNA通用引物對(duì)樣品所提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，16S rDNA V4可變區(qū)引物515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）[30]。每個(gè)樣本進(jìn)行3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)PCR終止于線性擴(kuò)增期，PCR結(jié)束后將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)條件5 V/cm、20 min，使用OMEGA膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-EDTA緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。將PCR回收產(chǎn)物用Qubit 2.0或NanoVue系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。使用HiSeq Rapid SBS Kit v2測(cè)序試劑盒進(jìn)行測(cè)序。

1.4 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)于雙端測(cè)序得到的PE reads首先使用FLASH[31]進(jìn)行拼接，根據(jù)Barcode區(qū)分不同來(lái)源的樣本。對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控，在去除低質(zhì)量堿基及接頭污染序列等操作過(guò)程后完成數(shù)據(jù)過(guò)濾，得到可供后續(xù)分析的高質(zhì)量有效序列。

使用QIIME[32]等軟件在97%的相似性水平上利用UPARSE算法[33]進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）的聚類，并挑選出OTU的代表性序列。

使用Uchime[34]去除嵌合體，并采用Silva等數(shù)據(jù)庫(kù)[35]進(jìn)行物種分類信息的劃分，同時(shí)去除注釋為葉綠體、線粒體以及非細(xì)菌或古菌界的OTU。

使用PyNAST算法[36]對(duì)代表性序列進(jìn)行比對(duì)并過(guò)濾，然后使用FastTree[37]重構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。從OTU表中去除在進(jìn)化樹(shù)重構(gòu)建過(guò)程中被過(guò)濾掉的OTU，重抽樣OTU表使每個(gè)樣品具有相同的序列數(shù)。

基于上述結(jié)果在群落組成水平和系統(tǒng)發(fā)育水平上使用QIIME和R等軟件對(duì)樣本進(jìn)行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析和群落結(jié)構(gòu)的差異性分析等，在物種水平上進(jìn)行物種的差異分析和相關(guān)分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬香型白酒大曲的細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

使用UPARSE算法在97%的相似性水平上進(jìn)行OTU的聚類，篩選出OTU的代表性序列，并比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種分類信息的劃分。使用QIIME對(duì)樣本進(jìn)行Alpha多樣性分析，包括豐富程度等級(jí)（Rank-Abundance）曲線，以及以O(shè)bserved、Shannon及Chao1指數(shù)繪制的稀疏曲線。

Rank-Abundance曲線是分析多樣性的一種方式。構(gòu)建方法是統(tǒng)計(jì)單一樣本中，每個(gè)OTU所含的序列數(shù)，將OTU按豐度（所含有的序列條數(shù)）由大到小等級(jí)排序，再以O(shè)TU等級(jí)為橫坐標(biāo)，以累積序列豐度為縱坐標(biāo)作圖。Rank-Abundance曲線可用來(lái)解釋多樣性的兩個(gè)方面，即物種多度和物種均勻度。在水平方向，物種的多度由曲線的寬度來(lái)反映，物種的多度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀（平滑程度）反映了樣本中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。從圖3可看出，物種分布較為均勻。

圖3 大曲16S rDNA Rank-Abundance曲線Fig. 3 Rank-Abundance curves for bacterial 16S rDNA from Daqu

圖4 大曲16S rDNA多樣性指數(shù)分析Fig. 4 16S rDNA diversity analysis of bacteria from Daqu

稀疏曲線是從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體樣本，統(tǒng)計(jì)這些個(gè)體所代表的物種數(shù)目，以圖示反映樣本中物種的豐富程度。當(dāng)曲線趨于平緩時(shí)可認(rèn)為測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。樣本曲線的延伸終點(diǎn)的橫坐標(biāo)位置為該樣本的測(cè)序數(shù)量，如果曲線趨于平坦表明測(cè)序已趨于飽和，增加測(cè)序數(shù)據(jù)無(wú)法再找到更多的OTU；反之表明不飽和，增加數(shù)據(jù)量可以發(fā)現(xiàn)更多OTU。圖4結(jié)果顯示，高溫制曲階段，細(xì)菌的微生物豐富度較好，本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序量也能夠較好地反映出樣本內(nèi)的微生物信息。表3豐度指數(shù)顯示，隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，大曲的多樣性指數(shù)（Shannon：3.40）、分類OTU（Observed：360）、物種豐度指數(shù)（Chao1：581）均趨于穩(wěn)定。

表3 基于16S rDNA測(cè)序高溫大曲Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity indexes based on 16S rDNA sequencing of bacteria from high temperature Daqu

2.1.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

圖5 門(mén)分類水平上的細(xì)菌菌群Fig. 5 Bacterial community structure at phylum level

圖6 屬分類水平上的細(xì)菌菌群Fig. 6 Taxonomic analysis of bacteria at genus level

將每個(gè)OTU與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取置信度閾值，即相似度在97%以上的序列進(jìn)行物種分類，得到每個(gè)OTU的分類水平，即門(mén)、綱、目、科、屬分類水平。分析高溫制曲3 個(gè)時(shí)期樣本的細(xì)菌菌類，從圖5、6可以看出，高溫制曲階段，占據(jù)主導(dǎo)地位的細(xì)菌菌群為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）4 類菌門(mén)；隨著曲藥貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes的菌群數(shù)量逐漸下降，而Proteobacteria、Actinobacteria的數(shù)量則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，在大曲中共鑒定出18 個(gè)門(mén)167 個(gè)屬的細(xì)菌微生物。其中，優(yōu)勢(shì)菌屬有Clostridium sensu stricto1、Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Mycoplasma、Citrobacter等，諸如Escherichia-Shigella、Actinobacillus、Bifidobacterium、Citrobacter等細(xì)菌隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，Clostridium sensu stricto1、Mycoplasma等表現(xiàn)為先上升后下降，而Lactobacillus、Peptoclostridium等無(wú)明顯變化，Streptococcus等細(xì)菌呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。高溫制曲階段，由于高溫條件下，保留大量的嗜熱性細(xì)菌，研究者認(rèn)為醬香物質(zhì)是來(lái)源于曲藥，即高溫制曲產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)中梭菌屬、芽孢桿菌、乳酸菌等占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，它們能夠分泌蛋白酶、淀粉酶等水解原料，產(chǎn)生發(fā)酵性糖和氨基酸，為發(fā)酵釀酒過(guò)程中美拉德反應(yīng)的進(jìn)行提供大量原料。

2.2 醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中糟醅的細(xì)菌多樣性分析

2.2.1 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

圖7 糟醅16S rDNA多樣性指數(shù)分析Fig. 7 16S rDNA diversity analysis of bacteria from fermented grains

傳統(tǒng)的白酒釀造是開(kāi)放式-半開(kāi)放式的生產(chǎn)，環(huán)境空氣、車間、工具、發(fā)酵設(shè)備、參與人員等都附著著豐富的微生物群，通過(guò)不斷的生長(zhǎng)繁殖進(jìn)入到糟醅之中，因此，堆積發(fā)酵也有“二次制曲”之稱。分析“四高”中的高溫堆積和窖池發(fā)酵階段細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)，從下沙環(huán)節(jié)開(kāi)始到第7輪次酒起窖為止，共采集16 個(gè)糟醅樣本進(jìn)行測(cè)序分析，圖7結(jié)果顯示，堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵階段，曲線較為平緩，說(shuō)明細(xì)菌的微生物分布均勻且物種組成豐富。表4與圖8顯示，OTU個(gè)數(shù)均達(dá)270以上；隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，發(fā)酵過(guò)程的多樣性指數(shù)（Shannon）除了第3輪次下窖樣本較低，其他樣本均在3.0以上；物種豐度指數(shù)（Chao1）基本呈現(xiàn)堆積發(fā)酵（下窖）樣本低，窖池發(fā)酵（起窖）樣本高的變化。

表4 基于16S rDNA測(cè)序糟醅Alpha多樣性指數(shù)Table 4 Alpha diversity indexes based on 16S rDNA sequencing of bacteria from fermented grains

圖8 糟醅16S rDNA多樣性指數(shù)分析Fig. 8 16S rDNA diversity analysis of bacteria from fermented grains

2.2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

從圖9、10可看出，發(fā)酵時(shí)期，占據(jù)主導(dǎo)地位的細(xì)菌菌群為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes 4 類；隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，F(xiàn)irmicutes前期下降，中期從第2輪次起窖開(kāi)始菌類上升，后期的第6輪次起窖種類下降，其中，第3輪次下窖占比達(dá)到最高值（0.817 851 959）、第4輪次起窖最低（0.400 217 707）；Proteobacteria變化趨勢(shì)與前者相反；Actinobacteria、Bacteroidetes則無(wú)明顯變化規(guī)律。對(duì)OTU分類結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，發(fā)酵階段共鑒定出22 個(gè)門(mén)和221 個(gè)屬，相對(duì)豐度較高菌屬為：Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Clostridium sensu stricto1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter等。糟醅細(xì)菌中Escherichia-Shigella、Lactobacillus在發(fā)酵前期菌數(shù)先升高，中期從第2輪次開(kāi)始下降，第3輪次下窖時(shí)達(dá)到最低，后期逐漸上升。Clostridium sensu stricto1、Streptococcus菌群豐度變化規(guī)律復(fù)雜，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，值得一提的是Clostridium sensu stricto1菌種在第3輪次下窖時(shí)達(dá)到最高。Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter雖占比不及前三者，但變化較為穩(wěn)定。

發(fā)酵釀酒過(guò)程分為高溫堆積和窖池發(fā)酵兩部分：高溫堆積階段將糧醅或蒸餾后的糟醅在晾堂攤涼、拌曲后堆成的圓堆，進(jìn)行堆積發(fā)酵至頂溫；窖池發(fā)酵是加入曲的糧糟在窖池內(nèi)糖化，依賴于窖池中各種微生物群落的功能和作用完成釀造過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵釀酒工藝中，細(xì)菌微生物相對(duì)豐度較高，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌Escherichia-Shigella、Lactobacillus隨輪次的增加，表現(xiàn)為前期堆積發(fā)酵（下窖）高、窖池發(fā)酵（起窖）低，后期窖池發(fā)酵（起窖）高的變化趨勢(shì)；而Clostridium sensu stricto1、Streptococcus等表現(xiàn)相反變化；說(shuō)明部分芽孢桿菌屬及乳桿菌屬在窖泥種代謝旺盛，為下窖提供前體物質(zhì)，并影響著輪次酒的風(fēng)格形成。

圖9 門(mén)分類水平上的細(xì)菌菌群Fig. 9 Bacterial community structure at phylum level

圖10 屬分類水平上的細(xì)菌菌群Fig. 10 Bacterial community structure at genus level

2.3 大曲和糟醅的細(xì)菌多樣性比較

圖11 屬分類水平細(xì)菌的豐度類群熱圖Fig. 11 Heat map of relative abundance of bacteria at genus level

特定的生產(chǎn)工藝導(dǎo)致了特定的微生物組成和動(dòng)態(tài)變化，由于高溫制曲和堆積發(fā)酵時(shí)期存在的微生物群落存在差異，其中物質(zhì)代謝、能量代謝的結(jié)果也有所不同，導(dǎo)致了醬香型白酒特征風(fēng)味的差異。本節(jié)針對(duì)大曲和糟醅中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，包括聚類分析、韋恩分析、網(wǎng)絡(luò)Network分析，以期了解其中優(yōu)勢(shì)菌類的差異性和不同時(shí)期細(xì)菌微生物間的相互作用。

從圖11可知，無(wú)論是高溫制曲時(shí)期還是發(fā)酵時(shí)期，占據(jù)主導(dǎo)地位的細(xì)菌菌群為Firmicutes，其中占比較多的屬是Clostridium sensu stricto1、Lactobacillus、Streptococcus；其次是變形菌門(mén)Proteobacteria，其中占比較多的屬是Escherichia-Shigella、Actinobacillus；然后是放線菌門(mén)Actinobacteria，其中Bifidobacterium占比最多。另外，豐度較低的細(xì)菌菌類中Mycoplasma、Sarcina、Staphylococcus在大曲中的豐度高于糟醅，Citrobacter、Turicibacter、Enterobacter、Prevotella9在大曲中的豐度低于糟醅樣本。

圖12 樣本OTU韋恩圖Fig. 12 Wayne diagram for bacterial OTUs from Daqu and fermented grains

圖12 顯示，大曲和糟醅的OTU中有98.66%的序列占比形成交集，而糟醅有342 個(gè)OTU獨(dú)有，相比之下，大曲只有28 個(gè)OTU獨(dú)有。

3 結(jié) 論

通過(guò)采集大曲和糟醅不同發(fā)酵時(shí)間的樣本，提取細(xì)菌DNA并根據(jù)16S rDNA V4多變區(qū)序列的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后利用Illumina HiSeq 2500測(cè)序技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序。得到的測(cè)序數(shù)據(jù)使用生物信息學(xué)方法進(jìn)行微生物多樣性分析，包括OTU、Alpha多樣性分析、群落組成分析等。結(jié)果顯示：醬香型白酒的高溫制曲、堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵的微生物菌群在數(shù)量及結(jié)構(gòu)分布上具有多樣性，菌群種類基本一致。兩個(gè)階段的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes 4 類。隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，各輪次酒糟醅中微生物群落呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律，大曲樣本的細(xì)菌菌類變化與貯存時(shí)間有關(guān)，而糟醅微生物隨窖內(nèi)發(fā)酵及高溫堆積的工藝而不斷變化。隨著溫度和水分達(dá)到相對(duì)平衡，細(xì)菌群落也逐漸得到了調(diào)整，形成單一菌類為主導(dǎo)的環(huán)境，更有利于醬香型白酒的釀造。

制曲和制酒階段的生態(tài)環(huán)境之間存在差異，導(dǎo)致微生物優(yōu)勢(shì)菌不同：大曲相對(duì)豐度較高的菌屬為Clostridium sensu stricto 1、Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Mycoplasma、Citrobacter等。糟醅的優(yōu)勢(shì)菌屬為Escherichia-Shigella、Lactobacillus、Clostridium sensu stricto 1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter。韋恩分析顯示，2 個(gè)階段的微生物菌落既有交集也有各自特有的菌類，結(jié)合熱圖比較發(fā)現(xiàn)，存在一些細(xì)菌菌類豐度上的差異，如Mycoplasma、Sarcina、Staphylococcus在大曲中的豐度高于糟醅，檸檬酸桿菌屬Citrobacter、Turicibacter、Enterobacter、Prevotella 9低于糟醅樣本。