甘瀟,李洪軍,2,王兆明,周心雅,賀稚非,2*
1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶,400715)
NaCl是腌臘肉制品的必需配料。由于高鈉鹽的過度攝入有導(dǎo)致發(fā)生高血壓,中風(fēng)和冠心病的風(fēng)險(xiǎn)[1],因此國內(nèi)外食品工作者一直致力于低鹽腌臘肉制品的研究工作[2-5]。低鹽肉制品的研究旨在保持傳統(tǒng)肉制品品質(zhì)的基礎(chǔ)上最大化地降低NaCl的含量。KCl是減少腌臘肉制品中氯化鈉含量的最廣泛研究的鈉鹽替代品。大量研究報(bào)道指出,KCl的適度替代對(duì)腌臘肉制品的品質(zhì)不會(huì)造成明顯的不利影響[6-8]。
在臘肉生產(chǎn)過程中,蛋白質(zhì)氧化與降解是形成臘肉特征色澤、風(fēng)味及質(zhì)構(gòu)品質(zhì)的必要步驟。蛋白質(zhì)氧化誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)修飾可以改變蛋白質(zhì)功能并因此影響肉制品的質(zhì)量,尤其是在肉制品加工過程中,機(jī)械作用會(huì)破壞細(xì)胞的整體結(jié)構(gòu)并打破其抗氧化防御體系,導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化的高度敏感性[9],蛋白質(zhì)氧化對(duì)肉制品的持水力,凝膠特性[10]和質(zhì)構(gòu)特性[11]等都會(huì)有一定的影響。大量的研究報(bào)道指出脂質(zhì)氧化是腌臘肉制品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的重要來源[12-13],但是,近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)降解對(duì)腌臘肉制品的風(fēng)味形成起著重要的作用,降解過程中部分大分子的蛋白質(zhì)分解為低分子物質(zhì),如肽、氨基酸、醛類等,這些物質(zhì)或本身屬于風(fēng)味物質(zhì),或者是風(fēng)味物質(zhì)的重要前體物質(zhì),風(fēng)味前體物質(zhì)通過進(jìn)一步的Strecker降解反應(yīng)或美拉德反應(yīng)生成風(fēng)味化合物[14-15],不同途徑產(chǎn)生的風(fēng)味化合物質(zhì)共同構(gòu)成了臘肉的特征風(fēng)味物質(zhì)。而關(guān)于低鈉鹽臘肉是否會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生影響,進(jìn)而影響臘肉品質(zhì)特性的研究較少,其作用機(jī)理尚不清晰。本文是以鉀鹽不同比例替代鈉鹽的臘肉樣品為研究對(duì)象,考察低鈉鹽對(duì)臘肉制品蛋白質(zhì)氧化、降解及臘肉制品質(zhì)構(gòu)的影響。
1.1.1 原料和輔料
冷鮮豬后腿肉、食鹽、花椒粉、料酒、白糖等,購于重慶市北碚區(qū)永輝超市。
1.1.2 藥品試劑
KCl、異抗壞血酸鈉、NaNO2,均購于河南巧手食品添加劑有限公司;Ⅱ-普通山楂核煙熏香味料(食品級(jí)),購于濟(jì)南華魯食品有限公司;電泳試劑盒,購自索萊寶生物科技有限公司;牛血清蛋白為生化試劑;其余試劑均為分析純。
UV-2450紫外分光光度計(jì),日本島津公司;CT-3質(zhì)構(gòu)儀,美國brookfield公司;L-8900 全自動(dòng)氨基酸分析儀,日本日立高新技術(shù)公司;BSA323S 電子分析天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;酸度計(jì),賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;臺(tái)式高速離心機(jī),德國Eppendorf公司;ZWY-2102C 恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司;XHF-D內(nèi)切式勻漿機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;Elix10 純水機(jī)美國密理博公司。
1.3.1 加工工藝及樣品準(zhǔn)備
冷鮮豬二刀后腿肉分割為長(zhǎng)(15±2) cm,寬(5±0.5) cm 的長(zhǎng)方形塊狀,去除淤血、筋膜等。按照KCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)替代NaCl比例的不同將分割的肉塊平均分成四處理組:對(duì)照組(0% KCl,100% NaCl),A處理組(30% KCl,70% NaCl),B處理組(50% KCl,50%NaCl),C處理組(70% KCl,30% NaCl),各處理組總鹽含量為肉重的4%,輔以料酒、花椒粉等香料采用液腌法(具體配方見表1)在溫度10 ℃的氣候箱腌制4 d,每天翻動(dòng)1次。腌制后的肉塊用30 ℃ 左右的熱水進(jìn)行清洗,除去雜物。晾干水分后,將肉浸漬到濃度為5%的Ⅱ-普通山楂核煙熏香味料溶液中液熏180 min。液熏后瀝干水分放入50 ℃烘箱烘烤48 h,烘烤中每天翻動(dòng)1次肉塊使受熱均勻。烘烤結(jié)束后移出烘箱,10 ℃室內(nèi)攤涼降溫后即為成品[16]。
表1 臘肉腌制配方 單位:gTable 1 Formulations of cured meat
1.3.2 TPA質(zhì)構(gòu)分析
參考王兆明等[17]的方法略做修改,肉塊切成長(zhǎng)、寬、高1 cm的正方體,應(yīng)用CT-3質(zhì)構(gòu)分析儀(美國Brookfield公司)進(jìn)行分析測(cè)試,利用Texture Loader軟件加以控制。測(cè)定方法選用TPA質(zhì)構(gòu)分析,測(cè)定參數(shù)如下,探頭:TA9,目標(biāo):40%,觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載:5 g,測(cè)試速度:1.00 mm/s,返回速度1.00 mm/s,循環(huán)次數(shù):2.0。
1.3.3 蛋白羰基含量檢測(cè)
參考SOGLIA等[18]的方法適當(dāng)修改后測(cè)定羰基含量。取1 g絞碎臘肉樣品,加入10 mL冰浴KCl溶液(0.15 mol/L),3 000 r/min條件下均質(zhì)處理60 s。取2份100 μL的均質(zhì)液,分別加入1 mL三氯乙酸溶液(200 g/L)。隨后在5 000×g條件下離心5 min,移除上清液,加入400 μL十二烷基磺酸鈉溶液(50 g/L)。將得到的2份混合樣品同時(shí)超聲處理60 min后,一份樣品用800 μL的HCl(2 mol/L,含質(zhì)量濃度為2 g/L的2,4-二硝基苯肼(DNPH))處理,另一份樣品用800 μL的HCl(2 mol/L)處理后作為空白。放置30 min后,加入400 μL的三氯乙酸溶液(400 g/L),在5 000×g條件下離心5 min。小心棄去上清液,在沉淀中加入1 mL體積比為1∶1的乙醇-乙酸乙酯混合液,并在10 000×g條件下離心處理5 min。重復(fù)上述操作3次后,在沉淀中加入1.5 mL的NaH2PO4(pH 6.5,20 mmol/L,含有6 mol/L的鹽酸胍)。待蛋白質(zhì)溶解后在4 ℃條件下放置12 h,分別在280和370 nm處測(cè)定吸光度。
1.3.4 鹽溶性蛋白質(zhì)的提取
參考VILLAVERDE等[19]的方法進(jìn)行鹽溶性蛋白質(zhì)的提取。稱取5 g絞碎臘肉樣于50 mL離心管中,加入25 mL 50 mmol/L,pH 7.0的磷酸鹽緩沖液,10 000×g均質(zhì)1 min,然后于9 700×g,4 ℃離心15 min,棄上清,向沉淀中加入25 mL 50 mmol/L,含0.6 mol/L NaCl,pH 7.0的磷酸鹽緩沖液10 000 r/min均質(zhì)1 min,然后于9 700×g,4 ℃離心15 min,上清液即為鹽溶性蛋白。
1.3.5 SDS-PAGE電泳分析
參考HUANG等[20]的方法稍作修改進(jìn)行測(cè)試,提取的鹽溶性蛋白用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整至2 g/L。取0.8 mL蛋白質(zhì)溶液加入0.2 mL含1% β-巰基乙醇的樣品緩沖液,隨后在沸水條件下加熱3 min。分離膠濃度為10%,濃縮膠濃度為5%均按照索萊寶生物科技有限公司電泳試劑盒配方進(jìn)行制備。取10 μL樣品和5 μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣。凝膠用小型的Bio-Rad蛋白電泳儀做分離,濃縮膠時(shí)恒流15 mA,分離膠時(shí)恒流25 mA,當(dāng)指示劑遷移至距離膠底部1 cm處時(shí)停止電泳。分離膠染色30 min后于脫色液中30 ℃恒溫震搖脫色12 h至背景顏色退凈。
1.3.6 游離氨基酸的檢測(cè)
參考LORENZO等[21]的方法修改進(jìn)行游離氨基酸的檢測(cè)。絞碎肉樣30 g,60 ℃烘干粉碎,取1 g粉末樣品加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精,80 ℃水浴萃取1 h,上清收集于小燒杯,重復(fù)3次,并且在水浴上蒸發(fā)掉酒精,剩余液體移入分液漏斗,加入10 mL乙醚萃取脂肪,水層于水浴上蒸干,再用20 mmol/L鹽酸洗入50 mL容量瓶并定容,5 000×g,4 ℃離心15 min。上清液采用日本日立高新技術(shù)公司的L-9800全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行游離氨基酸含量檢測(cè),上機(jī)檢測(cè)之前通過0.22 μm的過濾器進(jìn)行樣品的注射過濾。
1.3.7 TBA值檢測(cè)
參考WANG等[22]的方法適當(dāng)修改,稱取研磨均勻的肉樣10 g,置100 mL具塞三角瓶?jī)?nèi),加入50 mL 7.5%三氯乙酸(含1 g/L EDTA)水浴振搖30 min,雙層濾紙過濾,移取上清液5 mL置于25 mL比色管內(nèi),加入5 mL 20 mmol/L的TBA,加塞混勻,90 ℃水浴保溫40 min,取出冷卻1 h,移入小試管1 600×g離心5 min, 上清液傾入25 mL比色管,加入5 mL氯仿?lián)u勻、靜置、分層,吸取上清分別在532 nm和600 nm波長(zhǎng)比色,記錄吸光值,運(yùn)用公式(1)進(jìn)行TBA值計(jì)算:
(1)
其中A532和A600分別表示在532 nm和600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值。
所有測(cè)試重復(fù)3次操作取得數(shù)據(jù),運(yùn)用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差(analysis of variance,ANOVA)分析、Pearson相關(guān)性分析,用Orign8.6作圖。
TPA質(zhì)構(gòu)分析是通過模擬人的口腔咀嚼原理,對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行2次壓縮穿刺,然后通過計(jì)算機(jī)輸出測(cè)試曲線進(jìn)行分析各指標(biāo)特性[23]。硬度是指改變食品形狀所需的力,表示為測(cè)試時(shí)第一次穿沖樣品時(shí)的最大峰值;彈性反映在外力作用下變形及去力后的恢復(fù)程度,表示為第二次穿刺樣品時(shí)的測(cè)量高度與第一次測(cè)量高度的商;膠著性指將半固體食品嚼爛至可吞咽需做的功;咀嚼性表示硬度,內(nèi)聚性和彈性的積,是指將固體食品嚼碎至可吞咽狀態(tài)需要做的功[24]。低鹽臘肉質(zhì)構(gòu)特性如圖1所示。由圖1可知,KCl替代比例達(dá)到70%臘肉組的硬度、膠著性和咀嚼性均顯著高于其他處理組(P< 0.05),KCl替代50%、70%組彈性顯著高于對(duì)照組(P< 0.05)。
圖1 低鹽臘肉質(zhì)構(gòu)(硬度、彈性、膠著性、咀嚼性)分析Fig.1 Analysis of low salt bacon texture(hardness,elasticity,gumminess,chewiness)
本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)構(gòu)特性的變化可解釋為,隨著鉀鹽的高濃度替代(70%),由于KCl分子質(zhì)量大于NaCl,總離子強(qiáng)度減弱使得鹽溶性蛋白減少及持水力下降[25],從而導(dǎo)致臘肉樣品含水量降低,硬度、膠著性和咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性增加。相似的研究結(jié)果也有報(bào)道,如COMFORT等[26]研究指出鹽溶性牛肉蛋白的凝膠強(qiáng)度在鉀存在下最強(qiáng),其次是NaCl和CaCl2。HORITA等[25]研究發(fā)現(xiàn)KCl 50%替代的法蘭克福香腸硬度、內(nèi)聚性和咀嚼性均顯著高于對(duì)照組,與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。
低鹽臘肉總蛋白羰基含量如圖2所示。由圖2可知,隨著KCl替代比例的增加,總蛋白羰基含量呈增加趨勢(shì),50%和70% KCl替代臘肉樣總蛋白羰基含量顯著高于對(duì)照組(P< 0.05)。羰基化是蛋白質(zhì)發(fā)生的不可逆非酶促修飾,涉及由氧化應(yīng)激和其他機(jī)制誘導(dǎo)的羰基部分形成的[28]。蛋白羰基的形成途徑有:直接從賴氨酸,蘇氨酸,精氨酸和脯氨酸側(cè)鏈氧化形成[29]。
圖2 低鹽臘肉蛋白羰基含量Fig.2 Protein carbonyl content of low salt bacon
在還原糖存在的非酶糖化[30];通過α-酰胺化途徑或通過谷氨?;鶄?cè)鏈的氧化對(duì)肽骨架進(jìn)行氧化裂解形成[28];與非蛋白質(zhì)羰基化合物如4-羥基-2壬烯醛(HNE)或丙二醛(MDA)共價(jià)結(jié)合形成[31]。其中色氨酸、賴氨酸等敏感氨基酸側(cè)鏈的直接氧化是蛋白質(zhì)羰基化的主要途徑,羰基是蛋白質(zhì)氧化的主要產(chǎn)物[32]。目前關(guān)于蛋白羰基的檢測(cè)用得最普遍的是2,4-二硝基苯肼(DNPH)偶聯(lián)方法[33-34],盡管在此方法的檢測(cè)中,脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的羰基不可避免的會(huì)對(duì)蛋白羰基結(jié)果造成一定的影響,但是就目前可查的文獻(xiàn)來看,還未能解決該方法存在的此弊端。另外西班牙研究團(tuán)隊(duì)ESTEVEA等[35]認(rèn)為特殊的半醛α-氨基己二酸半醛(AAS)和谷氨酰胺半醛(GGS)可以反映總羰基含量的60%,因此也被用來衡量蛋白氧化。本試驗(yàn)中不同含鹽量的臘肉羰基含量的不同說明蛋白質(zhì)氧化程度有所差異。由圖2可見,高濃度的KCl替代促進(jìn)了臘肉蛋白質(zhì)氧化的發(fā)生,目前為止,KCl促進(jìn)蛋白氧化的作用機(jī)理尚不清晰,鑒于此,我們接下來的實(shí)驗(yàn)將對(duì)KCl促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化的發(fā)生機(jī)理進(jìn)行深入的研究。
不同鹽濃度含量臘肉SDS-PAGE電泳圖譜如圖3所示。如圖可見,各處理組電泳條帶濃度和條帶密度都較少,說明各處理組都發(fā)生了不同程度的蛋白質(zhì)降解。在臘肉加工過程中,尤其是腌制階段鹽離子的作用及高溫烘烤階段溫度的升高都促進(jìn)了蛋白降解[36]。此外,對(duì)照組可見比較清晰的肌球蛋白重鏈電泳條帶和濃度較低的副肌球蛋白條帶及模糊的原肌球蛋白條帶,30% KCl替代組只有肌球蛋白重鏈電泳條帶清晰可見,而副肌球蛋白和原肌球蛋白條帶已消失不見。50%和70% KCl替代組肌球蛋白重鏈,副肌球蛋白和原肌球蛋白電泳條帶均完全消失。
M-marker; C-對(duì)照組;Ⅰ-30% KCl替代組;Ⅱ-50% KCl替代組;Ⅲ-70% KCl替代組;MHC-肌球蛋白重鏈;paramyosin-副肌球蛋白;actin-肌動(dòng)蛋白;troponysin-肌鈣蛋白圖3 低鹽臘肉SDS-PAGE電泳分析圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis analysis of low salt bacon
說明50%和70% KCl替代組臘肉發(fā)生了比對(duì)照組更劇烈的蛋白質(zhì)降解,說明鉀鹽的高濃度替代一定程度上促進(jìn)了蛋白質(zhì)的降解。蛋白質(zhì)降解是肉的內(nèi)源蛋白酶和微生物酶共同作用的結(jié)果,內(nèi)源酶將大分子蛋白質(zhì)降解為小分子的多肽后,微生物酶再將多肽降解為分子質(zhì)量更小的小肽及氨基酸[37-38]。研究證明鉀離子能夠改變細(xì)胞膜的通透性,增加多肽往微生物細(xì)胞膜內(nèi)的流量,從而增加微生物細(xì)胞對(duì)多肽的水解[39],釋放更小的肽和游離氨基酸,最終達(dá)到促進(jìn)蛋白質(zhì)降解的作用。
游離氨基酸經(jīng)常作為風(fēng)味活性化合物,其他風(fēng)味成分的前體和蛋白水解活性的定量指標(biāo),用于衡量蛋白質(zhì)降解程度及檢查加工肉制品品質(zhì)[40]。不同鹽濃度臘肉總游離氨基酸含量如圖4所示。
圖4 低鹽臘肉總游離氨基酸含量Fig.4 Total free amino acid content of low salt bacon
由圖4可知,70% KCl替代組臘肉總游離氨基酸含量顯著高于其他各處理組(P<0.05)。說明70% KCl替代組臘肉發(fā)生了更顯著的降解反應(yīng)。這與SDS-PAGE電泳分析的結(jié)果相吻合。ARMENTEROS等[41]研究發(fā)現(xiàn)分別用不同比例的KCl,MgCl2和CaCl2替代NaCl后的干腌肉制品總游離氨基酸含量顯著高于對(duì)照組,與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。
圖5展示的是不同鹽濃度臘肉的TBARS值。TBARS通常作為脂質(zhì)氧化的指示劑,可通過檢查與TBA反應(yīng)物質(zhì),如丙二醛和揮發(fā)性化合物的形成來評(píng)估次級(jí)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物。TBA測(cè)試通過分光光度法定量測(cè)定肉樣中的MDA含量以衡量樣品脂質(zhì)氧化程度。
圖5 低鹽臘肉TBARS值Fig.5 TBARS value of low salt bacon
由圖5可知,不同鹽含量處理組TBARS值無顯著變化,說明本實(shí)驗(yàn)條件下KCl的替代對(duì)脂質(zhì)氧化沒有顯著影響。這與ANDRES等[42]的研究結(jié)果一致,他們的研究指出,3%~6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鹽在干腌火腿中呈現(xiàn)出較小的促氧化作用,而本實(shí)驗(yàn)臘肉的鹽含量在此范圍內(nèi),因此脂肪氧化反應(yīng)沒有受鉀鹽替代的顯著影響。
表2為低鹽臘肉蛋白質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)降解、脂肪氧化和質(zhì)構(gòu)特性等指標(biāo)的相關(guān)性分析。由表2可知,蛋白羰基與彈性和咀嚼性之間具有極顯著的正相關(guān)性(R2=0.957,P< 0.000 1;R2=0.809,P=0.001),與硬度和膠著性也存在顯著相關(guān)性,說明蛋白質(zhì)氧化和肉樣質(zhì)構(gòu)之間存在一定的正相關(guān)性。其相關(guān)性可解釋為蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致肌肉樣品中相鄰纖維之間的細(xì)胞外空間增大,蛋白持水力降低使得肉制品硬度增強(qiáng)[10]。另外ZHANG等[9]研究表明,蛋白質(zhì)氧化能夠增加蛋白的凝膠形成能力,這可能與多肽之間和蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)形成有關(guān),這些交聯(lián)可以降低凝膠網(wǎng)絡(luò)的流動(dòng)性,穩(wěn)定凝膠基質(zhì)內(nèi)的其他非共價(jià)鍵,從而提高肉品的膠著性,彈性及咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性。
表2 低鹽臘肉蛋白質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)降解與質(zhì)構(gòu)之間的Pearson相關(guān)性Table 2 Pearson correlation between protein oxidation,protein degradation and texture of low-salt bacon
注:*表示P<0.05差異顯著;**表示P<0.01差異極顯著。
此外,由表2可知,游離氨基酸與硬度之間存在極顯著正相關(guān)性(R2=0.736,P=0.006),而與彈性,膠著性和咀嚼性無顯著相關(guān)性,說明本實(shí)驗(yàn)條件下的臘肉蛋白質(zhì)降解與肉樣的硬度存在顯著的正相關(guān)性,說明本實(shí)驗(yàn)條件下的低鹽臘肉未發(fā)生過度蛋白質(zhì)降解導(dǎo)致的臘肉制品異常柔軟而影響肉制品品質(zhì)[43-44]。蛋白質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)降解是臘肉加工過程中的特征反應(yīng),其作用不僅體現(xiàn)在臘肉風(fēng)味的形成,更對(duì)臘肉質(zhì)構(gòu)形成有重要的影響作用[45]。另外,由表2可知,TBARS與質(zhì)構(gòu)各指標(biāo)存在負(fù)相關(guān)性(P>0.05),這與報(bào)道的相關(guān)研究結(jié)果一致,脂肪氧化對(duì)肉制品質(zhì)構(gòu)形成作用不明顯,而更多的體現(xiàn)在對(duì)肉制品風(fēng)味貢獻(xiàn)的作用[46],脂肪氧化產(chǎn)生大量的揮發(fā)性化合物及風(fēng)味前體物質(zhì)[47],這些風(fēng)味前體物質(zhì)進(jìn)一步與氨基酸,美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物或其他化合物反應(yīng)形成臘肉制品的特征風(fēng)味物質(zhì)。
隨著KCl替代NaCl濃度的增加,低鹽臘肉制品的蛋白質(zhì)氧化,蛋白質(zhì)降解及臘肉制品質(zhì)構(gòu)特性均發(fā)生著不同程度的改變。TAP分析發(fā)現(xiàn)鉀鹽低濃度替代對(duì)肉制品的質(zhì)構(gòu)沒有顯著影響,而70%鉀鹽替代會(huì)顯著提高肉樣的硬度,彈性,膠著性和咀嚼性。蛋白羰基,SDS-PAGE電泳和總游離氨基酸測(cè)試結(jié)果顯示,高濃度(70%)的鉀鹽替代會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)降解。另外,通過對(duì)蛋白質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)降解、脂肪氧化和質(zhì)構(gòu)特性等指標(biāo)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)氧化,蛋白質(zhì)降解對(duì)臘肉制品的質(zhì)構(gòu)形成有重要作用。