• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    菊粉外切酶的異源表達、純化及酶學(xué)性質(zhì)

    2019-03-08 01:54:00馬俊安啟坤唐文竹
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:外切菊粉糖漿

    馬俊,安啟坤,唐文竹

    (大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連,116034)

    菊粉(inulin)是由D-果糖通過β-2,1-糖苷鍵連接而成的鏈狀多聚果糖,且末端以α-1,2-糖苷鍵連接有一個葡萄糖殘基[1]。菊粉作為一種儲備多糖,廣泛存在于植物的根和塊莖中,如菊芋(jerusalemartichoke)、菊苣(chicory)、大麗花(dahlia)和雪蓮果(yacon)等[2]。菊粉外切酶(exo-inulinase,EC 3.2.1.80)能從菊粉的非還原性末端的糖苷鍵開始逐一切下果糖基,因此可以用于水解菊粉生產(chǎn)高果糖漿(high fructose corn syrup, HFCS)[3-4]。高果糖漿具有低分子量、低熱量、高甜度、高滲透壓、高溶解度、沒有晶體形成等優(yōu)勢,在酸奶、冰淇淋、巧克力牛奶等乳制品中被廣泛用作一種重要的甜味劑,同時在制藥企業(yè)也用于制作膠囊配方和注射液等[5]。目前,高果糖漿的制備主要有化學(xué)法、發(fā)酵法和酶法。其中,由于化學(xué)法和發(fā)酵法制備高果糖漿具有產(chǎn)率低,操作復(fù)雜,成本高,副產(chǎn)物多等缺點,酶法制備高果糖漿成為目前食品工業(yè)采用的主要方法[6]。但從野生菌中分離獲得的外切菊粉酶活性較低,且制備工藝復(fù)雜,因此成本居高不下,限制了該酶在高果糖漿生產(chǎn)中的應(yīng)用。利用基因工程手段可以實現(xiàn)菊粉外切酶的高效表達,從而獲得高活性、高純度的菊粉外切酶,為菊粉外切酶水解菊粉生產(chǎn)高果糖漿奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株與質(zhì)粒

    類芽孢桿菌(Paenibacillussp. Lfos16)、 pET28-a(+)載體、克隆宿主大腸桿菌DH10B、表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)均由本實驗室保藏。

    1.1.2 試劑

    DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DpnI、抗生素(卡那霉素)、IPTG、核酸染料(Goldview II)等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR DNA聚合酶等均購自Takara公司。Ni sepharose 6 Fast Flow親和純化填料購自GE公司。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 10,pH 7.0;LLB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 5,pH 7.0。

    1.2 方法

    1.2.1 菊粉外切酶基因的克隆及重組菌構(gòu)建

    采用Restriction Free Cloning[7-8]的方法,以Paenibacillussp. Lfos16的基因組DNA為模板,通過引物P1:5’-CCGCGCGGCAGCCATATGATGAACGGCGGCAT CG-3’ 和P2: 5’- GATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTACTTCAACCCTCCTTGATGTCT -3’ 對菊粉外切酶基因進行擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后再將其克隆至pET28-a(+)載體。

    將2 μL上述克隆樣品加入到盛有100 μL新鮮制備的E.coliDH10B感受態(tài)細胞的管中,混勻內(nèi)溶物,冰浴5 min。冰浴結(jié)束即刻將混合物轉(zhuǎn)移至冷的電擊杯內(nèi),輕擊液體以確?;旌衔镂挥陔姄舯撞?,擦干電擊杯外壁的冷凝水和霧氣,將電擊杯放進電擊儀,調(diào)節(jié)電擊轉(zhuǎn)化儀參數(shù)至2.5 kV、25 μF和200 Ω電擊轉(zhuǎn)化。電擊結(jié)束后迅速加入900 μL LB培養(yǎng)基,混勻,轉(zhuǎn)移所有液體混合物到無菌的2 mL離心管,37 ℃、200 r/min溫育1 h。將200 μL已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上,37 ℃培養(yǎng)至長出適宜大小的單菌落。

    挑取單菌落提取質(zhì)粒,重組質(zhì)粒通過XbaI、EcoRV雙酶切驗證及DNA測序,將驗證正確的質(zhì)粒命名為pET28a-Exo-inu,并通過熱擊轉(zhuǎn)入E.coilBL21(DE3),于卡那霉素抗性篩選平板上生長的轉(zhuǎn)化子即為重組表達菌E.coilBL21(DE3)/ pET28a-Exo-inu。

    1.2.2 重組菌的誘導(dǎo)表達及純化

    接種菊粉外切酶重組表達菌至100 mL LLB(含30 μg/mL kanamycin)液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4~0.6,加入IPTG至終濃度1 mmol/L,于16 ℃、180 r/min誘導(dǎo)18 h;離心收集菌體沉淀,并用ddH2O洗滌菌體2次,離心后用15 mL native binding buffer(pH 7.5)重懸菌體,并進行超聲破碎。10 000 r/min,4 ℃離心10 min,收集上清液,即為粗酶液。

    用native elution buffer(pH 6.5)平衡系統(tǒng)B相,native binding buffer(pH 6.5)平衡A相和Ni2+親和層析柱。加入3 mL粗酶液在室溫下與填料于充分結(jié)合1 h。用native binding buffer(pH 6.5)洗層析柱,收集洗脫峰處樣品,即為穿出液;調(diào)節(jié)B相比例15%,使咪唑終濃度為75 mmol/L,洗滌層析柱,收集洗脫峰處樣品,即為洗雜液。調(diào)節(jié)B相比例100%,使咪唑終濃度為500 mmol /L進行洗脫,收集洗脫峰處樣品,即為洗脫液;

    分別取原酶液、穿出液、洗雜液、洗脫液進行SDS-PAGE檢測,確定純化效果。

    1.2.3 重組菊粉外切酶轉(zhuǎn)化菊粉產(chǎn)物分析

    450 μL 2%的菊粉溶液與50 μL純酶混合,于40 ℃下反應(yīng)10 min,沸水浴5 min終止反應(yīng)。10 000 r/min離心10 min,取上清液,采用TLC法[9]對產(chǎn)物組成進行確定。

    1.2.4 酶活測定方法及定義

    450 μL 2%的菊粉溶液或蔗糖溶液與50 μL純酶混合,以滅活的酶液與底物同比例混合做為對照,于40 ℃水浴反應(yīng)10 min,沸水浴5 min終止反應(yīng),用DNS法測還原糖生成量。將以菊粉和蔗糖為底物時測定的酶活分別記為I和S。

    酶活定義:上述反應(yīng)條件下,每分鐘生成1 μmol還原糖所需要的酶量為1個酶活單位。

    1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)測定

    以下測定中底物均為2%的菊粉溶液。

    ①最適反應(yīng)溫度:于不同溫度下測定酶活,根據(jù)相對酶活的大小確定最適反應(yīng)溫度;②溫度穩(wěn)定性:將純化后的酶液分別置于不同溫度下溫育2 h后,測定剩余酶活,根據(jù)相對酶活的大小確定溫度穩(wěn)定性;③最適反應(yīng)pH:將純化得到的酶液在不同pH緩沖液中測定酶活,根據(jù)相對酶活的大小確定最適反應(yīng)pH;④pH穩(wěn)定性:將純化后的酶液在不同pH緩沖液中,4 ℃靜置2 h后,測定剩余酶活,根據(jù)相對酶活的大小確定pH穩(wěn)定性;⑤金屬離子對酶活的影響:向酶促反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子使其終濃度為 5 mmol /L,以未處理酶酶活力為對照,計算加入金屬離子后的相對酶活;⑥動力學(xué)常數(shù)測定:不同濃度的菊粉溶液與純化后的酶液等體積混合,于最適條件下反應(yīng)10 min,測定還原糖的生成量。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法[10-11]計算出以菊粉為底物時重組外切菊粉酶的動力學(xué)常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菊粉外切酶基因的擴增

    以Lfos16的基因組為模板對菊粉外切酶編碼基因進行擴增,預(yù)期片段大小為2 305 bp。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢驗,其結(jié)果如圖1所示,產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致,且條帶單一。

    1-exo-inulinase gene;M-DNA Marker圖1 菊粉外切酶基因擴增結(jié)果Fig.1 Amplification products ofexo-inulinase gene

    2.2 pET28a-Exo-inu表達載體和工程菌的構(gòu)建

    挑取陽性克隆提取質(zhì)粒,經(jīng)XbaI、EcoRV雙酶切鑒定,預(yù)期得到大小分別為1 234 bp,1 957 bp和4 347 bp的3條片段。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切產(chǎn)物進行檢驗,結(jié)果如圖2所示, 1為重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果,大小與預(yù)期結(jié)果一致,將鑒定正確的質(zhì)粒進行測序,最終確定重組表達質(zhì)粒pET28a-Exo-inu成功構(gòu)建。將構(gòu)建成功的重組表達質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化至E.coilBL21(DE3),于卡那霉素抗性篩選平板上生長的轉(zhuǎn)化子即為重組表達菌E.coilBL21(DE3)/ pET28a-Exo-inu。

    1-重組質(zhì)粒;M-DNA Marker圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Detection of the recombinant plasmid pET28a-Exo-inu

    2.3 重組菊粉外切酶的誘導(dǎo)表達和分離純化

    按照1.2.2所述方法對重組表達菌E.coilBL21(DE3)/ pET28a-Exo-inu進行誘導(dǎo)表達,超聲破碎獲得粗酶液后,對重組菊粉外切酶進行純化,并收集各組分進行SDS-PAGE檢測,其結(jié)果如圖3所示。

    M-Marker;1-粗酶液;2-穿刺液;3-洗雜液;4-洗脫液圖3 重組菊粉外切酶的親和純化SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinantexo-inulinase after affinity purification

    帶有組氨酸標(biāo)簽的重組菊粉外切酶與Ni2+特異性結(jié)合,而不能與Ni2+結(jié)合的蛋白及結(jié)合能力弱的雜蛋白洗脫流出,最終獲得的單一條帶為電泳純的重組酶。SDS-PAGE檢測表明重組菊粉外切酶表觀分子量約為87 kDa,與理論大小一致。

    以菊糖為底物,重組菊粉外切酶的純化結(jié)果如表1所示。經(jīng)過Ni2+親和純化,純化倍數(shù)達到3.98倍,回收率為2.80%,比酶活為348.30 U/mg,相比文獻已報道的菊粉外切酶的比酶活高。RAM等[12]從PenicilliumoxalicumBGPUP-4分離純化得到兩種菊粉外切酶,以菊粉為底物的比酶活分別為113.19 U/mg和120.47 U/mg。

    表1 重組菊粉外切酶分離純化結(jié)果Table 2 Summary of recombinantexo-inulinase purification

    2.4 重組菊粉外切酶轉(zhuǎn)化菊粉產(chǎn)物分析

    重組菊粉外切酶與2%菊粉反應(yīng)產(chǎn)物TLC結(jié)果如圖4所示。

    1-菊粉;2-菊粉外切酶水解菊粉產(chǎn)物;3-葡萄糖;4-果糖圖4 重組菊粉外切酶菊粉水解產(chǎn)物的TLC分析Fig.4 TLC analysis of products from inulin by recombinant exo-inulinase

    可以看出反應(yīng)10 min后底物被完全降解,產(chǎn)生產(chǎn)物果糖(F)及少量葡萄糖(G),底物轉(zhuǎn)化率為100%。

    2.5 重組菊粉外切酶酶活測定

    以2%菊粉和2%蔗糖分別為底物測定酶活力,結(jié)果顯示,以菊粉為底物的酶活(I)為259.37 U/mL,以蔗糖為底物的酶活(S)為592.16 U/mL。粗酶液的I/S為0.438,I/S<1,表明該酶為菊粉外切酶[13-14]。

    2.6 重組菊粉外切酶酶學(xué)性質(zhì)測定

    2.6.1 重組菊粉外切酶的最適溫度與溫度穩(wěn)定性

    溫度對重組菊粉外切酶酶活的影響如圖5所示。

    圖5 溫度對重組外切菊粉酶酶活的影響Fig.5 Effects of temperature on activity of recombinant exo-inulinase

    重組菊粉外切酶的最適作用溫度為40 ℃;當(dāng)溫度低于40 ℃時,酶活隨溫度的升高而升高;當(dāng)溫度高于40 ℃時,酶活隨溫度的升高而降低,當(dāng)溫度在25~35 ℃時,具有80%以上的相對酶活。

    溫度對重組菊粉外切酶穩(wěn)定性的影響如圖6所示。重組菊粉外切酶在溫度低于30 ℃時具有較高的穩(wěn)定性,在低于30 ℃保溫2 h剩余酶活仍高于90%;當(dāng)溫度高于30 ℃時,剩余酶活很快降低,當(dāng)溫度達到35 ℃時,剩余酶活降至15%以下。

    圖6 溫度對重組外切菊粉酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of temperature on stability of recombinant exo-inulinase

    本研究中重組菊粉外切酶與文獻報道的來源于Paenibacillussp. d9 菌株的菊粉外切酶性質(zhì)比較接近,最適作用溫度均為40 ℃[15]。而與其他菊粉外切酶相比差別較大,來源于Aspergillusniger12的菊粉外切酶最適溫度是55 ℃,且在35~55 ℃靜置24 h后仍剩余80%以上的酶活[16]。來源于Aspergillusniger的菊粉外切酶最適溫度為60 ℃,在低于60 ℃保溫1 h依然有85%酶活性[17]。因此本研究中的重組菊粉外切酶屬于低溫酶,不但在低溫條件下可以高效反應(yīng),而且在生產(chǎn)工藝中可以通過較低溫度的熱處理使酶失活,節(jié)約能源和費用,這就使得低溫菊粉外切酶在菊粉來源高果糖漿的生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

    2.6.2 重組菊粉外切酶的最適pH與pH穩(wěn)定性

    pH對重組菊粉外切酶酶活的影響如圖7所示。重組菊粉外切酶的最適作用pH為6;當(dāng)pH低于6時,酶活隨pH的升高而升高;當(dāng)pH高于6時,酶活隨pH的升高而升降低,且當(dāng)pH達到7時,相對酶活降至40%以下。

    圖7 pH對重組菊粉外切酶酶活的影響Fig.7 Effects of pH on activity of recombinant exo-inulinase

    不同pH下重組菊粉外切酶的穩(wěn)定性如圖8所示。當(dāng)pH處于6.6~7.6時,重組菊粉外切酶具有較高的穩(wěn)定性,剩余酶活高于90%;當(dāng)pH低于6或高于8時,剩余酶活力降至40%以下。

    重組菊粉外切酶的最適作用pH與pH穩(wěn)定性與文獻報道基本一致。如李益民等[18]將來自于KluyveromycesmarxianusYX01的菊粉外切酶于PichiapastorisGS115中進行表達,重組菊粉外切酶的最適pH為4.62。KOBAYASHI等[19]將來源于Microbulbifersp. Strain JAM-3301的菊粉外切酶基因通過大腸桿菌進行表達,其最適pH為6.0,在pH 8~9相對穩(wěn)定。CHEN等[20]將AspergillusficuumJNSP5-06中的菊粉外切酶在大腸桿菌中進行過表達,其最適pH為4.0,并在pH為3.0~4.5時菊粉外切酶穩(wěn)定性較好。MA等[21]將Kluyveromycescicerisporus中的菊粉外切酶基因在PichiapastorisX-33中進行表達,其最適pH為4.5,在4 ℃,pH 3.0~6.0環(huán)境中溫育24 h時,能剩余90%酶活。

    2.7 金屬離子對菊粉外切酶活性的影響

    金屬離子對重組菊粉外切酶的影響如表2所示。其中,Li+對重組菊粉外切酶有一定的激活作用;其余金屬離子均有不同程度的抑制作用,其中Ag+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Hg2+、Fe3+對重組菊粉外切酶具有顯著抑制作用,剩余酶活降至10%以下。

    各種金屬離子對不同來源的菊粉外切酶的影響差異較大。其中Cu2+能夠完全抑制來源于AspergillusficuumJNSP5-06的菊粉外切酶酶活[20],而對來源于Aspergillusniger12的菊粉外切酶酶活具有激活作用[21];Fe2+、Zn2+及Mg2+對來源于PaenibacilluspolymyxaZJ-9的外切型菊粉酶的酶活具有輕微激活作用[22]。

    2.8 重外菊粉外切酶動力學(xué)常數(shù)測定

    采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖,以1/[S]為橫坐標(biāo),1/V為縱坐標(biāo),測得Km和Vmax的值,結(jié)果如圖9所示。得到的回歸方程為y=108.14x+5.608 1,R2=0.998 8。通過分析計算出以菊粉為底物時Km為19.28 mg/mL,Vmax為0.18 mg/(min·mL)。

    圖9 重組菊粉外切酶的Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.9 Lineweave-Burk double reciprocal curve of recombinant exo-inulinase

    來源不同的菊粉外切酶動力學(xué)常數(shù)差別較大,可能是由于酶活測定方法、底物組成以及計算方法等的差異引起的。其中CHEN等[20]在大腸桿菌中表達AspergillusficuumJNSP5-06中克隆出菊粉外切酶,以菊粉為底物的Km和Vmax分別為(7.1±0.2) mmol/L和(1 000.0±0.1) μmol/(min·mg)。MA等[21]將Kluyveromycescicerisporus中的菊粉外切酶基因在PichiapastorisX-33中進行表達,Km為0.322 mmol/L,Vmax為4 317 μmol/(min·mg)。李益民等[18]將來自于KluyveromycesmarxianusYX01的外切菊粉酶于PichiapastorisGS115中進行表達,以菊粉為底物時,Km和Vmax分別為80.53 g/L和4.49 g/(L·min)。

    3 結(jié)論

    通過RF克隆成功將來源于類芽孢桿菌Paenibacillussp. Lfos16的菊粉外切酶基因重組到pET-28a(+)表達載體上,并在E.coliBL21(DE3)實現(xiàn)了高效表達。通過鎳柱親和層析獲得了電泳純的重組菊粉外切酶。重組菊粉外切酶的表觀分子質(zhì)量為87 kDa,水解菊糖的產(chǎn)物為果糖,且I/S為0.438,確定為外切酶活性。以菊粉為底物,重組菊粉外切酶的比酶活為348.30 U/mg,最適作用溫度和pH分別為40 ℃和pH 6,且當(dāng)溫度低于30 ℃,pH在6.6~7.6時時酶活較穩(wěn)定;Ag+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Hg2+、Fe3+具有顯著抑制作用;重組菊粉外切酶對菊粉的Km為19.28 mg/mL,Vmax為0.18 mg/(min·mL)。

    猜你喜歡
    外切菊粉糖漿
    菊粉在凝固型發(fā)酵乳中的應(yīng)用
    關(guān)于橢圓外切平行四邊形的一個幾何不變量
    糖槭樹——流糖漿的樹
    探究拋物線內(nèi)接、外切三角形的性質(zhì)
    HPLC-ELSD法同時測定參麥止嗽糖漿中8種成分
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:23
    橢圓內(nèi)接外切六邊形的幾何特性研討
    枇杷糖漿
    圓外切三角形與圓的關(guān)系
    學(xué)習(xí)煮糖漿
    降脂減肥用菊粉
    黄片无遮挡物在线观看| 午夜激情久久久久久久| 91在线精品国自产拍蜜月| 午夜福利视频精品| 免费黄色在线免费观看| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久久精品免费免费高清| 亚洲久久久国产精品| 亚洲经典国产精华液单| 人妻夜夜爽99麻豆av| 午夜日本视频在线| av电影中文网址| 51国产日韩欧美| a级毛色黄片| 欧美 日韩 精品 国产| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产午夜精品一二区理论片| 色94色欧美一区二区| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲av中文av极速乱| 色婷婷av一区二区三区视频| 日本av手机在线免费观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产69精品久久久久777片| 国产在线一区二区三区精| 久久毛片免费看一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 中文欧美无线码| 日韩大片免费观看网站| 卡戴珊不雅视频在线播放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 精品视频人人做人人爽| 国产熟女欧美一区二区| 超色免费av| av在线观看视频网站免费| 十分钟在线观看高清视频www| 中国三级夫妇交换| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲av综合色区一区| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| kizo精华| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 高清av免费在线| 黄色毛片三级朝国网站| 如何舔出高潮| 麻豆成人av视频| 街头女战士在线观看网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 91精品国产九色| 国产精品99久久久久久久久| 午夜av观看不卡| 9色porny在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 极品人妻少妇av视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久 成人 亚洲| 中文字幕制服av| 亚洲在久久综合| 日本av免费视频播放| 一边亲一边摸免费视频| 午夜福利影视在线免费观看| 内地一区二区视频在线| 91精品三级在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品久久久久久电影网| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 在线观看免费高清a一片| 国产成人aa在线观看| 老熟女久久久| 成人免费观看视频高清| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 我要看黄色一级片免费的| 久久久久久久大尺度免费视频| 两个人免费观看高清视频| 国产av码专区亚洲av| 免费观看a级毛片全部| 国产精品免费大片| 国产老妇伦熟女老妇高清| 九九爱精品视频在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 最黄视频免费看| 久久久久人妻精品一区果冻| 秋霞在线观看毛片| 中文字幕久久专区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美日韩亚洲高清精品| 成年人免费黄色播放视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 精品久久久久久电影网| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲av免费高清在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品人妻久久久久久| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲欧洲国产日韩| 国产成人a∨麻豆精品| a级毛色黄片| 三级国产精品片| 久久久久精品性色| av女优亚洲男人天堂| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 另类亚洲欧美激情| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 日本wwww免费看| 国产黄片视频在线免费观看| 久久99热6这里只有精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 波野结衣二区三区在线| 少妇人妻 视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久久久久国产电影| 成年人免费黄色播放视频| 最新的欧美精品一区二区| 午夜激情久久久久久久| 久久久久网色| 美女中出高潮动态图| 伊人亚洲综合成人网| 爱豆传媒免费全集在线观看| 大香蕉97超碰在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产成人精品在线电影| 一级毛片 在线播放| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲成人一二三区av| 少妇的逼水好多| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 少妇人妻 视频| av免费在线看不卡| 丰满少妇做爰视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产熟女欧美一区二区| 国产一区亚洲一区在线观看| 高清欧美精品videossex| 乱人伦中国视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久99精品国语久久久| 精品久久国产蜜桃| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲av综合色区一区| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 97精品久久久久久久久久精品| 国产色婷婷99| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 777米奇影视久久| 中文字幕av电影在线播放| 特大巨黑吊av在线直播| 国产探花极品一区二区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 超碰97精品在线观看| 看免费成人av毛片| 精品国产一区二区久久| 国产免费一区二区三区四区乱码| 涩涩av久久男人的天堂| 人妻夜夜爽99麻豆av| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜激情av网站| 赤兔流量卡办理| 欧美日韩成人在线一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲av.av天堂| 欧美性感艳星| 久久精品久久久久久久性| kizo精华| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品午夜福利在线看| 麻豆乱淫一区二区| 日本免费在线观看一区| 国产高清有码在线观看视频| 国产av一区二区精品久久| 69精品国产乱码久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 99视频精品全部免费 在线| 多毛熟女@视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲精品aⅴ在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 母亲3免费完整高清在线观看 | 欧美日韩视频精品一区| 水蜜桃什么品种好| 精品酒店卫生间| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 婷婷色av中文字幕| 欧美xxⅹ黑人| 91久久精品国产一区二区成人| 天天影视国产精品| 成人黄色视频免费在线看| 人妻人人澡人人爽人人| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品人妻久久久影院| 欧美3d第一页| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产综合精华液| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 免费日韩欧美在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 人妻 亚洲 视频| 99热国产这里只有精品6| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产av精品麻豆| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 精品一品国产午夜福利视频| 七月丁香在线播放| 中文字幕制服av| 国产精品 国内视频| 中文字幕av电影在线播放| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久热精品热| 热99国产精品久久久久久7| 成年人免费黄色播放视频| √禁漫天堂资源中文www| 免费黄网站久久成人精品| 22中文网久久字幕| 免费观看的影片在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 多毛熟女@视频| 国产乱人偷精品视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 欧美精品亚洲一区二区| 免费高清在线观看日韩| 天堂8中文在线网| 欧美成人精品欧美一级黄| 日日啪夜夜爽| 水蜜桃什么品种好| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日本-黄色视频高清免费观看| 夫妻午夜视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久热这里只有精品99| 欧美xxⅹ黑人| 国产成人免费观看mmmm| 2021少妇久久久久久久久久久| videos熟女内射| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 又大又黄又爽视频免费| 国产综合精华液| 如何舔出高潮| 亚洲久久久国产精品| 国产 一区精品| 一边亲一边摸免费视频| videossex国产| av黄色大香蕉| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 大码成人一级视频| 一本一本综合久久| 国产伦理片在线播放av一区| 在线观看免费日韩欧美大片 | 久久久久久人妻| 国产精品 国内视频| av国产久精品久网站免费入址| 中国美白少妇内射xxxbb| 在线观看三级黄色| av在线老鸭窝| 99热网站在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲av国产av综合av卡| 黄色视频在线播放观看不卡| 男女免费视频国产| 亚洲av免费高清在线观看| 国产免费现黄频在线看| 国产av国产精品国产| 国产成人午夜福利电影在线观看| 多毛熟女@视频| 国产色爽女视频免费观看| 最新中文字幕久久久久| 飞空精品影院首页| 日本色播在线视频| 亚洲av综合色区一区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 高清欧美精品videossex| 女人久久www免费人成看片| 国产精品一区二区在线不卡| 午夜视频国产福利| 精品久久国产蜜桃| 高清在线视频一区二区三区| 男的添女的下面高潮视频| 国产精品三级大全| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩视频在线欧美| 中文欧美无线码| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲少妇的诱惑av| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲国产色片| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 免费大片黄手机在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产免费视频播放在线视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 十分钟在线观看高清视频www| 美女国产高潮福利片在线看| 熟女av电影| 少妇人妻 视频| 女性被躁到高潮视频| 97超碰精品成人国产| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久热久热在线精品观看| 男人操女人黄网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久99一区二区三区| 国产在视频线精品| 日本免费在线观看一区| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 9色porny在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 91久久精品国产一区二区三区| 久久婷婷青草| 欧美另类一区| 日韩在线高清观看一区二区三区| av天堂久久9| 少妇的逼水好多| 夫妻午夜视频| 两个人免费观看高清视频| 一级片'在线观看视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 观看av在线不卡| 蜜桃国产av成人99| 欧美日韩精品成人综合77777| 性色av一级| 国产精品国产三级专区第一集| 日韩 亚洲 欧美在线| av网站免费在线观看视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品一区二区在线观看99| 国产免费视频播放在线视频| 久久国产精品大桥未久av| 大片免费播放器 马上看| 九草在线视频观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| videosex国产| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 最近手机中文字幕大全| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲欧美清纯卡通| 大话2 男鬼变身卡| 人妻少妇偷人精品九色| 男女边摸边吃奶| 最近2019中文字幕mv第一页| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩av不卡免费在线播放| 曰老女人黄片| 伊人亚洲综合成人网| 九色亚洲精品在线播放| 一区二区三区精品91| 欧美xxxx性猛交bbbb| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本黄色片子视频| 街头女战士在线观看网站| 亚洲av综合色区一区| 日本午夜av视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日本wwww免费看| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国精品久久久久久国模美| 少妇高潮的动态图| 一区二区三区乱码不卡18| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品久久久久久精品电影小说| av网站免费在线观看视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 丝瓜视频免费看黄片| 精品一区二区免费观看| av在线老鸭窝| 色哟哟·www| 考比视频在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 五月开心婷婷网| 热re99久久国产66热| 99精国产麻豆久久婷婷| 老司机亚洲免费影院| av网站免费在线观看视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 黄片无遮挡物在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 少妇人妻久久综合中文| 日韩视频在线欧美| 制服人妻中文乱码| 国产一区二区三区综合在线观看 | 欧美成人午夜免费资源| 久久久久视频综合| 人妻 亚洲 视频| 亚洲国产精品一区三区| 少妇高潮的动态图| 99久久精品国产国产毛片| 天天操日日干夜夜撸| 水蜜桃什么品种好| 午夜av观看不卡| 成年av动漫网址| 七月丁香在线播放| 午夜免费观看性视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 国产精品一区二区在线不卡| 九草在线视频观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 两个人的视频大全免费| 国产视频内射| 精品国产一区二区久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美国产精品一级二级三级| 国产探花极品一区二区| 丰满少妇做爰视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 高清视频免费观看一区二区| 日日爽夜夜爽网站| 日本免费在线观看一区| 少妇 在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 伊人久久国产一区二区| 国产精品免费大片| 一个人看视频在线观看www免费| xxxhd国产人妻xxx| 人体艺术视频欧美日本| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲av福利一区| 蜜桃在线观看..| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 人人澡人人妻人| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲精品一区蜜桃| xxx大片免费视频| 免费看不卡的av| av在线播放精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 性色avwww在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 三级国产精品片| 久久久久精品久久久久真实原创| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 成人影院久久| 欧美日本中文国产一区发布| 日韩免费高清中文字幕av| 男的添女的下面高潮视频| 欧美丝袜亚洲另类| 桃花免费在线播放| av视频免费观看在线观看| 色视频在线一区二区三区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 插阴视频在线观看视频| 日韩av不卡免费在线播放| 嘟嘟电影网在线观看| av免费在线看不卡| 免费看不卡的av| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 丝袜脚勾引网站| 中文欧美无线码| 十八禁高潮呻吟视频| 国产精品三级大全| 免费大片黄手机在线观看| 午夜老司机福利剧场| 男的添女的下面高潮视频| 999精品在线视频| 桃花免费在线播放| 国产又色又爽无遮挡免| 久久 成人 亚洲| 亚洲av日韩在线播放| 久久精品久久久久久久性| 精品一区二区免费观看| 少妇的逼水好多| 久久 成人 亚洲| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 九色亚洲精品在线播放| 又大又黄又爽视频免费| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产精品久久久久成人av| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 高清毛片免费看| 在线观看三级黄色| 久久精品国产亚洲av涩爱| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲少妇的诱惑av| 成人影院久久| 人体艺术视频欧美日本| 人妻系列 视频| 亚洲欧洲国产日韩| 成人午夜精彩视频在线观看| 高清不卡的av网站| 欧美精品一区二区大全| 午夜精品国产一区二区电影| 有码 亚洲区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 波野结衣二区三区在线| 午夜激情av网站| 日韩精品有码人妻一区| 精品视频人人做人人爽| 91久久精品国产一区二区成人| 日本黄大片高清| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲国产欧美在线一区| 成年人免费黄色播放视频| 成年人午夜在线观看视频| 美女主播在线视频| 久久狼人影院| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲国产欧美日韩在线播放| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99re6热这里在线精品视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 丝袜在线中文字幕| 亚洲精品色激情综合| 国产探花极品一区二区| av女优亚洲男人天堂| 最新中文字幕久久久久| 少妇的逼水好多| 丰满少妇做爰视频| 中文欧美无线码| 国产成人精品一,二区| 色视频在线一区二区三区| 男女免费视频国产| 三上悠亚av全集在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲经典国产精华液单| 99热全是精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产毛片在线视频| 五月天丁香电影| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 人妻 亚洲 视频| 午夜91福利影院| av在线观看视频网站免费| 国产高清三级在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 免费av中文字幕在线| 欧美最新免费一区二区三区| 久久99热6这里只有精品| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 简卡轻食公司| 国产成人91sexporn| 在线播放无遮挡| 大香蕉97超碰在线| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲人成网站在线观看播放| 最近手机中文字幕大全| 69精品国产乱码久久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 丰满少妇做爰视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品人妻在线不人妻| 日韩欧美精品免费久久| 欧美日韩在线观看h| 日韩视频在线欧美| 亚洲成人手机| 黄片无遮挡物在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 狂野欧美激情性bbbbbb| 色吧在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 免费日韩欧美在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 熟女av电影| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产毛片在线视频| 久久久久精品性色| 美女国产视频在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 熟女人妻精品中文字幕| 成人国产av品久久久| 久久影院123| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲人成网站在线播| 丰满迷人的少妇在线观看| 我的老师免费观看完整版| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 午夜免费鲁丝|