免泡豆桿腐敗菌復(fù)配抑菌劑的優(yōu)化及其保鮮效果

唐桂宇，唐怡淋，代博仁，蔣愛玲，張志清，申光輝

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

豆桿，又稱豆筋，豆棒，是川渝地區(qū)具有地方特色的非發(fā)酵豆制品。傳統(tǒng)豆桿制品烹調(diào)前需浸泡4 h以上，食用不便。免泡豆桿是將傳統(tǒng)豆桿制品進(jìn)行預(yù)浸泡復(fù)水后，真空包裝制備的新型豆制品，節(jié)約了消費者浸泡復(fù)水消耗的時間，深受消費者喜愛，消費市場潛力大。然而免泡豆桿中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，水分含量高，極易發(fā)生微生物腐敗變質(zhì)，尤其是殘留的耐熱性極強(qiáng)的芽孢細(xì)菌[1-2]。目前生產(chǎn)中主要采用傳統(tǒng)熱殺菌處理，不僅難以徹底殺滅耐熱細(xì)菌，同時強(qiáng)度過高的殺菌條件導(dǎo)致褐變、彈性下降等產(chǎn)品劣變現(xiàn)象，消費者接受度大大降低。因此，采用單一的熱殺菌方式難以保障免泡豆桿良好品質(zhì)和較長貨架期。

使用廣譜高效、低毒、天然的防腐劑來延長非發(fā)酵豆制品貨架期，是近年來的研究熱點之一[3]。乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種高效、穩(wěn)定、安全的天然防腐劑，可抑制大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌，并對芽孢桿菌的芽孢有強(qiáng)烈的抑制作用[4]。ε-聚賴氨酸能抑制細(xì)菌、真菌和耐熱芽孢桿菌[5]，具有安全高效，耐高溫的優(yōu)點。山梨酸及其鉀鹽，能夠抑制食品中脫氫酶活力，阻止脂肪酸氧化和脫氫，可有效抑制食品中細(xì)菌生長繁殖，且易被人體代謝分解，是目前使用廣泛的一種安全、高效的防腐劑[6]。

本課題組從腐敗免泡豆桿中分離獲得了4株優(yōu)勢腐敗菌，均屬于耐熱性較強(qiáng)、蛋白酶分泌能力較強(qiáng)的芽孢桿菌屬[7]。為抑制腐敗菌生長繁殖導(dǎo)致豆桿腐敗變質(zhì)，本實驗選取乳酸鏈球菌素(Nisin)、ε-聚賴氨酸和山梨酸鉀為抑菌劑，以最低抑菌濃度結(jié)合抑菌率指標(biāo)，評價其對優(yōu)勢腐敗菌的抑菌能力，并采用響應(yīng)面法進(jìn)行復(fù)配抑菌劑優(yōu)化，并考察比較復(fù)合抑菌劑在不同應(yīng)用方式與條件下的保鮮效果，以期為延長免泡豆桿貨架期，維持良好品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆桿：四川山古坊食品有限公司提供。

腐敗菌：解淀粉芽孢桿菌DY1a、DY1b，枯草芽孢桿菌DY2a、DY3，保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院。

抑菌劑：山梨酸鉀，購自成都市科龍化工試劑廠；乳酸鏈球菌素、ε -聚賴氨酸，購自鄭州博研生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50 SI立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GZ-150-M霉菌培養(yǎng)箱，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；QL-901渦旋振蕩器，其林貝爾儀器制造公司；ZWY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；PHS-3C酸度計，上海佑科儀器儀表有限公司；Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技公司；DZ400-2C真空包裝機(jī)，上海青葩包裝機(jī)械有限公司；TA.XTPlus物性分析儀，英國SMS公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將腐敗菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，調(diào)整菌懸液細(xì)胞數(shù)量至106CFU/mL。

1.3.2 最低抑菌濃度(MIC)的測定

采用二倍稀釋法，抑菌劑用無菌水溶解配制并用LB液體培養(yǎng)基稀釋至不同質(zhì)量濃度：Nisin 12.5～400 μg/mL，ε-聚賴氨酸12.5～400 μg/mL，山梨酸鉀100～3 200 μg/mL，添加100 μL至96孔板，再加入100 μL腐敗菌菌懸液，37 ℃培養(yǎng)24 h后用酶標(biāo)儀測定OD600，將培養(yǎng)前后OD600無顯著性變化的防腐劑濃度確定為最低抑菌濃度，各處理重復(fù)3次。

1.3.3 抑菌劑對腐敗菌DY3抑菌率的測定

根據(jù)MIC實驗結(jié)果，并參考GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[8]中的相關(guān)規(guī)定確定3種防腐劑的最大使用限量及適宜范圍，以最難抑制的枯草芽孢桿菌DY3為指示菌，按1.3.2方法在96孔板中培養(yǎng)并測定OD600。未添加抑菌劑作為空白組。按公式(1)計算抑菌率[9]：

(1)

Nisin質(zhì)量濃度為5、10、15、20、25、30 μg/mL，并添加50 μg/mLε-聚賴氨酸和400 μg/mL山梨酸鉀。ε-聚賴氨酸質(zhì)量濃度為20、30、40、50、60、70 μg/mL，并添加20 μg/mL Nisin和400 μg/mL山梨酸鉀。山梨酸鉀質(zhì)量濃度為250、300、350、400、450、500 μg/mL，并添加20 μg/mL Nisin和50 μg/mLε-聚賴氨酸。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)配抑菌劑配比及驗證

根據(jù)抑菌率實驗結(jié)果，進(jìn)行3因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計，實驗因素及水平見表1。根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果，配制復(fù)配抑菌劑，測定其24 h的抑菌率，驗證復(fù)配抑菌劑的抑制效果。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface experiments

1.3.5 復(fù)配抑菌劑對免泡豆桿的防腐保鮮效果評價

(1)樣品的制備與處理

為考察復(fù)配抑菌劑的添加方式及與熱殺菌配合使用效果，設(shè)計6組不同實驗處理：對照組：豆桿復(fù)水后真空包裝貯藏；熱殺菌組：豆桿復(fù)水，真空包裝，100 ℃水浴殺菌20 min后冷卻貯藏；抑菌劑添加組：向復(fù)水豆桿中直接添加復(fù)配抑菌劑，真空包裝貯藏；抑菌劑復(fù)水組：將豆桿浸沒于復(fù)配抑菌劑水溶液復(fù)水4 h，真空包裝貯藏；抑菌劑添加+熱殺菌組：向復(fù)水豆桿中直接添加復(fù)配抑菌劑，真空包裝，100 ℃殺菌20 min冷卻貯藏；抑菌劑復(fù)水+熱殺菌組：將豆桿浸沒于復(fù)配抑菌劑水溶液復(fù)水4 h，真空包裝，100 ℃殺菌20 min冷卻貯藏。以上各組處理的復(fù)水溫度為20～23 ℃，復(fù)水時間4 h后，包裝規(guī)格為80 g/袋，貯藏溫度25 ℃。

(2)樣品感官評價

參考鄭麗君等[7]建立的感官評價方法，由10人組成的感官評價小組從色澤、氣味、質(zhì)地方面對實驗豆桿樣品進(jìn)行感官評價。

(3)揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)測定

按照GB 5009. 228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[10]測定。

(4)芽孢桿菌數(shù)量測定

稱取25.0 g樣品，無菌條件下充分研磨后轉(zhuǎn)入加有225 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%無菌生理鹽水的錐形瓶，200 r/min振蕩30 min，靜置5 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，選擇3個適宜稀釋梯度，各取1 mL稀釋液，采用傾注法，利用錳鹽營養(yǎng)瓊脂選擇性培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h對樣品中的芽孢桿菌進(jìn)行平板計數(shù)。

(5)pH值測定

稱取25.0 g樣品，充分研磨后轉(zhuǎn)入裝有225 mL蒸餾水的錐形瓶，200 r/min振蕩30 min，靜置10 min后過濾，用pH計測定濾液，每個條件測量3次，測量結(jié)果取平均值。

(6)質(zhì)構(gòu)測定

將樣品切割成2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm，參考鄭麗君等[2]方法并做修正。測定條件：TPA模式，P/5平底柱形探頭，測前速度2.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s，測后速度5.0 mm/s，2次下壓停留間隔時間5 s。選取中心位置進(jìn)行測定樣品硬度、彈性、咀嚼性參數(shù)[11]，每組樣品重復(fù)5次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗與Duncan多重比較分析，Design-Expert 10.0.7.0進(jìn)行響應(yīng)面法數(shù)據(jù)分析，Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種抑菌劑MIC測定結(jié)果

由表2可知，不同抑菌劑對4株優(yōu)勢腐敗細(xì)菌的MIC值差異較大。ε-聚賴氨酸和Nisin的抑菌能力整體強(qiáng)于山梨酸鉀。不同受試腐敗菌對山梨酸鉀和Nisin的敏感度不同，其中DY1b和DY3對山梨酸鉀的敏感度較弱，MIC值高于其他2株腐敗菌；DY3對ε-聚賴氨酸的敏感度最弱，MIC為400 μg/mL。不同腐敗菌對抑菌劑敏感度可能與菌株遺傳特性有關(guān)。

表2 不同防腐劑對各優(yōu)勢腐敗菌的MIC值Table 2 MIC value of different preservatives for each dominant spoilage organism

2.2 不同濃度抑菌劑對腐敗菌DY3抑菌率

由圖1可知，Nisin、ε-聚賴氨酸和山梨酸鉀對枯草芽孢桿菌DY3的抑菌率均隨添加濃度的增大而提高。

圖1 不同濃度抑菌劑對枯草芽孢桿菌DY3的抑制效果Fig.1 The inhibition effect of different concentrations of bacteriostatic agents on Bacillus subtilis DY3注：不同小寫字母表示不同濃度抑菌劑抑菌率有顯著性差異(P<0.05)。

根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[8]和其附錄A.2中規(guī)定同一功能的食品添加劑(包括防腐劑)在混合使用時，各自用量占其最大使用量的比例之和不應(yīng)超過1，根據(jù)圖1結(jié)果，綜合考慮響應(yīng)面優(yōu)化實驗的因素水平：Nisin：17.5、20、22.5 μg/mL；ε-聚賴氨酸：50、55、60 μg/mL；山梨酸鉀：375、400、425 μg/mL。

2.3 復(fù)配抑菌劑響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果及驗證

響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果見表3。利用Design-Expert 10.0.7.0軟件對表3中的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得以抑菌率(Y)為響應(yīng)值的回歸方程：

Y=88.311 99+6.123 75A+1.106 25B+3.002 50C+0.552 49AB-0.325 00AC+1.645 00BC-2.699 75A2-3.254 75B2+1.812 75C2

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 3 The experiment result of response surface

表4 響應(yīng)面實驗方差分析Table 4 The variance analysis of response surface

根據(jù)回歸方程求得抑菌率極大值對應(yīng)的因素水平，獲得3種防腐劑的最佳復(fù)配比例為：Nisin 22.50 μg/mL、ε-聚賴氨酸57.54 μg/mL、山梨酸鉀425.00 μg/mL。相比于單一防腐劑對枯草芽孢桿菌DY3的抑菌質(zhì)量濃度：Nisin 200 μg/mL、ε-聚賴氨酸400 μg/mL、山梨酸鉀1 600 μg/mL，復(fù)配抑菌劑各防腐劑用量顯著減少，且根據(jù)最佳配比條件做3次重復(fù)驗證實驗，最后得到實際平均抑菌率為(94.22±0.35)%，抑菌效果十分明顯。最佳復(fù)配比例抑菌劑對枯草芽孢桿菌DY3的抑菌率的理論值為97.06%，實際值與理論值基本上吻合，所得到抑菌劑配比比較準(zhǔn)確可靠。

2.4 復(fù)配防腐保鮮劑應(yīng)用效果評價

2.4.1 真空免泡豆桿貯藏期間感官評價結(jié)果

由圖2可知，各組樣品貯藏過程中感官評分逐漸下降，經(jīng)過100 ℃ 20 min熱殺菌處理的3組樣品感官評分整體上均高于未熱殺菌處理的3組樣品。貯藏至第10天，未進(jìn)行熱殺菌處理的3組樣品感官評分均降低至臨界值以下，其中對照組樣品評分降低至30分，嚴(yán)重腐敗變臭，感官無法接受，單獨使用抑菌劑的兩組樣品評分略高于對照組，但也出現(xiàn)較嚴(yán)重的腐敗現(xiàn)象，僅熱殺菌處理組樣品感官評分雖然高于單獨使用抑菌劑的兩組樣品，但其貨架期只能保持6 d，抑菌劑復(fù)配結(jié)合熱殺菌處理的2組樣品感官評分均高于其他處理組，分值均>75分，處于感官臨界值以上，屬于可接受食用范圍。結(jié)果表明，抑菌劑結(jié)合熱殺菌能夠較好延長產(chǎn)品貨架期，維持較好的產(chǎn)品感官品質(zhì)。

圖2 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間感官評價Fig.2 Sensory evaluation changes of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃

2.4.2 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)值

揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)是腐敗微生物降解蛋白質(zhì)的重要產(chǎn)物，是評價高蛋白食品新鮮程度的重要指標(biāo)[12]，其值越高則表明樣品蛋白質(zhì)降解腐敗程度越高。由圖3可知，各組樣品貯藏期TVB-N值均呈上升趨勢。貯藏至第10天，對照組樣品TVB-N值最高，為12.32 mg/100 g，其次是熱殺菌組樣品，添加有復(fù)配抑菌劑的4組均顯著低于未加抑菌劑的2個對照組；抑菌劑結(jié)合100 ℃ 20 min熱殺菌處理的2組樣品TVB-N值低于其他各組，其中豆桿復(fù)水后添加抑菌劑，再熱殺菌處理的樣品TVB-N最低，為6.86 mg/100 g，遠(yuǎn)低于24.00 mg/100 g[13]。結(jié)果表明復(fù)配抑菌劑可有效抑制樣品TVB-N的增加，延長樣品的貨架期，并且復(fù)配抑菌劑與熱殺菌結(jié)合處理的抑制效果更顯著。

圖3 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間TVB-N值變化Fig.3 Total viable basic nitrogen values of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃注：不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理樣品TVB-N值有顯著性差異(P<0.05)。

2.4.3 真空免泡豆桿貯藏期間芽孢桿菌數(shù)變化

由圖4可知，未熱殺菌處理的3組樣品芽孢桿菌總數(shù)貯藏期整體呈上升趨勢，且芽孢桿菌數(shù)量均高于經(jīng)熱殺菌處理的3組樣品，主要是由于熱殺菌處理殺死部分非耐熱的細(xì)菌菌體，延緩了芽孢桿菌的增殖。第0天時，未經(jīng)熱殺菌的3組樣品貯藏初期芽孢桿菌數(shù)為6.99 lgCFU/g，貯藏第0～4天過程中芽孢桿菌數(shù)明顯增加，而第4天后由于免泡豆桿中營養(yǎng)物質(zhì)被消耗減少，生物胺等腐敗代謝產(chǎn)物積累，芽孢桿菌數(shù)量增加較緩慢[14]，結(jié)果表明，樣品僅添加復(fù)配抑菌劑而不經(jīng)熱殺菌處理對芽孢桿菌增殖抑制效果并不明顯，這與離體條件下的抑菌效果存在較大差距，可能原因是無論采取復(fù)水后添加還是使用抑菌劑溶液復(fù)水，包裝袋內(nèi)的復(fù)配抑菌劑并未均勻擴(kuò)散分布于豆桿內(nèi)部組織，同時豆桿樣品中的芽孢桿菌可能由于生物被膜的保護(hù)作用，導(dǎo)致抑菌劑的實際抑菌效果并不明顯。復(fù)配抑菌劑結(jié)合100 ℃ 20 min殺菌的2個處理組樣品貯藏第4天以前的芽孢桿菌總數(shù)顯著低于其他各組，表明抑菌劑結(jié)合熱殺菌對樣品中芽孢桿菌抑菌效果最好；其中抑菌劑復(fù)水結(jié)合熱殺菌的抑菌效果要好于抑菌劑添加結(jié)合熱殺菌處理組，可能是由于樣品在復(fù)配抑菌劑溶液中復(fù)水，提高了抑菌劑組分在豆桿組織中滲透分布均一性，使抑菌效果明顯增強(qiáng)，這與王敏等[15]研究蜂膠用于非發(fā)酵豆制品保鮮的條件優(yōu)化及對菌落數(shù)的影響研究結(jié)果影響一致。而貯藏后期，熱殺菌處理的3組樣品芽孢桿菌總數(shù)無顯著性差異，逐漸趨于相同。

圖4 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間芽孢桿菌數(shù)變化Fig.4 Total Bacillus number change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃注：不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理樣品芽孢桿菌數(shù)有顯著性差異(P<0.05)。

2.4.4 真空免泡豆桿貯藏期間pH變化

pH是評判豆制品品質(zhì)高低的指標(biāo)之一。由圖5可知，貯藏期各組樣品因腐敗菌繁殖而產(chǎn)酸[16]，導(dǎo)致pH值均呈下降趨勢，抑菌劑結(jié)合熱殺菌對pH下降有顯著抑制作用，其中采用抑菌劑溶液復(fù)水結(jié)合熱殺菌處理的抑制效果最好。各組樣品第6天均出現(xiàn)上升，可能是腐敗菌利用樣品中的碳水化合物產(chǎn)酸量減少而分解蛋白質(zhì)的產(chǎn)胺量增多有關(guān)。

圖5 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間pH值變化Fig.5 The pH value change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃注：不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理樣品pH值有顯著性差異(P<0.05)。

2.4.5 真空免泡豆桿貯藏期間質(zhì)構(gòu)變化

質(zhì)構(gòu)特性作為食品重要的物理特性，是評判產(chǎn)品質(zhì)量的重要依據(jù)[17]。由圖6和圖7可知，隨著貯藏時間的增加，樣品硬度和咀嚼性均呈上升趨勢，這與貯藏期間樣品受到化學(xué)和微生物作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)部化學(xué)鍵和作用力破壞，凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的水分釋放，促使水分向更自由的那部分水分轉(zhuǎn)化[18]，樣品失水而導(dǎo)致硬度和咀嚼性增加有關(guān)。抑菌劑結(jié)合熱殺菌處理顯著延緩樣品硬度和咀嚼性的增加，有利于維持相對較好的品質(zhì)特性。

圖6 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間硬度變化Fig.6 The hardness change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃注：不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理樣品硬度有顯著性差異(P<0.05)。

圖7 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間咀嚼性變化Fig.7 The chewiness change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃注：不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理樣品咀嚼性有顯著性差異(P<0.05)。

由圖8可知，對照組樣品貯藏期彈性逐漸降低，抑菌劑結(jié)合熱殺菌處理樣品彈性沒有降低，反而具有一定的增強(qiáng)趨勢，表明抑菌劑結(jié)合熱殺菌處理可保持并改善樣品彈性品質(zhì)。

圖8 不同處理條件免泡豆桿貯藏期間彈性變化Fig.8 The springiness change of dougan under different treatment conditions during storage at 25 ℃注：不同小寫字母表示同一貯藏時間不同處理樣品彈性有顯著性差異(P<0.05)。

綜上，熱殺菌處理可一定程度上起到良好的保鮮效果，復(fù)配抑菌劑結(jié)合+熱殺菌處理樣品大部分指標(biāo)(包括感官整體評分、微生物數(shù)量、TVB-N、彈性、咀嚼性)均優(yōu)于單獨熱殺菌處理，表明復(fù)配抑菌劑與熱殺菌處理相結(jié)合，可提高免泡豆桿常規(guī)熱殺菌處理的保鮮效果。

3 結(jié)論

Nisin和ε-聚賴氨酸對腐敗菌的抑菌性能強(qiáng)于山梨酸鉀，枯草芽孢桿菌DY3對ε-聚賴氨酸的敏感度弱與其他腐敗菌株，MIC值高于其他腐敗菌株。復(fù)配抑菌劑得到最佳配比為：Nisin 22.50 μg/mL、ε-聚賴氨酸57.54 μg/mL、山梨酸鉀425.00 μg/mL，對枯草芽孢桿菌DY3的抑菌率為(94.22±0.35)%。

采用復(fù)配抑菌劑溶液復(fù)水，并結(jié)合100 ℃ 20 min熱殺菌對免泡豆桿的抑菌保鮮效果最好。該方法處理可有效抑制樣品中芽孢桿菌生長繁殖，延緩樣品酸化和揮發(fā)性鹽基氮的生成，較對照樣品貨架期延長4 d，并在6 d內(nèi)維持免泡豆桿的良好的感官和質(zhì)構(gòu)品質(zhì)，可為免泡豆桿工業(yè)生產(chǎn)抑菌保鮮提供技術(shù)參考。