西藏靈菇中高產(chǎn)雙乙酰乳酸菌分離篩選及產(chǎn)香特性研究

田懷香，史雨樺，張燕，陳臣，于海燕

(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海，201418)

酸奶是一種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，因其風(fēng)味獨(dú)特和營(yíng)養(yǎng)豐富深受消費(fèi)者喜愛。風(fēng)味是評(píng)價(jià)酸奶品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[1]，它影響消費(fèi)者對(duì)酸奶品質(zhì)的認(rèn)可程度[2]，也是指導(dǎo)新產(chǎn)品研發(fā)的方向[3]。

乳酸菌在酸奶發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)產(chǎn)生一系列酶，催化糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的水解反應(yīng)，生成可揮發(fā)性化合物，影響或改變酸奶的香氣[4]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者圍繞如何通過(guò)內(nèi)源調(diào)控的方法增強(qiáng)酸奶香氣品質(zhì)開展了大量研究。如改變現(xiàn)有的酸奶發(fā)酵劑中菌株組成，即在保證酸奶正常生產(chǎn)的前提下，添加或增大產(chǎn)香菌的比重，使酸奶本身可以產(chǎn)生更為豐富的香氣化合物[5]；誘變或篩選新型的具有更高產(chǎn)香能力的乳酸菌用于酸奶發(fā)酵，從而使得酸奶的香氣品質(zhì)有所提高[6]；進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化或添加輔助乳酸菌產(chǎn)香的物質(zhì)，從而改變酸奶香氣品質(zhì)[7]。

西藏靈菇，又名藏靈菇，是一種棲息著乳酸菌和酵母菌等多種菌株的乳白色菌體，其本身具有抑菌，降血壓，抗氧化，延緩衰老和改善腸道菌群環(huán)境[8]等功能。近幾年科研人員主要對(duì)西藏靈菇的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究[9]。劉宇峰等[9]對(duì)西藏靈菇中菌群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，西藏靈菇中的真菌多為酵母類，包括克魯維酵母等，細(xì)菌類主要為乳酸菌，包括桿菌和鏈球菌等。王興興[10]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌是西藏靈菇中的優(yōu)勢(shì)菌群，包含乳桿菌屬、乳球菌屬和腸球菌屬等。

雙乙酰是酸奶特征風(fēng)味物質(zhì)之一，具有奶油香型，常被用于評(píng)價(jià)酸奶香氣品質(zhì)[11]，因此本研究選擇雙乙酰生產(chǎn)能力作為乳酸菌產(chǎn)香能力的衡量指標(biāo)，擬從西藏靈菇中分離高產(chǎn)雙乙酰的乳酸菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA基因序列分析技術(shù)對(duì)乳酸菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，并對(duì)該菌株的生長(zhǎng)特性進(jìn)行測(cè)定，最后通過(guò)與空白酸奶(傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵)對(duì)比，確定該菌株在酸奶香氣品質(zhì)改進(jìn)中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

西藏靈菇采自西藏自治區(qū)那曲地區(qū)。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

全脂牛奶，光明乳業(yè)股份有限公司；商業(yè)化菌粉(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌)，科漢森有限公司；MRS培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；2-辛醇(C7-C30：色譜純)，美國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

顯微鏡，上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司；pH計(jì)，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；GC7890-MS5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國(guó)Supelco公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 西藏靈菇樣品采集

將采集得到的西藏靈菇置于無(wú)菌牛奶中，4 ℃恒溫保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 乳酸菌的分離與純化

將采集得到的西藏靈菇用無(wú)菌生理鹽水充分沖洗，待水分減少后，將西藏靈菇置于牛奶中，25 ℃培養(yǎng)，傳代3次以上使其恢復(fù)活力。

將活化好的西藏靈菇置于無(wú)菌生理鹽水中搗碎，混勻，梯度稀釋，并涂布于MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)36～48 h。選取大小不同的菌落進(jìn)行純化，純化3～5次之后將菌株保存于30%甘油中，凍存于-25 ℃冰箱中待用。

1.2.3 酸奶制備

篩選菌株酸奶制備：將上述疑似乳酸菌菌株在MRS液體培養(yǎng)基中活化3代后，將菌懸液于6 000 r/min條件下離心10 min，用無(wú)菌水清洗菌體2～3次之后，加入等體積的無(wú)菌水將菌體混勻，待用。將上述菌懸液按照5%(體積分?jǐn)?shù))的比例接種于牛奶中，并加入傳統(tǒng)發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌(1×106CFU，用于凝乳)，37 ℃培養(yǎng)至凝乳，得到酸奶，4 ℃保存待測(cè)。

空白酸奶制備：將傳統(tǒng)發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌按5%(體積分?jǐn)?shù))的比例接種于牛奶中，37 ℃培養(yǎng)9 h，得到空白酸奶，4 ℃保存待測(cè)。

酸奶共制備3批樣品，每批樣品至少含3組平行。

1.2.4 酸奶中雙乙酰含量測(cè)定

(1)酸奶前處理

取制備好的酸奶，按照1∶1的質(zhì)量比加入160 g/L三氯乙酸溶液，振蕩搖勻，3 500 r/min條件下離心10 min， 取上清液備用。

(2)雙乙酰含量測(cè)定

參照李妍等[12]的方法測(cè)定酸奶中雙乙酰含量，取不同菌株酸奶處理液10 mL，測(cè)定OD335 nm值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中雙乙酰的含量，每株菌測(cè)定3次。

1.2.5 乳酸菌的鑒定

將1.2.4中篩選出的雙乙酰產(chǎn)量較高的乳酸菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)、接觸酶實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列鑒定。將獲得的未知菌株的16S rDNA序列與GenBank中已知菌株序列進(jìn)行類比，尋找同源性最高的菌株，并下載該菌屬內(nèi)其他菌株的基因序列，利用MEGA 5.05對(duì)所有序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建。

1.2.6 最適生長(zhǎng)溫度測(cè)定

將分離得到的乳酸菌以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于含有5 g/L蛋白胨的牛奶中，分別置于15、25、32、37、40和45 ℃培養(yǎng)8 h，將得到的液體10倍梯度稀釋，涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。每個(gè)溫度下測(cè)定3次。

1.2.7 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將分離得到的乳酸菌按照5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于含有5 g/L蛋白胨的牛奶中，置于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)，每隔1～2 h取一定的發(fā)酵液，10倍梯度稀釋，涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。每個(gè)取樣點(diǎn)重復(fù)3次。

1.2.8 酸奶香氣化合物分析

將篩選菌株酸奶和空白酸奶放置于4 ℃冰箱中后熟24 h，取約5 g酸奶樣品于15 mL固相微萃取小瓶?jī)?nèi)，加入內(nèi)標(biāo)物，混勻。將固相微萃取小瓶固定于一定溫度水浴鍋中，保證水浴的液面高于樣品的液面，采用老化好的萃取頭進(jìn)行萃取處理。萃取條件為：萃取頭50/30μm DVB/CAR/PDMS，萃取溫度55 ℃，萃取時(shí)間40 min。

GC條件：色譜柱：HP-INNOWax毛細(xì)管柱(60×0.25 mm×0.25μm；美國(guó)J&W公司)；進(jìn)樣口溫度：230 ℃；升溫程序：60 ℃恒溫3 min，以5 ℃/min速率升溫至230 ℃，保持10 min；載氣：He；流速：1 mL/min；不分流進(jìn)樣。

MS條件：離子源溫度：230 ℃；電離源：EI；電子能量70eV；掃描范圍：20～350amu；全離子掃描模式。

定性分析：將C7-C30的烷烴標(biāo)樣進(jìn)入GC-MS分析，根據(jù)正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間計(jì)算檢測(cè)物質(zhì)的保留指數(shù)(RI)。利用全離子掃描的質(zhì)譜圖，比對(duì)NIST和Wiley 7n.1數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖，并與文獻(xiàn)中的RI值進(jìn)行比對(duì)，從而確定某種物質(zhì)。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析[13]。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SAS v8(North Carolina State University，USA)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行了T檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同菌株發(fā)酵酸奶中雙乙酰含量對(duì)比

用MRS培養(yǎng)基對(duì)西藏靈菇中的乳酸菌進(jìn)行選擇性分離純化，挑選共116株疑似乳酸菌進(jìn)行酸奶制備，分別檢測(cè)其雙乙酰含量。其編號(hào)分別為1-1到1-36、2-1到2-40和3-1到3-40，分別代表篩選的3批菌株。以空白(傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵)酸奶中的雙乙酰含量為基準(zhǔn)，不同菌株發(fā)酵酸奶雙乙酰含量見圖1。

圖1 不同菌株發(fā)酵酸奶中雙乙酰含量對(duì)比圖Fig.1 Comparison of diacetyl content in the yoghurts fermented by different strains

圖1中水平線代表空白酸奶的雙乙酰產(chǎn)量，共有26株菌發(fā)酵酸奶的雙乙酰產(chǎn)量高于空白發(fā)酵酸奶，即1-16、1-19、1-23、1-33、1-34、2-28、2-34和3-29等。對(duì)上述具有較高雙乙酰生產(chǎn)能力的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和接觸酶試驗(yàn)[14]，最終挑選具有較高雙乙酰生產(chǎn)能力，并且革蘭氏染色位陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶為陰性的菌株1-33進(jìn)行后續(xù)相關(guān)研究。

2.2 乳酸菌鑒定

對(duì)2.1中挑選出來(lái)的菌株1-33進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，菌落特征觀察主要是在選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行，細(xì)菌形態(tài)特征主要是利用顯微鏡觀察[15]，菌株1-33的形態(tài)學(xué)特征見圖2。

a-菌株的菌落形態(tài)；b-菌株的菌體形態(tài)圖2 菌株1-33的形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphological characteristic of 1-33 production strains

由圖2可知，菌株1-33的菌落為圓型，邊緣完整，隆起，表面光滑，有光澤，乳白色，不透明，質(zhì)地光滑；光學(xué)顯微鏡下為短桿狀，不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色均為陽(yáng)性，符合乳桿菌的形態(tài)學(xué)特征[16]。

2.3 16S rDNA基因序列分析

16S rDNA的測(cè)序結(jié)果顯示1-33基因序列大小為1 459 bp，測(cè)序結(jié)果利用Blast進(jìn)行同源性分析，根據(jù)對(duì)比結(jié)果分析菌株，結(jié)果表明該菌株與與植物乳桿菌H2(Sequence ID: HQ286594.1)的相似度最高，相似度>99%，因此判斷為植物乳桿菌。利用MEGA 5.05軟件，進(jìn)行多序列比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(見圖3)。

圖3 篩選乳酸菌基于16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree of the screened Lactobacillus based on 16S rDNA gene sequences

由系統(tǒng)發(fā)生樹可知，菌株1-33與植物乳桿菌在同一分支上，證明其親緣關(guān)系最近，所以可以判定它們隸屬于植物乳桿菌種，并且與發(fā)酵乳桿菌，淀粉乳桿菌和德氏乳桿菌親緣關(guān)系都較近，形成第一類群。

2.4 菌株1-33的最適生長(zhǎng)溫度測(cè)定

溫度可以對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)狀況及代謝活動(dòng)產(chǎn)生較大影響，環(huán)境溫度較低時(shí)，乳酸菌的生長(zhǎng)較為緩慢，代謝活動(dòng)也受到一定的抑制，乳酸和其他產(chǎn)物的生產(chǎn)量較低，進(jìn)而影響酸奶品質(zhì)[17]；環(huán)境溫度升高，菌體的生長(zhǎng)速率加快，使乳酸菌到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定期的時(shí)間縮短[18]，但是過(guò)高的培養(yǎng)溫度也會(huì)使得乳酸菌的生長(zhǎng)被抑制，甚至導(dǎo)致菌株死亡。因此尋找最適合乳酸菌生長(zhǎng)的溫度，是保證其發(fā)酵酸奶具有較高品質(zhì)的方法之一。測(cè)定菌株1-33的最適溫度，結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌株1-33最適生長(zhǎng)溫度Fig.4 The optimum growth temperature of 1-33 production strains

由圖4可知，菌株1-33的生長(zhǎng)溫度范圍較廣，15～45 ℃都生長(zhǎng)，30～40 ℃生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃。進(jìn)行不同菌株最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定，是為后期實(shí)驗(yàn)提供了確切實(shí)驗(yàn)溫度，確保不同菌株都有較好的生長(zhǎng)狀態(tài)，因此整個(gè)研究中，在37 ℃對(duì)菌株1-33進(jìn)行培養(yǎng)，從而保證其生長(zhǎng)狀態(tài)達(dá)到最佳。

2.5 菌株1-33的生長(zhǎng)曲線

乳酸菌是通過(guò)分裂的方式進(jìn)行繁殖，整個(gè)生長(zhǎng)歷程從緩慢期開始，經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期，然后最后走向衰亡期[19]，本研究篩選菌株1-33的生長(zhǎng)曲線見圖5。

圖5 菌株1-33生長(zhǎng)曲線的測(cè)定Fig.5 The grown curve of 1-33 production strains

1-33菌株在0～2 h左右為生長(zhǎng)緩慢期，這個(gè)階段乳酸菌的數(shù)目基本保持恒定，有時(shí)甚至?xí)p少，但是這個(gè)時(shí)期的乳酸菌菌體體積明顯增大，并且有較旺盛的代謝活動(dòng)；2 h之后菌株的OD600 nm值迅速增大，即該階段菌體數(shù)目迅速增長(zhǎng)，乳酸菌開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，該時(shí)期的特征之一即菌數(shù)增長(zhǎng)迅速，代謝活動(dòng)更為活躍；在11 h左右該菌株逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，在該時(shí)期的乳酸菌的數(shù)量保持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡階段，OD600 nm值基本不變。生長(zhǎng)曲線的結(jié)果可以清晰的看到不同菌株在不同培養(yǎng)周期內(nèi)的生長(zhǎng)狀況[20]，為后期進(jìn)行酸奶制備提供一定的參考。

2.6 酸奶香氣化合物分析

對(duì)篩選菌株1-33制備的酸奶進(jìn)行香氣化合物分析，共測(cè)定出22種香氣化合物。包括酮類13種，酸類4種，含硫化合物1種，芳香族化合物2種和醇類2種；傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵酸奶即空白酸奶中共檢測(cè)出19種化合物，其中酮類11種，酸類3種，含硫化合物1種，芳香族化合物2種和醇類2種，具體結(jié)果如表1所示。

表1 篩選菌株1-33發(fā)酵酸奶和空白酸奶中香氣化合物分析(n=3,X±D)Table 1 Comparison results for the volatiles in the yogurts fermented with 1-33 and traditional cultures(n=3,X±D)

注：nf為沒(méi)有找到相關(guān)數(shù)據(jù)；nd為在當(dāng)前條件下該化合物低于檢測(cè)限，不能檢測(cè)到此物質(zhì)；RI為揮發(fā)性化合物的保留指數(shù)(INNOWAX柱)；RIL為在NIST Chemistry WebBook里面查找的INNOWAX柱檢測(cè)出的該物質(zhì)的保留指數(shù)；*為P<0.05，即1-33發(fā)酵酸奶與空白酸奶存在顯著性差異。

羰基化合物是酸奶中主要的揮發(fā)性化合物[21]，包括酮類物質(zhì)和醛類物質(zhì)。羰基化合物是乳酸菌在將牛奶中的乳糖分解，經(jīng)過(guò)糖代謝等途徑，轉(zhuǎn)化而來(lái)[22]。雙乙酰，其因具有獨(dú)特的奶油香型而被認(rèn)為是酸奶中最主要的羰基化合物之一，可賦予酸奶精致且飽滿的香氣品質(zhì)，這一特性對(duì)于乙醛含量較低的酸奶十分重要[23]。通過(guò)表1可以看出，菌株1-33酸奶中的雙乙酰含量(11.13mg/L)是空白酸奶(傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵)的含量(3.36mg/L)的近4倍，顯著性差異，說(shuō)明1-33具有較高的雙乙酰生產(chǎn)能力，可以提高酸奶獨(dú)特的奶油香味，從而提高酸奶品質(zhì)。

乙醛對(duì)于酸奶整體風(fēng)味具有較大的影響[24]，純品乙醛具有辛辣刺鼻的味道，但是稀釋到一定的濃度會(huì)散發(fā)愉悅的水果香，乙醛賦予酸奶青蘋果和堅(jiān)果的香氣氣氛[11]。通過(guò)表1可以看出，空白發(fā)酵酸奶的乙醛含量為1.24 mg/L，菌株1-33發(fā)酵酸奶的含量為2.07 mg/L，篩選菌株1-33發(fā)酵酸奶的乙醛產(chǎn)量與空白發(fā)酵酸奶相當(dāng)。此外，乙偶姻也是重要的羰基化合物，其本身具有淡奶油的香氣，雖然其閾值(1 mg/L)高于雙乙酰(0.2 mg/L)，但是乙偶姻的存在可以降低雙乙酰的尖銳性，使得酸奶整體風(fēng)味更佳柔和、舒適[11]。由表1可知，1-33酸奶中乙偶姻的含量(38.92 mg/L)是空白酸奶中含量(25.46mg/L)的1.5 倍左右，在很大程度上改善了酸奶的整體風(fēng)味，提高了酸奶風(fēng)味的整體可接受性。研究表明，雙乙?？梢栽陔p乙酰還原酶的作用下可以轉(zhuǎn)化乙偶姻，所選菌株1-33除具有高產(chǎn)雙乙酰的能力外，還具有一定的生產(chǎn)乙偶姻的能力。

2-丙酮和2-丁酮也是衡量酸奶制品的重要的兩種化合物。丙酮具有甜香和果香，被認(rèn)為對(duì)酸奶品質(zhì)具有重要影響，酸奶中的丙酮，一部分來(lái)自牛乳，另外一部分由乳酸菌產(chǎn)生[25]。典型酸奶中丙酮的濃度為0.3～4.0 mg/L[24]，被研究中的空白酸奶(傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵)和篩選菌株1-33制備的酸奶中丙酮含量都在或者接近這個(gè)濃度范圍，這就說(shuō)明這兩種酸奶中丙酮的含量適宜，符合酸奶的品質(zhì)要求。2-丁酮的香氣類型和丙酮的類似，都具有果香[26]，研究表明，2-丁酮可以刺激酸奶香氣的釋放[27]，并且對(duì)酸奶果香氣味具有較大的貢獻(xiàn)。

酸類化合物對(duì)酸奶的品質(zhì)具有十分重要的影響，雖然難揮發(fā)性酸對(duì)酸奶的品質(zhì)影響更大，但是適量的揮發(fā)性酸，也可以改善酸奶的香氣品質(zhì)。低濃度的乙酸可以賦予酸奶酸香，但是乙酸濃度過(guò)高，可能會(huì)讓酸奶具有醋的不良風(fēng)味[11]。乙酸在酸奶中含量在0.5～18.8 mg/L最為適宜[28]，含量過(guò)高則會(huì)產(chǎn)生醋味，使酸奶整體風(fēng)味不協(xié)調(diào)，也不容易被消費(fèi)者接受。在上述兩種酸奶中乙酸含量均低于18.8 mg/L，因此在正常的生產(chǎn)過(guò)程中，所篩選菌株不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的乙酸，從而影響酸奶香氣品質(zhì)。

其他類型的揮發(fā)性組分也有檢測(cè)出，但種類較少，例如含硫化合物，含氮化合物和醇類化合物等。含氮化合物一般是由蛋白質(zhì)和氨基酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，含硫化合物主要來(lái)自牛乳中的有機(jī)硫化物[29]，菌株不同其含量也有所差異。

3 結(jié)論

對(duì)西藏靈菇中高產(chǎn)雙乙酰的乳酸菌進(jìn)行篩選，最終獲得具有較高雙乙酰生產(chǎn)能力的菌株1-33。對(duì)其進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)鑒定，為植物乳桿菌。其最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，發(fā)酵酸奶中雙乙酰的含量是空白酸奶(傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵)含量的3倍左右，并且其特征香氣化合物總含量和總個(gè)數(shù)均優(yōu)于空白酸奶。因此，篩選的植物乳桿菌可以應(yīng)用于酸奶的制備，并且具有提升酸奶中雙乙酰含量的品質(zhì)，具有一定的市場(chǎng)前景。