五糧液大曲中的酚類成分及其抗氧化活性

姚燦，周韓玲，龔宇，廖勤儉，吳林蔚，李楊華，楊濤，安明哲，李國(guó)友*

1(中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都，610041) 2(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644007) 3(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都，611137) 4(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京，100049)

白酒是我國(guó)一類重要的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。早在9 000 年前，中華民族的祖先就開(kāi)始了白酒釀造，在距今 2 000 多年的西漢時(shí)期，便開(kāi)始蒸餾酒的生產(chǎn)[1]。無(wú)疑，白酒是幾千年來(lái)中華民族勞動(dòng)人民智慧的結(jié)晶。作為世界六大蒸餾酒之一，中國(guó)白酒歷史底蘊(yùn)豐厚，深受人們喜愛(ài)，白酒文化已經(jīng)滲透到生活的各個(gè)方面。我國(guó)已經(jīng)成為世界上最大的蒸餾酒生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)家。白酒的釀造技術(shù)從古沿用至今，經(jīng)過(guò)一代一代的傳承與創(chuàng)新，已經(jīng)在世界釀造發(fā)展史上獨(dú)樹(shù)一幟。用曲釀酒是中國(guó)白酒釀造的特殊工藝，這也是與其他蒸餾酒區(qū)別的地方。作為有“酒之骨”之稱的酒曲，是我們民族的寶貴遺產(chǎn)[2-3]，它是以豌豆、小麥等為原料，經(jīng)過(guò)粉碎、加水后加以培養(yǎng)，以獲得利于發(fā)酵的微生物菌系和酶系[4]。酒曲是白酒釀造過(guò)程中不可或缺的一部分，在釀酒原料中占到20%左右，不僅具有糖化、發(fā)酵、生香、呈味的作用，而且直接影響到成品白酒的品質(zhì)與產(chǎn)酒率[5]。

近年來(lái)，隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)水平提高和消費(fèi)意識(shí)的改變，闡明白酒中的健康活性成分，開(kāi)發(fā)新型健康白酒成為了白酒發(fā)展的重要趨勢(shì)。白酒生產(chǎn)采用特殊的固態(tài)蒸餾工藝，導(dǎo)致一些高沸點(diǎn)的活性分子在共沸、蒸汽夾帶等作用下轉(zhuǎn)移到白酒產(chǎn)品中。目前，科研工作者利用現(xiàn)代分析技術(shù)和手段已經(jīng)從白酒產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)了氨基酸、多肽等高沸點(diǎn)天然活性成分[6-8]。大曲是白酒生產(chǎn)的重要原料，大曲中的活性成分是白酒活性成分的重要來(lái)源。研究和闡明大曲中的天然活性分子，可為白酒釀造工藝的改進(jìn)和創(chuàng)新，生產(chǎn)富含健康活性成分的白酒產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。我們既往對(duì)釀酒大曲中的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究工作，已在洋河大曲中發(fā)現(xiàn)核苷等活性化合物[9]。

五糧液是中國(guó)名酒之一，為濃香型白酒的典型代表，其香味悠久，入口甘綿，各味諧調(diào)，以精良的釀酒工藝和卓越的成酒品質(zhì)聞名于世。五糧液釀酒大曲對(duì)五糧液白酒產(chǎn)品質(zhì)量的貢獻(xiàn)是不言而喻的。目前，關(guān)于五糧液大曲的研究主要集中于微生物菌群的鑒別[10]和香味物質(zhì)的分析[11-12]，而對(duì)大曲高沸點(diǎn)難揮發(fā)化學(xué)成分的系統(tǒng)研究尚未開(kāi)展。基于此，本實(shí)驗(yàn)以五糧液大曲作為研究對(duì)象，利用正相硅膠柱、凝膠色譜、高效液相色譜等方法對(duì)大曲的乙醇提取物化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，首次發(fā)現(xiàn)五糧液釀酒大曲中含有生理活性廣泛、安全可靠的阿魏酸類抗氧化活性成分，這為從白酒產(chǎn)品發(fā)現(xiàn)健康活性成分提供了科學(xué)基礎(chǔ)，有利于推動(dòng)中國(guó)白酒的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薄層層析硅膠(254 nm)、柱層析硅膠(100～200目、200～300目)，青島海洋化工廠；反相硅膠，蘇州納微生物科技有限公司；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20，GE Healthcare Bio-Sciences AB；甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚(工業(yè)級(jí))，重蒸后使用；乙醇(分析純)，成都科隆化學(xué)品有限公司；過(guò)硫酸鉀，上海麥克林生化科技有限公司；Tris-HCl，北京索萊寶科技有限公司；DPPH粉末、ABTS粉末，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；大曲，四川宜賓五糧液酒廠。

1.2 儀器與設(shè)備

BrukerAvance 400 MHz核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))、BrukerDaltonics BioTOF-Q質(zhì)譜儀，瑞士Bruker公司；LC-100高效液相色譜儀，上海伍豐科學(xué)儀器有限公司；Spectra Max M5多功能讀數(shù)儀，美谷分子儀器有限公司；BSZ-100自動(dòng)部分收集儀，蘇州江東精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取與分離

稱取30 kg大曲，粉碎后加入90 L的甲醇浸泡提取，每次5 d，共提取2次(如圖1所示)。提取液過(guò)濾后合并，經(jīng)旋蒸儀減壓濃縮獲得總浸膏420 g。將總浸膏加入5 L蒸餾水，于60 ℃分散均勻，然后置于分液漏斗中，依次用石油醚(5 L)、乙酸乙酯(5 L)和正丁醇(5 L)萃取、每種溶劑萃取3次，分別將萃取液合并減壓濃縮，獲得石油醚浸膏(199 g)、乙酸乙酯浸膏(100 g)和正丁醇浸膏(90 g)。

圖1 大曲中酚類活性物質(zhì)分離流程Fig.1 Isolation of phenolic compounds from Daqu

將石油醚浸膏(199 g)與等重量的硅膠(200～300目)拌和均勻，然后通過(guò)中壓柱層析進(jìn)行初步色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(體積比為1∶0,20∶1,10∶1,5∶1,2∶1,1∶1,0∶1)梯度洗脫，分段收集。經(jīng)薄層層析色譜(thin layer chromatography,TLC)分析，合并得到P1-Q11共18個(gè)組分(P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、Q-1、Q-2、Q-3、Q-4、Q-5、Q-6、Q-7、Q-8、Q-9、Q-10、Q-11)。其中Q-2段經(jīng)TCL分析在254 nm下有紫外吸收，將該段過(guò)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱層析，以氯仿-甲醇體系(1∶1,體積比)洗脫，以自動(dòng)部分收集儀收集樣品，經(jīng)TLC分析合并得到2個(gè)主點(diǎn)，該部分樣品在氯仿：甲醇體系中重結(jié)晶，得到化合物1、2和3的混合物(圖2)。

將乙酸乙酯浸膏(100 g)與硅膠拌和均勻后，進(jìn)行正相硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為流動(dòng)相(1∶0,50∶1,30∶1,10∶1,5∶1,2∶1,1∶1，0∶1,體積比)梯度洗脫，經(jīng)TLC分析后合并為28個(gè)小段，分別編號(hào)EA-1～EA28。其中EA-5經(jīng)TCL分析在254 nm下有紫外吸收，將該段過(guò)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱，流動(dòng)相為氯仿-甲醇(1∶1)，由自動(dòng)部分收集儀分段收集樣品，TLC分析合并后得到化合物4、5和6(圖2)。

圖2 五糧液大曲分離的化合物(1～6)結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of the compounds(1-6) from Daqu

1.3.2 抗氧化活性測(cè)試

本實(shí)驗(yàn)對(duì)化合物(1-3)和(4-6)的DPPH·、ABTS+·和O2·的清除能力進(jìn)行了測(cè)定[13]，以評(píng)價(jià)它們的抗氧化活性。

1.3.2.1 DPPH實(shí)驗(yàn)

精密稱取DPPH粉末58.9 mg，以乙醇溶解并定容至100 mL，置-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)將此液以乙醇稀釋20倍，即配即用。將290 μL DPPH溶液加入已置于96孔板的10 μL樣品液中，室溫下避光反應(yīng)30 min后，在517 nm處以多功能讀數(shù)儀測(cè)定反應(yīng)液的吸收值。

1.3.2.2 ABTS實(shí)驗(yàn)

精密稱取ABTS粉末96.2 mg和過(guò)硫酸鉀16.5 mg，以水溶解并定容至25 mL，避光反應(yīng)16 h后轉(zhuǎn)置4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)取此液350 μL以80%乙醇稀釋至25 mL，即配即用。將250 μL ABTS溶液加入已置于96孔板的10 μL樣品液中，室溫下避光反應(yīng)5 min后，即在734 nm處以多功能讀數(shù)儀測(cè)定反應(yīng)液的吸收值。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)

以16 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)分別配制150 μmol/L NBT、234 μmol/L NADH和30 μmol/L PMS溶液，置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)往已置于96孔板的10 μL樣品液中依次加入NBT溶液100 μL， NADH溶液100 μL和PMS溶液100 μL。室溫下反應(yīng)5 min后，即在560 nm處以多功能讀數(shù)儀測(cè)定反應(yīng)液的吸收值。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1、2和3為白色粉末，以混合物的形式分離得到。分析其1H NMR譜圖可以發(fā)現(xiàn)，在高場(chǎng)區(qū)域δH0.89處有一個(gè)呈三重峰的甲基信號(hào)，δH1.28處有多個(gè)重疊的亞甲基信號(hào)，δH2.49處有一個(gè)呈三重峰的亞甲基信號(hào)，上述信號(hào)表示該化合物中含有一個(gè)飽和的脂肪長(zhǎng)鏈。在低場(chǎng)區(qū)域，位于δH6.19(1H,t,J=2.2 Hz,H-2)和6.26(2H,d,J=2.2 Hz,H-4)的信號(hào)表明，該化合物中含有一個(gè)對(duì)稱三取代苯基。進(jìn)一步分析13C NMR譜圖可以發(fā)現(xiàn)，在高場(chǎng)區(qū)域δC35.97、31.21、29.85(多個(gè)碳信號(hào)重疊)、29.81、29.74、 29.67、29.44、29.52、22.85和14.28的信號(hào)屬于典型的飽和脂肪長(zhǎng)鏈信號(hào)，同時(shí)低場(chǎng)區(qū)域的δC156.7、100.24、108.17和146.32 的信號(hào)確定該化合物含有羥基對(duì)稱取代的苯基。分析質(zhì)譜可以發(fā)現(xiàn)，該化合物的質(zhì)譜中含有3個(gè)準(zhǔn)分子離子峰m/z377.16 [M+H]+、405.19 [M+H]+和433.24 [M+H]+，且3個(gè)準(zhǔn)分子離子峰之間依次相差28，即2個(gè)CH2的分子質(zhì)量數(shù)。仔細(xì)分析1H NMR長(zhǎng)鏈的末端甲基信號(hào)也可以確定其為混合物。通過(guò)與文獻(xiàn)中報(bào)道的核磁數(shù)據(jù)[14]對(duì)比，最后將該化合物鑒定為5-正十九烷基雷鎖辛(1,5-n-nonadecylresorcinol)、5-正二十一烷基雷鎖辛(2,5-n-heneicosyresorcinol)和5-正二十三烷基雷鎖辛(3,5-n-tricosylresorcinol)。其理化數(shù)據(jù)如下：m/z377.16 [M+H]+,405.19 [M+H]+,433.24 [M+H]+;1H-NMR(400 MHz,CDCl3): δH6.26(2H,d,J=2.2 Hz,H-4),6.19(1H,t,J=2.2 Hz,H-2),4.90(2H,brs,OH),2.49(2H,t,J=7.3 Hz,H-1′),1.28(overlapped),0.89(3H,t,J=6.8 Hz,CH3)；13C-NMR(100 MHz,CDCl3): δC156.7(C-1,3),100.24(C-2),108.17(C-4,6),146.32(C-5),35.97(C-1′),31.21(C-2′),29.85(C-3′～C-18′),29.81(C-19′),29.74(C-20′),29.67(C-21′),29.44(C-22′),29.52(C-23′),22.85(C-24′),14.28(C-25′)。

化合物4、5和6結(jié)構(gòu)極為相似，常規(guī)色譜技術(shù)難以分離純化，以混合物形式分離得到，為黃色油狀。分析1H-NMR可以發(fā)現(xiàn)，在低場(chǎng)區(qū)域具有兩組明顯的ABX體系取代的苯環(huán)[δH7.03(1H,d,J=1.8 Hz,H-2),7.07(1H,dd,J=8.3,1.8,H-6)和6.90(1H,d,J=8.3 Hz,H-5); 7.72(1H,d,J=1.8 Hz),7.11(1H,dd,J=8.3,1.8,H-6′)和6.88(1H,d,J=8.3 Hz,H-5′)]。另外，在低場(chǎng)區(qū)域還含有一對(duì)反式雙鍵[δH6.29,7.61(1H,d,J=15.7 Hz,H-8,H-7)]和一對(duì)順式雙鍵氫信號(hào)[5.81,6.78(1H,d,J=13.0 Hz,H-8′,H-7′)]，在δH3.92和3.91分別含有一個(gè)甲氧基信號(hào)。上述信號(hào)提示該化合物中含有一個(gè)順式和一個(gè)反式的阿魏?；Ａ硗猓搔腍4.14和4.17(各2H,t,J=6.6 Hz)、以及δH1.25的多個(gè)CH2重疊的氫信號(hào)，可以推出該化合物含有一個(gè)長(zhǎng)鏈的二醇單元。同時(shí)，由13C NMR譜圖低場(chǎng)區(qū)域的18個(gè)碳信號(hào)和高場(chǎng)區(qū)域的長(zhǎng)鏈飽和脂肪二醇信號(hào)，可以進(jìn)一步確定該化合物含有兩個(gè)阿魏?；烷L(zhǎng)鏈脂肪二醇結(jié)構(gòu)單元。進(jìn)一步的質(zhì)譜分析可以發(fā)現(xiàn)，在其質(zhì)譜中存在3個(gè)分子離子峰m/z547.39 [M+H]+、575.43 [M+H]+和603.46 [M+H]+，表明該混合物由3個(gè)化合物組成，分子質(zhì)量依次相差28，即相差2個(gè)CH2。最后通過(guò)與文獻(xiàn)[15]比對(duì)，確定其結(jié)構(gòu)分別為(1E,22Z)-1,22-diferuloyloxydocoane(4)，(1E,24Z)-1,24-diferuloyloxyteracosane(5)和(1E,22Z)-1,26-diferuloyloxyhexacosane(6)。其理化數(shù)據(jù)如下：1H-NMR(400 MHz,CDCl3) δ：1.25(38H,brs),4.14,4.17(2H， t,J=6.6 Hz),3.92(6H,s,OMe-3、OMe-3′),5.84(2H,s,OH-4和OH-4′),5.81,6.78(1H,d,J=13.0 Hz,H-8′,H-7′),6.29,7.61(1H,d,J=15.7 Hz,H-8,H-7),6.88,6.90(1H,d,J=8.3 Hz,H-5,H-5′),7.03,7.72(1H,d,J=1.8 Hz,H-2,H-2′),7.07,7.11(1H,dd,J=8.3,1.8 Hz,H-6,H-6′);13C NMR(CDCl3,100 MHz) δ：29.9,29.5(n-CH2),65.1(O-CH2),56.62,56.10(OMe-3,OMe-3′),109.5(C-2),113.0(C-2′),113.9(C-5),114.9(C-5′),116.5(C-8),117.8(C- 8′),123.18(C-6),125.68(C-6′),128.3(C-1),128.1(C-1′),143.2(C-7),144.5(C-7′),146.1(C-3),146.9(C-3′),147.1(C-4),148.0(C-4′),166.2(C-9),166.9(C-9′)。

2.2 抗氧化活性

在濃度為25.0 μmol/L時(shí)，化合物(1-3)的混合物對(duì)DPPH·的清除率為(32.2±0.4)%，對(duì)O2·的清除率為(36.3±0.5)%，對(duì)ABTS+·的清除能力為(8.6±0.2)%。在濃度為25.0 μmol/L時(shí)，化合物(4-6)的混合物對(duì)DPPH·的清除率是(62.3±0.5)%， 對(duì)O2·清除的清除率為(54.2±0.6)%，對(duì)ABTS+·的清除能力為(18.1±0.2)%。陽(yáng)性對(duì)照為維生素Vc，在濃度5.0 μmol/L，其對(duì)DPPH·清除率為(48.6±0.5)%，對(duì)O2·清除率為(87.6±0.3)%，對(duì)ABTS+·的清除率為(18.3±0.6)%，如圖3所示。

圖3 化合物(1-3),( 4-6)的混合物分別對(duì)3種自由基的清除率Fig.3 The free radical scavenging rates and the superoxide anion radical scavenging rates of mixtures(1-3) and(4-6)

多酚類物質(zhì)具有多種生物功能，對(duì)人體健康有益，且其中大部分具有減少或清除自由基的能力?；钚詫?shí)驗(yàn)表明，在DPPH·及ABTS+·清除實(shí)驗(yàn)中，化合物(4-6)的混合物對(duì)自由基的清除率大于或等于Vc；在O2·清除實(shí)驗(yàn)中，也有較強(qiáng)的清除自由基的能力?；衔?4-6)為相差(CH2)2的同系物，含有一個(gè)順式和反式阿魏酰基，天然產(chǎn)物中有不少的化合物含有阿魏?；哂休^好的生物活性，如中藥姜黃的有效成分“雙阿魏?；淄椤保鋵?duì)乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)有抑制作用[16]；阿魏酸乙酯具有抑制由二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集的作用[17]；另外，一些阿魏酸衍生物也具有抗氧化、抗腫瘤及增強(qiáng)免疫功能等活性[18]。同時(shí)，化合物1-3的混合物也具有良好的自由基清除能力，但其抗氧化活性比化合物4-6偏低。HOU等[19]的研究中表明，化合物分子中羥基的位置與其自由基清除活性有關(guān)，并且清除能力大小受多種因素影響。

3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)以濃香型白酒五糧液的大曲為研究對(duì)象，利用色譜分離技術(shù)對(duì)大曲中的多酚類化學(xué)成分進(jìn)行了分離和鑒定，確定了6個(gè)阿魏酸類小分子化合物。根據(jù)結(jié)構(gòu)特征，可以分為兩類，其中化合物(1-3)為間二苯酚烷基雷鎖辛化合物，化合物(4-6)為對(duì)稱的阿魏酸飽和脂肪二酯?；衔?1-3)主要存在于高等植物中，以小麥、黑麥、玉米等禾本科糧食作物的種子主，在微生物、藻類、動(dòng)物的次級(jí)代謝產(chǎn)物中也有少量分布。該類化合物具有十分廣泛的生物活性，如抗氧化、降血脂、抗菌、抗腫瘤等。由此可見(jiàn)，化合物(1-3)是一類十分安全而具有廣泛活性的重要天然產(chǎn)物。化合物(4)和(5)僅在藤黃科植物木竹子(Garciniamultiflora)以混合物的形式發(fā)現(xiàn)，未研究其活性[20]。經(jīng)過(guò)SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)查詢檢索，化合物(6)的結(jié)構(gòu)尚未見(jiàn)到報(bào)道，為新化合物。本論文首次在大曲中發(fā)現(xiàn)它們的存在，活性研究表明，化合物(4-6)具有較顯著的抗氧化活性。本研究為中國(guó)白酒中尋找和發(fā)現(xiàn)健康活性成份奠定了一定的基礎(chǔ)，也為中國(guó)白酒的發(fā)展和創(chuàng)新指出了一個(gè)新的方向。