臨澤小棗粗多糖提取動力學(xué)模型建立及結(jié)構(gòu)特征分析

徐 也，劉曉風(fēng)*，王永剛，任海偉，劉繼超，張 璇，范文廣，楊明俊

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050）

紅棗（Ziziphus jujuba Mill.），又名華棗、刺棗、良棗，主要分布于我國黃河流域，具有悠久的栽培歷史。是鼠李科（Rhamnaceae）植物棗屬（Zizyphus Mill.）的成熟果實，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]?！对娊?jīng)》中將棗列為“五果”之一[3]，其含有低聚糖、多糖、生物堿、皂苷、黃酮等多種活性物質(zhì)[4]。近年來，關(guān)于紅棗多糖的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)特性和藥理活性的報道越來越多。陳國梁等[5]采用Sevag法、三氯乙酸法和鞣酸法對醇沉所得粗多糖進(jìn)行脫蛋白，結(jié)果顯示，Sevag法脫蛋白效果明顯，但多糖損失較多，三氯乙酸法多糖損失率小但脫蛋白效果稍次。李進(jìn)偉等[6]將金絲小棗粗多糖經(jīng)DEAE-Sepharose-6B柱純化后得到4 個組分，多糖回收率達(dá)83.1%。斯琴格日樂等[7]采用正交試驗法優(yōu)化了鄭新紅棗多糖超聲波提取工藝。Wang Cuntang等[8]研究發(fā)現(xiàn)冬棗多糖可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞體積變大、數(shù)量增多，具有較強的免疫學(xué)活性。而且馮艷風(fēng)[9]發(fā)現(xiàn)大棗粗多糖能通過內(nèi)源性凝血系統(tǒng)發(fā)揮作用，顯著延長人體血漿的活化部分凝血活酶時間，而對凝血酶時間、凝血酶原時間均無明顯影響，且該過程與濃度呈量效關(guān)系。紅棗多糖作為中藥制劑的有效成分之一，其提取工藝以及動力學(xué)研究在中藥制劑生產(chǎn)中尤為重要。目前已經(jīng)有很多關(guān)于中藥活性物質(zhì)動力學(xué)模型的研究，如膜理論、非穩(wěn)態(tài)理論和Ponomaryov經(jīng)驗式等[10-11]，為闡述中藥活性成分提取過程的微觀機理以及工業(yè)生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

臨澤小棗主產(chǎn)于甘肅省張掖市臨澤縣，受氣候干燥和晝夜溫差等氣候條件的影響，具有棗果棗核小、肉質(zhì)致密、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高（72%～80%）等特點。因此具有工業(yè)可加工性強、適宜規(guī)?；崛〉葍?yōu)點。本實驗以臨澤小棗為研究對象，基于Fick第一定律建立了臨澤紅棗多糖（Lingze jujube polysacchride，LZJP）傳質(zhì)動力學(xué)模型，并通過傅里葉變換紅外光譜、原子力顯微鏡和掃描電子顯微鏡對LZJP官能團(tuán)和表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，以期進(jìn)一步完善LZJP提取動力學(xué)的基礎(chǔ)研究，并為其粗多糖的規(guī)模化提取、精深加工和高附加值產(chǎn)品的開發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臨澤小棗由甘肅澤園農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

苯酚、無水乙醇和葡萄糖等（均為分析純） 萊陽市雙雙化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPX-9162MB數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-VIS Carry50紫外-可見分光光度計美國Varian公司；FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；AB104-N分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋北京科偉永興儀器有限公司；Nexus 670傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司；JSM-5600LV掃描電子顯微鏡 日本電子光學(xué)公司。

1.3 方法

1.3.1 紅棗多糖提取及質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

準(zhǔn)確稱量5.00 g棗粉于100 mL的磨口三角瓶中，加一定比例的水，水浴回流浸提一定時間，過濾殘渣，加入終體積分?jǐn)?shù)為80%的無水乙醇，4 ℃過夜，5 000 r/min離心獲得沉淀。分別經(jīng)蒸餾水溶解、Sevag法除去蛋白[12]、水相部分冷凍干燥，最終得到LZJP。

采用苯酚-硫酸法[13-14]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，多糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到y(tǒng)＝1.379x－0.048，線性范圍為0.15～0.8 mg/mL，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 6。吸取2 mL粗多糖溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖質(zhì)量濃度，按照式（1）計算多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中：ρ為樣液中多糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為樣液體積/mL；D為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.2 多糖提取動力學(xué)分析

本實驗以紅棗為提取對象，以水為溶劑，分析紅棗多糖提取的動力學(xué)過程。提取過程主要包括溶劑浸潤、內(nèi)擴(kuò)散和外擴(kuò)散3 個過程[15-17]。其中，內(nèi)擴(kuò)散為限速關(guān)鍵步驟[18]。假定顆粒內(nèi)多糖分布均勻，擴(kuò)散系數(shù)恒定且均相溫度不變[19]。根據(jù)Fick第一定律，在某一時刻通過界面的多糖傳質(zhì)通量按式（2）表示。

式中：ρ0為紅棗顆粒中心部位多糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ1為顆粒表面多糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ為溶劑中多糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；δ為擴(kuò)散邊界層厚度/m；J為多糖傳質(zhì)通量/（mg/min）；D為紅棗顆粒半徑/m；DS為顆粒內(nèi)多糖的擴(kuò)散系數(shù)/（m2/s）；DL為溶劑中多糖的擴(kuò)散系數(shù)/（m2/s）；V為溶劑體積/mL；A為兩相界面積/m2，負(fù)號表示多糖傳質(zhì)方向與質(zhì)量濃度梯度方向相反。整理得公式（3）。

由式（3）可看出多糖擴(kuò)散速率d（Vρ）/dt與其質(zhì)量濃度梯度dρ/dδ和兩相界面積A成正比。

假定某一時刻dρ/dδ隨時間的遞減速率與質(zhì)量濃度梯度成正比[20]，則可得式（4）。

式中：k為比例常數(shù)，表示多糖的表觀擴(kuò)散速率常數(shù)，受多糖物性、提取條件和顆粒大小等因素決定。記初始多糖質(zhì)量濃度為ρ0，積分得式（5）和（6）。

假定紅棗質(zhì)量為m/g；溶劑體積與紅棗的質(zhì)量比為M/（mL/g）；飽和吸溶劑率為P/（mL/g）。故提取液體積可按式（7）計算。

設(shè)紅棗顆粒密度為ρ；A0為單個顆粒擴(kuò)散面積/m2。則m/g紅棗樣品所含顆粒數(shù)n與顆?？倲U(kuò)散面積A可按為式（8）和式（9）表示。

由式（6）、（7）、（9）得式（10）。

當(dāng)多糖提取達(dá)到平衡時，t→∞、ρ＝ρ∞，則得到式（11）。

合并整理取對數(shù)得式（12）和式（13）。

式（10）與式（13）即為紅棗多糖的提取動力學(xué)模型，該模型表征了紅棗顆粒大小、料液比、提取時間及溫度等因素與多糖質(zhì)量濃度之間的關(guān)系。

1.3.3 多糖理化性質(zhì)檢測

分別將粗多糖溶解在不同的溶劑（熱水、冷水、無水乙醇、甲醇、丙酮）中，觀察其溶解性；并將臨澤小棗粗多糖溶液分別進(jìn)行苯酚-硫酸反應(yīng)、碘-碘化鉀反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)和Fehling試劑反應(yīng)[20]，觀察反應(yīng)前后的溶液的顏色變化。采用考馬斯亮藍(lán)法[21]、硫酸-咔唑法[22]及硫酸鋇比濁[23]分別測定多糖溶液中蛋白質(zhì)、糖醛酸和硫酸基的含量。

1.3.4 多糖分離純化

1.3.4.1 離子交換柱純化

將多糖樣品配制成10 mg/mL的溶液。將溶液緩慢加到已平衡好的DEAE-52纖維素柱中。依次用蒸餾水及0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為1 mL/min，自動部分收集器收集洗脫液，每管收集5 mL；用苯酚-硫酸法于484 nm波長處跟蹤測定每管中多糖含量，繪制多糖洗脫分布圖，選取最佳洗脫峰段收集、合并相同梯度樣品溶液，經(jīng)過減壓旋蒸濃縮、透析脫鹽、冷凍干燥得到純化多糖粉末。

1.3.4.2 凝膠柱純化

將纖維素柱純化后的多糖組分，溶解后加入平衡過的Sephadex G-100色譜柱中，超純水洗脫，自動部分收集器收集，流速0.8 mL/min，每個組分收集60 管，每管收集5 mL。并繪制多糖的洗脫分布圖，分別收集不同的洗脫峰，經(jīng)合并、濃縮和冷凍干燥，得到純多糖粉末。

1.3.5 多糖結(jié)構(gòu)分析

1.3.5.1 傅里葉變換紅外光譜分析

稱取1 mg干燥的LZJP與KBr粉末于研缽中研磨混合均勻，壓成薄片，在波數(shù)4 000～400 cm－1范圍內(nèi)利用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行光譜掃描[24]，分辨率為0.09 cm－1。

1.3.5.2 原子力顯微鏡觀察

采用蓋玻片作為原子力顯微鏡測試的基底，分別用丙酮、無水乙醇將蓋玻片在超聲波清洗儀中超聲洗滌10 min，用氮氣將蓋玻片吹干，待用。將1.0 mg/L多糖溶液均勻涂布于蓋玻片表面，自然晾干，室溫干燥，放置于原子力顯微鏡上對其分子形態(tài)進(jìn)行掃描觀測。圖像均在contact模式下獲得，探針為Si3N4（微懸臂長200 μm、彈性系數(shù)0.12 N/m），原子力顯微鏡圖像的形態(tài)學(xué)特征（如高度、寬度等）均采用原子力顯微鏡附帶的軟件進(jìn)行分析[25]。

1.3.5.3 掃描電子顯微鏡觀察

多糖粉末經(jīng)鍍膜，以10 Pa的真空度，15 mA的離子電流鍍金160 s并拍照，觀察多糖表面的顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)[26]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，且標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過5%；采用Origin 8.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 動力學(xué)模型的建立

2.1.1 速率常數(shù)求解

不同提取溫度和料液比下，提取液中多糖質(zhì)量濃度隨時間變化分別如表1、2所示。由表1可得出，多糖溶出速率隨提取溫度的升高和時間的增加而逐漸加快。當(dāng)提取溫度達(dá)到353 K（80 ℃）時，多糖溶出速率逐漸減小，提取溫度達(dá)到358 K（85 ℃）時，多糖溶出速率基本保持不變。在相同提取溫度下，提取時間達(dá)到90 min后，多糖溶出速率逐漸減慢，當(dāng)提取時間達(dá)到105 min后，多糖質(zhì)量濃度趨于平衡。同理，由表2可得，在同一溫度下，多糖溶出速率隨料液比增加而增大；在不同的料液比下，提取一定的時間，料液比達(dá)到1∶20時，多糖溶出速率逐漸減小；當(dāng)料液比為1∶22.5時，多糖溶出速率基本保持不變。在對應(yīng)的料液比下，提取時間達(dá)到90 min后，多糖溶出速率逐漸減慢，在105 min時提取液多糖質(zhì)量濃度趨于平衡。因此，取120 min 時的多糖質(zhì)量濃度作為平衡濃度。

表1 不同溫度下提取液中多糖質(zhì)量濃度Table1 Concentrations of polysaccharides extracted at different temperatures mg/mL

表2 不同料液比下提取液中多糖質(zhì)量濃度Table2 Concentrations of polysaccharides extracted at different solid to solvent ratios mg/mL

圖1 ln（ρ∞/（ρ∞－ρ））與時間的關(guān)系圖Fig.1 Relationship between ln(ρ∞/(ρ∞?ρ)) and time

表3 不同溫度下ln（ρ∞/（ρ∞－ρ））與時間的回歸方差Table3 Regression equations between ln(ρ∞/(ρ∞?ρ)) and time at different temperatures

表4 不同料液比下ln（ρ∞/（ρ∞－ρ））與時間的回歸方程Table4 Regression equations between ln(ρ∞/(ρ∞?ρ)) and time at different solid to solvent ratios

由圖1和表3、4可知，在不同料液比和提取溫度下，擬合方程的線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.89，則表明ln（ρ∞/（ρ∞－ρ））與t之間線性關(guān)系性良好。表觀速率常數(shù)隨溫度升高而增大，表明高溫能夠加速紅棗多糖的溶出；同樣，隨著料液比的增加，表觀速率常數(shù)增大。當(dāng)料液比低于1∶25時，表觀速率常數(shù)增加不顯著，可能由于溶劑用量太少，不足以將溶質(zhì)中多糖完全溶出。

2.1.2 相對萃余率求解

假定ρ0為紅棗顆粒未經(jīng)水浸泡提取時質(zhì)量濃度，則ρ0＝0，可設(shè)相對萃余率y＝（ρ∞－ρ）/ρ∞，于是式（12）變?yōu)閥＝exp（－kt）。利用表1和表2的數(shù)據(jù)，以y為縱坐標(biāo)，提取時間t為橫坐標(biāo)作圖（圖2A、B）。圖中各曲線擬合回歸方程和對應(yīng)的速率常數(shù)分別見表5、6，可以看出，在不同溫度及料液比下，提取的擬合方程相關(guān)系數(shù)均在0.92以上，曲線有一定的擬合度良好，所以紅棗多糖的熱水提取過程比較符合指數(shù)模型。

由圖2A、B可知，隨著提取時間的延長，多糖相對萃余率呈指數(shù)趨勢下降，則適當(dāng)延長提取時間有利于多糖完全浸出。在不同溫度下提取一定時間，隨著溫度升高，相對萃余率逐漸減小，當(dāng)提取溫度達(dá)358 K時，曲線斜率達(dá)到最大值，即提取速率達(dá)到最大。同理，在不同料液比下提取一定時間，隨著料液比的增加，多糖相對萃余率不斷下降，而料液比為1∶25時，萃余率出現(xiàn)回升，可能是由于料液比太大，導(dǎo)致后續(xù)的濃縮和沉淀工藝難度加大，說明多糖溶出量已達(dá)到飽和，這可能是溶劑用量增加導(dǎo)致原料的物質(zhì)分子間相互作用[27]，不利于紅棗多糖溶出。

圖2 相對萃余率與時間的關(guān)系Fig.2 Relationship between relative extraction rate and time

表5 不同溫度下多糖相對萃余率對時間的回歸方程Table5 Linear regression of relative extraction rate of LZJP against time at different temperatures

表6 不同料液比下多糖相對萃余率對時間的回歸方程Table6 Linear regression of relative extraction rate of LZJP against time at different solid to solvent ratios

2.1.3 活化能

由化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)可知，多糖提取的表觀速率常數(shù)與溫度遵循Arrhenius公式。利用表1、3中的數(shù)據(jù)對ln k和1/T作圖，結(jié)果見圖3。ln k與1/T線性關(guān)系較好（R2＝0.945 6）。根據(jù)回歸方程計算得到紅棗粗多糖熱水法提取過程中的活化能為19.266 kJ/mol。說明紅棗多糖分子浸出需要能量較低，整個提取過程反應(yīng)速率較快。由此表明采用熱水提取法可以有效提取紅棗粗多糖。

圖3 ln k與1/T關(guān)系圖Fig.3 Relationship between ln k and 1/T

2.1.4 半衰期

由t1/2＝ln（2/k）對溫度T作圖，得到圖4。由此可以計算出在最適提取溫度下，提取出一半紅棗多糖所需的時間。半衰期反應(yīng)了提取的效率，半衰期越小提取速率越快。由圖4可看出，隨著溫度的升高，其半衰期不斷減小，且與之成反比，故升高溫度有利于紅棗多糖提取。

圖4 t1/2與溫度的關(guān)系Fig.4 Relationship between t1/2 and temperature

2.2 多糖理化性質(zhì)

粗多糖干品呈現(xiàn)棕黃色、無味、易溶于熱水，可溶于冷水，但不溶于無水乙醇、甲醇、丙酮等有機溶劑。多糖溶液的苯酚-硫酸反應(yīng)呈棕紅色，表明樣品具有糖類化合物的特征；茚三酮反應(yīng)呈陽性，證明樣品中含有游離氨基酸；Fehling試劑反應(yīng)結(jié)果呈陰性，說明不含游離還原糖；碘-碘化鉀反應(yīng)呈陰性，表明該樣品為非淀粉類糖。提取物中的粗多糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)和硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為65.53%、27.47%、0.13%和2.68%。

2.3 多糖分離純化

將10 mg/mL的臨澤小棗粗多糖溶液分別用蒸餾水和NaCl洗脫，苯酚-硫酸法示蹤，繪制洗脫曲線，如圖5所示，共得到4 個峰，第1峰為水洗脫峰（水相），合并試管中的溶液，命名為LZJP1，回收率為6.4%；第2個峰為0.1 mol/L NaCl洗脫峰（鹽相），回收率為4.4%，記為LZJP2；第3個峰為0.3 mol/L NaCl洗脫峰（鹽相），回收率為51%，記為LZJP3；第4個峰為0.5 mol/L NaCl洗脫峰（鹽相），回收率為3.8%，記為LZJP4。其中第3、4個峰峰形挺拔，且第3個組分回收率較高。將酸性多糖LZJP3和LZJP4經(jīng)透析、減壓濃縮、乙醇沉淀、冷凍干燥后進(jìn)行凝膠柱純化。LZJP3和LZJP4的Sephadex-100凝膠柱層析均有一個峰（圖6），則說明LZJP3、LZJP4都為單一的多糖組分，其回收率分別為81.7%和89.2%。

圖5 DEAE-52洗脫曲線Fig.5 Elution prof i le of LZJP on DEAE-52 cellulose column

圖6 LZJP3（A）與LZJP4（B）Sephadex G-100凝膠柱層析Fig.6 Elution prof i les of LZJP3 (A) and LZJP4 (B) on Sephadex G-100 column

2.4 多糖組分及結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜顯示4 000～600 cm－1呈多糖類物質(zhì)的特征吸收峰。3 500～3 000 cm－1的特征峰是由分子間或分子內(nèi)的OüH的伸縮振動引起的；如圖7A所示，在3 438 cm－1處有強吸收峰，則LZJP3中存在分子間或分子內(nèi)氫鍵；2 931 cm－1是糖類CüH（—CH2）的伸縮振動峰；1 743 cm－1處有一明顯吸收峰，是醛基吸收峰，初步判斷該糖上含有乙酰基；1 623 cm－1是－COOH的C＝O吸收峰；1 400～1 200 cm－1處存在3 個吸收峰，這些吸收峰是CüH的變角振動；1 103 cm－1處有一明顯吸收峰，該吸收峰為C－O鍵伸縮振動吸收峰；1 103、1 049 cm－1和1 016 cm－1處有3 個吸收峰，為吡喃糖苷的特征吸收峰；914 cm－1處為D-吡喃型葡萄糖的特征峰[28]。因此可推斷該多糖為一種吡喃多糖。同樣，圖7B中，在3 425 cm－1處有強烈的吸收峰，則說明LZJP4中也存在分子間或分子內(nèi)氫鍵；1 637 cm－1為C＝O的吸收峰，1 342 cm－1為糖類CüH振角變動，885 cm－1是β-吡喃環(huán)CüH的彎曲振動特征峰[29]，上述結(jié)果表明，LZJP3與LZJP4均為酸性多糖，且都為β-吡喃型多糖。

圖7 LZJP3（A）與LZJP4（B）的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.7 Fourier transform infrared spectra of LZJP3 (A) and LZJP4 (B)

2.4.2 多糖表面結(jié)構(gòu)的觀察

當(dāng)分辨率為50 μm時，LZJP3和LZJP4掃描電子顯微鏡結(jié)果如圖8所示。LZJP3多糖呈片狀，表面形貌光滑但有破損（圖8A），LZJP4為分枝狀，表面呈現(xiàn)出干燥的褶皺狀（圖8B）。LZJP3與LZJP4在相同的視場范圍（5 μm×5 μm）內(nèi)獲得的原子力顯微圖像稍有差異（圖9）。LZJP3分子排列疏松，且大小形狀均一（圖9A），而LZJP4有少量的分子球狀聚集體和大量的分散體，大小不均勻（圖9B）。由圖9A2、B2可知，LZJP3多糖的高度為117.19 nm，寬度為7.753 nm，LZJP4多糖的高度為117.19 nm，長度為7.750 nm。一個多糖分子的高度為0.3 nm，因此，LZJP3與LZJP4多糖分子的大小遠(yuǎn)高于多糖單鏈直徑的理論值（0.1～1.0 nm）[30]，可能是由于多糖分子間范德瓦耳斯力相互作用以及糖鏈間氫鍵締合所致。

圖8 掃描電子顯微鏡下LZJP3（A）與LZJP4（B）微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)Fig.8 Scanning electron microscopic photographs of LZJP3 (A)and LZJP4 (B)

圖9 LZJP3（A）與LZJP4（B）原子力顯微鏡掃描結(jié)果Fig.9 Atomic force microscopic photographs of LZJP3 (A) and LZJP4 (B)

3 結(jié) 論

以Fick第一定律為基礎(chǔ)，建立了紅棗多糖提取動力學(xué)模型，求得不同溫度或料液比下的速率常數(shù)、相對萃余率、活化能和半衰期等關(guān)鍵動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示實驗數(shù)據(jù)與動力學(xué)模型計算值良好吻合，整個提取過程較為容易進(jìn)行。

LZJP具有糖類化合物的特征，樣品中仍有少量游離的氨基酸和蛋白質(zhì)分子基團(tuán)，且LZJP是一種多糖，不是淀粉類物質(zhì)。LZJP經(jīng)過離子交換柱DEAE-52分離純化，得到4 個峰，其中LZJP3和LZJP4為主要單一多糖，回收率分別為81.7%和89.2%，均為淺黃色絲狀物。

傅里葉變換紅外光譜結(jié)果表明，LZJP3和LZJP4均為酸性多糖，且為β-吡喃型多糖。掃描電子顯微鏡結(jié)果表明，LZJP3多糖呈片狀，表面形貌光滑但有破損，LZJP4為分枝狀，表面呈現(xiàn)出干燥的褶皺狀。原子力顯微鏡結(jié)果顯示，LZJP3分子排列疏松，且大小形狀均一，LZJP4有少量的分子球狀聚集體和大量的分散體，大小不均勻。