反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)志賀氏菌

丁夢(mèng)璇，劉秀*，劉伯揚(yáng)，梁玉林，周振森，尹建軍，宋全厚

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 2(內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司，質(zhì)量安全管理系統(tǒng)中心實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特，011517)

志賀氏菌(Shigella)是一類(lèi)具有較強(qiáng)傳染性和危害性的腸道致病菌，常引發(fā)細(xì)菌性痢疾，是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的因子之一[1]。有研究表明，全球每年有1.6 億人因感染志賀氏菌患病，其中99%在發(fā)展中國(guó)家[2]。發(fā)展中國(guó)家每年因志賀氏菌感染而致死的有110萬(wàn)人，其中60%以上為5歲以下兒童[3]?，F(xiàn)有多種檢測(cè)志賀氏菌的方法，包括傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)檢驗(yàn)、自動(dòng)化分析技術(shù)(VITEK)、分子技術(shù)(PCR)、免疫學(xué)法(ELISA、SPA)等，但這些方法都有操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低等不足,不能用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)[4]。日本學(xué)者NOTOMI等[5]在2000年提出一種新的核酸擴(kuò)增方法—環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，在恒定溫度下，利用鏈置換循環(huán)快速擴(kuò)增靶序列，以達(dá)到檢出閾值，且反應(yīng)結(jié)果除了通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和濁度檢測(cè)等手段鑒定外，還能根據(jù)熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)來(lái)判斷。傳統(tǒng)的LAMP檢測(cè)主要以DNA為檢測(cè)模板進(jìn)行擴(kuò)增[6-7]，如果樣本中食源性致病菌已無(wú)致病活性而DNA仍殘留，仍能擴(kuò)增成功，得出假的陽(yáng)性結(jié)果[8]。現(xiàn)有的研究多采用疊氮溴乙錠(ethidium bromide monoazide,EMA)等特異的DNA結(jié)合染料，分辨死菌DNA、受損細(xì)胞DNA和游離DNA，從而剔除死菌的干擾[9]。但是EMA毒性較大，且需要光照等外界條件，操作比較繁瑣。有研究表明，在一些細(xì)胞壁較厚的病原菌檢測(cè)中，EMA不能很好地區(qū)分死菌和活菌[10]。

RNA較易降解，當(dāng)致病菌受到外界損傷而失活時(shí)，其RNA也會(huì)隨之快速降解，因此，建立以RNA為檢測(cè)模板的技術(shù)——反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)， 更符合當(dāng)前食品安全對(duì)志賀氏菌檢測(cè)的需求。鑒于乳及乳制品較易受到志賀氏菌的污染，且脫脂乳作為測(cè)試基質(zhì)，具有較穩(wěn)定的性能，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。本次試驗(yàn)選取ipaH基因作為靶基因，脫脂乳作為人工污染的樣本，建立基于RT-LAMP技術(shù)的志賀氏菌快速檢測(cè)方法，旨在為志賀氏菌的快速檢驗(yàn)提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)共用標(biāo)準(zhǔn)菌株23株。包括4株志賀氏菌，福氏志賀(ShigellaflexneriCMCC 51572)、宋內(nèi)志賀(ShigellasonneiCMCC 51592)、鮑氏志賀(ShigellaBoydiiATCC 9207)、痢疾志賀(ShigelladysenteriaeCMCC 51105)，及19株其他腸道菌，所有菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

志賀氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基，北京路橋技術(shù)股份有限公司；脫脂乳，伊利乳業(yè)有限公司；溶菌酶Lysozyme溶液(RT401)，天根生化科技(北京)公司；焦碳酸乙二酯(DEPC)，中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；RNesay Mini Kit(50)，德國(guó)Qiagen公司；等溫?cái)U(kuò)增試劑Isothermal Master Mix(IMM)，英國(guó)OptiGene Limited公司；Trans2K DNA Marker，北京全世金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-700高壓滅菌鍋，日本TOMY公司；AC2-6S1生物安全柜，新加坡ESCO公司；5804R型和5424型離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；BioDrop-uLite型超微量蛋白核酸分析儀，英國(guó)Biochrom公司；GenieⅢ型快速等溫?cái)U(kuò)增儀，英國(guó)OptiGene Limited公司；TProfessional Trio 48型三槽PCR儀，德國(guó)Biometra公司；JY-300C型電泳儀，北京君意東方儀器公司；Quantum ST5型全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，法國(guó)Vilber Lourmat公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)及篩選

根據(jù)Genebank公布的志賀氏菌屬ipaH基因序列，選取福氏志賀(Accession：M76445)、宋內(nèi)志賀(Accession： LC111511.1)、鮑氏志賀(Accession： LC111512.1)、痢疾志賀(Accession：LC111513.1)進(jìn)行多重比對(duì)，選取高度保守區(qū)，運(yùn)用LAMP Primer Explorer 4(http://primer explorer.jp/elamp4.0.0/index.htm l)在線(xiàn)設(shè)計(jì)4套引物，每套引物均包括：外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP、環(huán)引物L(fēng)oopF和LoopR。同時(shí)設(shè)計(jì)相應(yīng)RT-PCR的引物F和R，引物序列詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 志賀氏菌ipaH基因引物序列Table 1 The RT-LAMP and RT-PCR primer sequence of Shigella ipaH gene

將4套引物分別進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，根據(jù)引物擴(kuò)增的特異性和熒光閾值(Cq值)，篩選一套最優(yōu)的RT-LAMP引物。

1.3.2 志賀氏菌RNA提取

以5 mL滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯接種志賀氏菌，于36 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。取1 mL培養(yǎng)后菌液5 000×g離心10 min，收集菌體沉淀。以適量質(zhì)量濃度0.85%生理鹽水重懸菌體沉淀，制備OD600為0.15的菌懸液，并對(duì)制備的菌懸液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。取1 mL制備的菌懸液5 000 ×g離心10 min，收集菌體沉淀。向菌體沉淀中加入10 μL 蛋白酶K和100 μL TE(溶菌酶的終濃度：15 mg/mL)，混勻，室溫下靜置反應(yīng)30 min，按照RNeasy Mini kit操作步驟提取RNA。

提取RNA的質(zhì)量檢測(cè)：取1 mL提取液，經(jīng)超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度和純度。通過(guò)OD260確定提取液的濃度，通過(guò)OD260∶OD280評(píng)估提取液的純度[11]，對(duì)符合純度要求的提取液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)其完整性。純度和完整性均符合要求的提取液置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 反應(yīng)體系及條件

制備的RT-LAMP反應(yīng)終體積為12.5 μL，包括模板1.5 μL、IMM7.5 μL、引物3.5 μL。其中外引物2.5 pmol、內(nèi)引物10 pmol、環(huán)引物5 pmol。在溫度65 ℃，反應(yīng)時(shí)間為30～60 min。

RT-PCR反應(yīng)按照PrimeScriptTM RT-PCR Kit操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.3.4 RT-LAMP反應(yīng)的準(zhǔn)確性

為了驗(yàn)證RT-LAMP方法的準(zhǔn)確性，建立活菌/損傷菌檢測(cè)模型。選取105～101CFU/mL 5個(gè)菌液梯度，每個(gè)梯度2個(gè)平行樣本，一份作為活性菌樣本，另一份以121 ℃高壓滅菌30 min，靜置至室溫，模擬損傷菌樣本。分別提取2份樣本的不同梯度志賀氏菌菌液RNA，進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。剩余菌液按照GB 4789.5—2012方法同步檢測(cè)[12]，并重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3.5 RT-LAMP反應(yīng)的特異性和靈敏度

分別對(duì)23株細(xì)菌進(jìn)行RNA提取,RT-LAMP反應(yīng)，以驗(yàn)證本方法對(duì)志賀氏菌屬的檢出能力和對(duì)其他腸道菌的抗干擾能力。

其他文獻(xiàn)中方法靈敏性設(shè)計(jì)為：將菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)偬崛『怂?，反?yīng)后對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較。這種設(shè)計(jì)存在一個(gè)漏洞，即每次核酸提取的效率和質(zhì)量都不同，不同反應(yīng)模板對(duì)結(jié)果的影響不能排除。本實(shí)驗(yàn)為排除不同模板的影響，將1.3.2所得的RNA提取液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)x取7 fg/μL、70 fg/μL、700 fg/μL、7 pg/ μL、70 pg/ μL、700 pg/ μL、7 ng/μL共計(jì)7個(gè)梯度，每梯度取1.5 μL作為反應(yīng)模板進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，測(cè)定本方法對(duì)RNA模板的檢測(cè)靈敏度。

1.3.6 RT-LAMP和RT-PCR在人工污染脫脂乳中的靈敏度對(duì)比

人工脫脂乳樣本的制備：為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)所用脫脂乳經(jīng)國(guó)標(biāo)GB 4789.5—2012方法檢測(cè)不含志賀氏菌。無(wú)菌稱(chēng)取25 g脫脂乳加入225 mL 生理鹽水中，混勻，制成人工脫脂乳樣品。

人工污染脫脂乳樣本的制備：取新鮮培養(yǎng)的志賀氏菌斜面，用生理鹽水洗脫，對(duì)洗脫菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)「魈荻染? mL分別加入人工脫脂乳樣品中，混勻，使樣本中的菌液濃度達(dá)到10-1～105CFU/mL，作為人工污染脫脂乳樣本。

以1 mL的人工脫脂乳樣本為陰性對(duì)照，以1 mL各梯度的人工污染脫脂乳樣本為檢測(cè)樣本，分別提取RNA，進(jìn)行RT-PCR和RT-LAMP反應(yīng)，比較2種方法的檢測(cè)靈敏度。為方便比較，同時(shí)取1 mL各梯度菌液進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，記錄各梯度樣本中志賀氏菌的準(zhǔn)確含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

圖1和圖2分別為4套設(shè)計(jì)引物在檢測(cè)模板是否缺失條件下的RT-LAMP擴(kuò)增結(jié)果。由圖1可知，在檢測(cè)模板缺失條件下，1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)引物組均有擴(kuò)增檢出。在排除實(shí)驗(yàn)環(huán)境等因素干擾后，分析可能為引物間堿基的互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，應(yīng)舍棄。

圖1 志賀氏菌引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of Shigella primer amplification注：檢測(cè)模板缺失。

由圖2可知，反應(yīng)體系中含有檢測(cè)模板時(shí)，4號(hào)引物組的擴(kuò)增檢出時(shí)間(Cq值)最短，說(shuō)明該引物組的擴(kuò)增效果最好。綜合圖1和圖2的結(jié)果，選擇4號(hào)引物組作為志賀氏菌RT-LAMP擴(kuò)增的最佳引物組，其序列信息見(jiàn)表1。

圖2 志賀氏菌引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The result of Shigella primer amplification注：檢測(cè)模板存在。

2.2 熔解曲線(xiàn)分析引物擴(kuò)增特異性

LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物為含有多種DNA片段的混合物，雖然片段大小不同，但其GC含量應(yīng)趨于一致。基于這一原理，可通過(guò)監(jiān)測(cè)每一次擴(kuò)增完退火溫度的熒光信號(hào)，根據(jù)熒光信號(hào)所組成的熔解曲線(xiàn)來(lái)評(píng)價(jià)引物的擴(kuò)增特異性。引物擴(kuò)增特異性好的熔解曲線(xiàn)應(yīng)為單峰，且退火溫度(Tm值)在80～90 ℃；若熔解曲線(xiàn)為多峰，則表明引物擴(kuò)增出其他非特異性產(chǎn)物，應(yīng)舍棄；若Tm值在90 ℃之外，則表明擴(kuò)增產(chǎn)物可能為引物二聚體，該引物也應(yīng)舍棄。由圖3可知，使用4號(hào)引物組擴(kuò)增后，熔解曲線(xiàn)僅有單峰，且Tm值為89 ℃，表明該引物的擴(kuò)增特異性好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 4號(hào)引物熔解曲線(xiàn)Fig.3 Dissociation curve of primer 4

2.3 RNA提取質(zhì)量評(píng)價(jià)

提取RNA的純度和完整性是進(jìn)行后續(xù)RT-LAMP和RT-PCR的關(guān)鍵因素。測(cè)得OD260∶OD280值在1.9～2.1， 表明樣本是純度高的RNA，低于1.8則表示有蛋白質(zhì)等污染，高于2.2則表示RNA可能已經(jīng)降解。本次提取RNA溶液的OD260∶OD280為2.08，濃度為76.44μg/mL，符合純度要求。由圖4可知，本次提取RNA溶液僅有16S和23S兩個(gè)清晰條帶，且無(wú)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明所提取的RNA降解程度較少，完整性較高。綜上所述，提取的RNA符合純度及完整性的要求，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

M-Trans2K DNA Marker;1和2為志賀氏菌提取RNA圖4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)志賀氏菌RNAFig.4 Detection of Shigella RNA by electrophoresis

2.4 RT-LAMP擴(kuò)增的準(zhǔn)確性

食品在日常的加工、運(yùn)輸及儲(chǔ)存過(guò)程中，由于受到環(huán)境影響而使得其所含致病菌處于多種狀態(tài)。當(dāng)病原菌處于損傷狀態(tài)時(shí)，可能部分生理生化反應(yīng)能力減弱，但其致病性仍然存在，傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)法基于生理反應(yīng)的判定則會(huì)導(dǎo)致漏檢，而基于靶基因的分子檢測(cè)則能有效檢出。建立活菌/損傷菌模型旨在初步模擬實(shí)際樣品中致病菌不同狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的損傷模擬也僅限于高壓處理。將RT-LAMP擴(kuò)增與國(guó)標(biāo)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，以驗(yàn)證所建立方法的準(zhǔn)確性。由圖5可知，提取活性志賀氏菌的RNA進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，檢測(cè)限能達(dá)到101CFU/mL。

圖5 活菌RNA的RT-LAMP擴(kuò)增Fig.5 RT-LAMP amplification of viable bacterial RNA

由圖6可知，提取損傷志賀氏菌的RNA進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，檢測(cè)限能達(dá)到105CFU/mL。

圖6 損傷菌RNA的RT-LAMP擴(kuò)增Fig.6 RT-LAMP amplification of damaged bacterial RNA

由表2可知，經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)，在活菌檢測(cè)中，從107～102CFU/mL菌液濃度RT-LAMP擴(kuò)增與國(guó)標(biāo)法均有檢出，在101CFU/mL菌液濃度時(shí)，RT-LAMP擴(kuò)增有3次檢出，而國(guó)標(biāo)法僅檢出1次。分析可能為活菌濃度太低，導(dǎo)致國(guó)標(biāo)法未能檢出而漏檢。在損傷菌模型中，國(guó)標(biāo)法在107CFU/mL有3次檢出，在106CFU/mL 菌液濃度有2次檢出，而RT-LAMP擴(kuò)增在107～106CFU/mL均有3次檢出，在105CFU/mL菌液濃度有2次檢出，分析可能經(jīng)高壓處理后，高濃度的菌液未全部殺滅，部分細(xì)菌可能受到損傷而在國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法中不能檢出，但其RNA活性仍然存在，以RNA為檢測(cè)模板的RT-LAMP法則可檢出。綜上可知，在活菌檢測(cè)中，所建立的RT-LAMP擴(kuò)增方法與國(guó)標(biāo)法趨于一致，在失活菌模型中，建立的RT-LAMP擴(kuò)增方法的檢出限比國(guó)標(biāo)法高出1個(gè)數(shù)量級(jí)，所建立的RT-LAMP擴(kuò)增方法準(zhǔn)確性良好。

表2 RT-LAMP擴(kuò)增與國(guó)標(biāo)法結(jié)果比較Table 2 Result comparison of RT-LAMP amplification and national standard examination

注：“G”表示國(guó)標(biāo)法，“R”表示RT-LAMP擴(kuò)增;“+”表示有檢出，“-”表示未檢出;括號(hào)中數(shù)值表示該實(shí)驗(yàn)結(jié)果在3次重復(fù)試驗(yàn)中的出現(xiàn)次數(shù)。

2.5 RT-LAMP的特異性和靈敏度測(cè)定

本研究共對(duì)23株細(xì)菌進(jìn)行RT-LAMP方法檢測(cè)，由表3可知，只有4株志賀氏菌產(chǎn)生熒光擴(kuò)增反應(yīng)，其他19株腸道菌均未產(chǎn)生熒光擴(kuò)增反應(yīng)，表明所建立的RT-LAMP方法具較好的特異性，可用于志賀氏菌的檢測(cè)。

表3 RT-LAMP擴(kuò)增特測(cè)定Table 3 Specificity test of RT-LAMP amplification

注：“+”表示有熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)，“-”表示無(wú)熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)。

由圖7可知，當(dāng)以7 fg/μL的RNA為檢測(cè)模板時(shí)，所建立方法仍能特異性擴(kuò)增檢出，比相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的其他病原菌檢出效率至少高出一個(gè)數(shù)量級(jí)[13-14]。

圖7 RT-LAMP檢測(cè)志賀氏菌的靈敏度Fig.7 Detection sensitivity of RT-LAMP for Shigella

2.6 RT-LAMP和RT-PCR在人工污染脫脂乳中的檢測(cè)靈敏度對(duì)比

在陰性對(duì)照樣本中，RT-LAMP和RT-PCR均未擴(kuò)增檢出。由圖8可知,所建立的RT-LAMP擴(kuò)增在陽(yáng)性樣本中的檢出限為4 CFU/mL，且全部檢測(cè)在30 min完成。

圖8 人工污染脫脂乳RT-LAMP反應(yīng)靈敏度Fig.8 Artificial contamination skim milk RT-LAMP reaction sensitivity

由圖9可知，RT-PCR的檢出限為4×102CFU/mL，表明所建立的RT-LAMP擴(kuò)增方法的檢測(cè)靈敏度比RT-PCR高出2個(gè)數(shù)量級(jí)。

M-Trans DNA Marker Ⅱ；N-陰性對(duì)照；1-4×105 CFU/mL；2-4×104 CFU/mL；3-4×103 CFU/mL；4-4×102 CFU/mL；5-4×101 CFU/mL；6-4 CFU/mL；7-0 CFU/mL圖9 人工污染脫脂乳RT-PCR反應(yīng)靈敏度Fig.9 Artificial contamination skim mlk RT-PCR reaction sensitivity

3 討論

在國(guó)際上每年都有因志賀氏菌引起的食物中毒事件發(fā)生，給人類(lèi)健康和食品安全帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)[15]。在我國(guó)細(xì)菌性痢疾感染多為志賀氏菌引起，由于地域環(huán)境多樣、衛(wèi)生條件參差不齊等原因，食品受到志賀氏菌污染而導(dǎo)致痢疾爆發(fā)較為普遍[16]。而在基層食品檢驗(yàn)中，志賀氏菌的檢出率遠(yuǎn)低于其他腸道致病菌，未能引起檢測(cè)機(jī)構(gòu)和企業(yè)對(duì)其的正確認(rèn)識(shí)和重視，存在食品安全隱患。原因可能為：(1)由于自然界中存在尚未報(bào)道的志賀氏菌，或者有志賀氏菌新的變異型，基層檢測(cè)人員不能獲得其特異的生化信息，而不能有效檢出；(2)志賀氏菌的生化反應(yīng)與某些大腸桿菌相似，傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法依賴(lài)于檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)驗(yàn)不足易將志賀氏菌誤判為大腸桿菌導(dǎo)致漏檢。綜上所述，僅依靠傳統(tǒng)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)控，已不能滿(mǎn)足當(dāng)前的食品安全需求。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子檢測(cè)技術(shù)已越來(lái)越多地應(yīng)用到致病菌的檢測(cè)研究中。LAMP擴(kuò)增方法因其無(wú)需大型的專(zhuān)業(yè)設(shè)備，操作簡(jiǎn)單快捷，檢測(cè)結(jié)果的靈敏性、特異性及應(yīng)用范圍遠(yuǎn)優(yōu)于其他分子檢測(cè)方法而受到人們的廣泛關(guān)注[17]。曾桂芬等[18]建立的志賀氏菌LAMP檢測(cè)方法，對(duì)純菌的靈敏度為5.3×101CFU/mL，高于傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)。王建昌等[19]建立的志賀氏菌SPIA檢測(cè)方法，對(duì)純菌的靈敏度為1.3 CFU/mL，對(duì)模擬樣品的靈敏度為1.8 CFU/mL。本實(shí)驗(yàn)所建立的志賀氏菌RT-LAMP檢測(cè)方法，對(duì)純菌RNA模板的靈敏度為7 fg/μL，對(duì)人工污染樣本的靈敏度為4 CFU/mL，遠(yuǎn)高于RT-PCR方法。且以RNA為檢測(cè)模板，有效地避免了樣本因DNA殘留而出現(xiàn)的假陽(yáng)性擴(kuò)增檢出，在準(zhǔn)確性方面優(yōu)于傳統(tǒng)的LAMP檢測(cè)方法。

由于食品類(lèi)別及制備工藝的不同，不同食品基質(zhì)對(duì)核酸的提取可能產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致目標(biāo)RNA的提取效率不同。本實(shí)驗(yàn)僅選擇了較為穩(wěn)定的食品基質(zhì)進(jìn)行方法驗(yàn)證，后續(xù)還需要擴(kuò)大志賀氏菌污染的樣本種類(lèi)，以研究不同條件下對(duì)志賀氏菌RNA提取情況，RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)條件及檢出限。實(shí)驗(yàn)室對(duì)細(xì)菌的殺滅或損傷處理僅用了高壓方法，不能完全反映樣本中致病菌的各種情況，且經(jīng)高壓處理仍存在的志賀氏菌是否還有致病性還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所建立的志賀氏菌RT-LAMP方法以ipaH基因?yàn)榘谢颍禺愋缘貦z出志賀氏菌，且具有快捷、靈敏、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于志賀氏菌的快速檢測(cè)，也為致病菌快速篩查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供新的研究方向。