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    菊粉外切酶的異源表達、純化及酶學(xué)性質(zhì)

    2019-03-08 01:54:00馬俊安啟坤唐文竹
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:外切菊粉糖漿

    馬俊,安啟坤,唐文竹

    (大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧 大連,116034)

    菊粉(inulin)是由D-果糖通過β-2,1-糖苷鍵連接而成的鏈狀多聚果糖,且末端以α-1,2-糖苷鍵連接有一個葡萄糖殘基[1]。菊粉作為一種儲備多糖,廣泛存在于植物的根和塊莖中,如菊芋(jerusalemartichoke)、菊苣(chicory)、大麗花(dahlia)和雪蓮果(yacon)等[2]。菊粉外切酶(exo-inulinase,EC 3.2.1.80)能從菊粉的非還原性末端的糖苷鍵開始逐一切下果糖基,因此可以用于水解菊粉生產(chǎn)高果糖漿(high fructose corn syrup, HFCS)[3-4]。高果糖漿具有低分子量、低熱量、高甜度、高滲透壓、高溶解度、沒有晶體形成等優(yōu)勢,在酸奶、冰淇淋、巧克力牛奶等乳制品中被廣泛用作一種重要的甜味劑,同時在制藥企業(yè)也用于制作膠囊配方和注射液等[5]。目前,高果糖漿的制備主要有化學(xué)法、發(fā)酵法和酶法。其中,由于化學(xué)法和發(fā)酵法制備高果糖漿具有產(chǎn)率低,操作復(fù)雜,成本高,副產(chǎn)物多等缺點,酶法制備高果糖漿成為目前食品工業(yè)采用的主要方法[6]。但從野生菌中分離獲得的外切菊粉酶活性較低,且制備工藝復(fù)雜,因此成本居高不下,限制了該酶在高果糖漿生產(chǎn)中的應(yīng)用。利用基因工程手段可以實現(xiàn)菊粉外切酶的高效表達,從而獲得高活性、高純度的菊粉外切酶,為菊粉外切酶水解菊粉生產(chǎn)高果糖漿奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株與質(zhì)粒

    類芽孢桿菌(Paenibacillussp. Lfos16)、 pET28-a(+)載體、克隆宿主大腸桿菌DH10B、表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)均由本實驗室保藏。

    1.1.2 試劑

    DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DpnI、抗生素(卡那霉素)、IPTG、核酸染料(Goldview II)等均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR DNA聚合酶等均購自Takara公司。Ni sepharose 6 Fast Flow親和純化填料購自GE公司。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 10,pH 7.0;LLB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 5,pH 7.0。

    1.2 方法

    1.2.1 菊粉外切酶基因的克隆及重組菌構(gòu)建

    采用Restriction Free Cloning[7-8]的方法,以Paenibacillussp. Lfos16的基因組DNA為模板,通過引物P1:5’-CCGCGCGGCAGCCATATGATGAACGGCGGCAT CG-3’ 和P2: 5’- GATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTACTTCAACCCTCCTTGATGTCT -3’ 對菊粉外切酶基因進行擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后再將其克隆至pET28-a(+)載體。

    將2 μL上述克隆樣品加入到盛有100 μL新鮮制備的E.coliDH10B感受態(tài)細胞的管中,混勻內(nèi)溶物,冰浴5 min。冰浴結(jié)束即刻將混合物轉(zhuǎn)移至冷的電擊杯內(nèi),輕擊液體以確?;旌衔镂挥陔姄舯撞?,擦干電擊杯外壁的冷凝水和霧氣,將電擊杯放進電擊儀,調(diào)節(jié)電擊轉(zhuǎn)化儀參數(shù)至2.5 kV、25 μF和200 Ω電擊轉(zhuǎn)化。電擊結(jié)束后迅速加入900 μL LB培養(yǎng)基,混勻,轉(zhuǎn)移所有液體混合物到無菌的2 mL離心管,37 ℃、200 r/min溫育1 h。將200 μL已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上,37 ℃培養(yǎng)至長出適宜大小的單菌落。

    挑取單菌落提取質(zhì)粒,重組質(zhì)粒通過XbaI、EcoRV雙酶切驗證及DNA測序,將驗證正確的質(zhì)粒命名為pET28a-Exo-inu,并通過熱擊轉(zhuǎn)入E.coilBL21(DE3),于卡那霉素抗性篩選平板上生長的轉(zhuǎn)化子即為重組表達菌E.coilBL21(DE3)/ pET28a-Exo-inu。

    1.2.2 重組菌的誘導(dǎo)表達及純化

    接種菊粉外切酶重組表達菌至100 mL LLB(含30 μg/mL kanamycin)液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4~0.6,加入IPTG至終濃度1 mmol/L,于16 ℃、180 r/min誘導(dǎo)18 h;離心收集菌體沉淀,并用ddH2O洗滌菌體2次,離心后用15 mL native binding buffer(pH 7.5)重懸菌體,并進行超聲破碎。10 000 r/min,4 ℃離心10 min,收集上清液,即為粗酶液。

    用native elution buffer(pH 6.5)平衡系統(tǒng)B相,native binding buffer(pH 6.5)平衡A相和Ni2+親和層析柱。加入3 mL粗酶液在室溫下與填料于充分結(jié)合1 h。用native binding buffer(pH 6.5)洗層析柱,收集洗脫峰處樣品,即為穿出液;調(diào)節(jié)B相比例15%,使咪唑終濃度為75 mmol/L,洗滌層析柱,收集洗脫峰處樣品,即為洗雜液。調(diào)節(jié)B相比例100%,使咪唑終濃度為500 mmol /L進行洗脫,收集洗脫峰處樣品,即為洗脫液;

    分別取原酶液、穿出液、洗雜液、洗脫液進行SDS-PAGE檢測,確定純化效果。

    1.2.3 重組菊粉外切酶轉(zhuǎn)化菊粉產(chǎn)物分析

    450 μL 2%的菊粉溶液與50 μL純酶混合,于40 ℃下反應(yīng)10 min,沸水浴5 min終止反應(yīng)。10 000 r/min離心10 min,取上清液,采用TLC法[9]對產(chǎn)物組成進行確定。

    1.2.4 酶活測定方法及定義

    450 μL 2%的菊粉溶液或蔗糖溶液與50 μL純酶混合,以滅活的酶液與底物同比例混合做為對照,于40 ℃水浴反應(yīng)10 min,沸水浴5 min終止反應(yīng),用DNS法測還原糖生成量。將以菊粉和蔗糖為底物時測定的酶活分別記為I和S。

    酶活定義:上述反應(yīng)條件下,每分鐘生成1 μmol還原糖所需要的酶量為1個酶活單位。

    1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)測定

    以下測定中底物均為2%的菊粉溶液。

    ①最適反應(yīng)溫度:于不同溫度下測定酶活,根據(jù)相對酶活的大小確定最適反應(yīng)溫度;②溫度穩(wěn)定性:將純化后的酶液分別置于不同溫度下溫育2 h后,測定剩余酶活,根據(jù)相對酶活的大小確定溫度穩(wěn)定性;③最適反應(yīng)pH:將純化得到的酶液在不同pH緩沖液中測定酶活,根據(jù)相對酶活的大小確定最適反應(yīng)pH;④pH穩(wěn)定性:將純化后的酶液在不同pH緩沖液中,4 ℃靜置2 h后,測定剩余酶活,根據(jù)相對酶活的大小確定pH穩(wěn)定性;⑤金屬離子對酶活的影響:向酶促反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子使其終濃度為 5 mmol /L,以未處理酶酶活力為對照,計算加入金屬離子后的相對酶活;⑥動力學(xué)常數(shù)測定:不同濃度的菊粉溶液與純化后的酶液等體積混合,于最適條件下反應(yīng)10 min,測定還原糖的生成量。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法[10-11]計算出以菊粉為底物時重組外切菊粉酶的動力學(xué)常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菊粉外切酶基因的擴增

    以Lfos16的基因組為模板對菊粉外切酶編碼基因進行擴增,預(yù)期片段大小為2 305 bp。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢驗,其結(jié)果如圖1所示,產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致,且條帶單一。

    1-exo-inulinase gene;M-DNA Marker圖1 菊粉外切酶基因擴增結(jié)果Fig.1 Amplification products ofexo-inulinase gene

    2.2 pET28a-Exo-inu表達載體和工程菌的構(gòu)建

    挑取陽性克隆提取質(zhì)粒,經(jīng)XbaI、EcoRV雙酶切鑒定,預(yù)期得到大小分別為1 234 bp,1 957 bp和4 347 bp的3條片段。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切產(chǎn)物進行檢驗,結(jié)果如圖2所示, 1為重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果,大小與預(yù)期結(jié)果一致,將鑒定正確的質(zhì)粒進行測序,最終確定重組表達質(zhì)粒pET28a-Exo-inu成功構(gòu)建。將構(gòu)建成功的重組表達質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化至E.coilBL21(DE3),于卡那霉素抗性篩選平板上生長的轉(zhuǎn)化子即為重組表達菌E.coilBL21(DE3)/ pET28a-Exo-inu。

    1-重組質(zhì)粒;M-DNA Marker圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Detection of the recombinant plasmid pET28a-Exo-inu

    2.3 重組菊粉外切酶的誘導(dǎo)表達和分離純化

    按照1.2.2所述方法對重組表達菌E.coilBL21(DE3)/ pET28a-Exo-inu進行誘導(dǎo)表達,超聲破碎獲得粗酶液后,對重組菊粉外切酶進行純化,并收集各組分進行SDS-PAGE檢測,其結(jié)果如圖3所示。

    M-Marker;1-粗酶液;2-穿刺液;3-洗雜液;4-洗脫液圖3 重組菊粉外切酶的親和純化SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinantexo-inulinase after affinity purification

    帶有組氨酸標(biāo)簽的重組菊粉外切酶與Ni2+特異性結(jié)合,而不能與Ni2+結(jié)合的蛋白及結(jié)合能力弱的雜蛋白洗脫流出,最終獲得的單一條帶為電泳純的重組酶。SDS-PAGE檢測表明重組菊粉外切酶表觀分子量約為87 kDa,與理論大小一致。

    以菊糖為底物,重組菊粉外切酶的純化結(jié)果如表1所示。經(jīng)過Ni2+親和純化,純化倍數(shù)達到3.98倍,回收率為2.80%,比酶活為348.30 U/mg,相比文獻已報道的菊粉外切酶的比酶活高。RAM等[12]從PenicilliumoxalicumBGPUP-4分離純化得到兩種菊粉外切酶,以菊粉為底物的比酶活分別為113.19 U/mg和120.47 U/mg。

    表1 重組菊粉外切酶分離純化結(jié)果Table 2 Summary of recombinantexo-inulinase purification

    2.4 重組菊粉外切酶轉(zhuǎn)化菊粉產(chǎn)物分析

    重組菊粉外切酶與2%菊粉反應(yīng)產(chǎn)物TLC結(jié)果如圖4所示。

    1-菊粉;2-菊粉外切酶水解菊粉產(chǎn)物;3-葡萄糖;4-果糖圖4 重組菊粉外切酶菊粉水解產(chǎn)物的TLC分析Fig.4 TLC analysis of products from inulin by recombinant exo-inulinase

    可以看出反應(yīng)10 min后底物被完全降解,產(chǎn)生產(chǎn)物果糖(F)及少量葡萄糖(G),底物轉(zhuǎn)化率為100%。

    2.5 重組菊粉外切酶酶活測定

    以2%菊粉和2%蔗糖分別為底物測定酶活力,結(jié)果顯示,以菊粉為底物的酶活(I)為259.37 U/mL,以蔗糖為底物的酶活(S)為592.16 U/mL。粗酶液的I/S為0.438,I/S<1,表明該酶為菊粉外切酶[13-14]。

    2.6 重組菊粉外切酶酶學(xué)性質(zhì)測定

    2.6.1 重組菊粉外切酶的最適溫度與溫度穩(wěn)定性

    溫度對重組菊粉外切酶酶活的影響如圖5所示。

    圖5 溫度對重組外切菊粉酶酶活的影響Fig.5 Effects of temperature on activity of recombinant exo-inulinase

    重組菊粉外切酶的最適作用溫度為40 ℃;當(dāng)溫度低于40 ℃時,酶活隨溫度的升高而升高;當(dāng)溫度高于40 ℃時,酶活隨溫度的升高而降低,當(dāng)溫度在25~35 ℃時,具有80%以上的相對酶活。

    溫度對重組菊粉外切酶穩(wěn)定性的影響如圖6所示。重組菊粉外切酶在溫度低于30 ℃時具有較高的穩(wěn)定性,在低于30 ℃保溫2 h剩余酶活仍高于90%;當(dāng)溫度高于30 ℃時,剩余酶活很快降低,當(dāng)溫度達到35 ℃時,剩余酶活降至15%以下。

    圖6 溫度對重組外切菊粉酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of temperature on stability of recombinant exo-inulinase

    本研究中重組菊粉外切酶與文獻報道的來源于Paenibacillussp. d9 菌株的菊粉外切酶性質(zhì)比較接近,最適作用溫度均為40 ℃[15]。而與其他菊粉外切酶相比差別較大,來源于Aspergillusniger12的菊粉外切酶最適溫度是55 ℃,且在35~55 ℃靜置24 h后仍剩余80%以上的酶活[16]。來源于Aspergillusniger的菊粉外切酶最適溫度為60 ℃,在低于60 ℃保溫1 h依然有85%酶活性[17]。因此本研究中的重組菊粉外切酶屬于低溫酶,不但在低溫條件下可以高效反應(yīng),而且在生產(chǎn)工藝中可以通過較低溫度的熱處理使酶失活,節(jié)約能源和費用,這就使得低溫菊粉外切酶在菊粉來源高果糖漿的生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

    2.6.2 重組菊粉外切酶的最適pH與pH穩(wěn)定性

    pH對重組菊粉外切酶酶活的影響如圖7所示。重組菊粉外切酶的最適作用pH為6;當(dāng)pH低于6時,酶活隨pH的升高而升高;當(dāng)pH高于6時,酶活隨pH的升高而升降低,且當(dāng)pH達到7時,相對酶活降至40%以下。

    圖7 pH對重組菊粉外切酶酶活的影響Fig.7 Effects of pH on activity of recombinant exo-inulinase

    不同pH下重組菊粉外切酶的穩(wěn)定性如圖8所示。當(dāng)pH處于6.6~7.6時,重組菊粉外切酶具有較高的穩(wěn)定性,剩余酶活高于90%;當(dāng)pH低于6或高于8時,剩余酶活力降至40%以下。

    重組菊粉外切酶的最適作用pH與pH穩(wěn)定性與文獻報道基本一致。如李益民等[18]將來自于KluyveromycesmarxianusYX01的菊粉外切酶于PichiapastorisGS115中進行表達,重組菊粉外切酶的最適pH為4.62。KOBAYASHI等[19]將來源于Microbulbifersp. Strain JAM-3301的菊粉外切酶基因通過大腸桿菌進行表達,其最適pH為6.0,在pH 8~9相對穩(wěn)定。CHEN等[20]將AspergillusficuumJNSP5-06中的菊粉外切酶在大腸桿菌中進行過表達,其最適pH為4.0,并在pH為3.0~4.5時菊粉外切酶穩(wěn)定性較好。MA等[21]將Kluyveromycescicerisporus中的菊粉外切酶基因在PichiapastorisX-33中進行表達,其最適pH為4.5,在4 ℃,pH 3.0~6.0環(huán)境中溫育24 h時,能剩余90%酶活。

    2.7 金屬離子對菊粉外切酶活性的影響

    金屬離子對重組菊粉外切酶的影響如表2所示。其中,Li+對重組菊粉外切酶有一定的激活作用;其余金屬離子均有不同程度的抑制作用,其中Ag+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Hg2+、Fe3+對重組菊粉外切酶具有顯著抑制作用,剩余酶活降至10%以下。

    各種金屬離子對不同來源的菊粉外切酶的影響差異較大。其中Cu2+能夠完全抑制來源于AspergillusficuumJNSP5-06的菊粉外切酶酶活[20],而對來源于Aspergillusniger12的菊粉外切酶酶活具有激活作用[21];Fe2+、Zn2+及Mg2+對來源于PaenibacilluspolymyxaZJ-9的外切型菊粉酶的酶活具有輕微激活作用[22]。

    2.8 重外菊粉外切酶動力學(xué)常數(shù)測定

    采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖,以1/[S]為橫坐標(biāo),1/V為縱坐標(biāo),測得Km和Vmax的值,結(jié)果如圖9所示。得到的回歸方程為y=108.14x+5.608 1,R2=0.998 8。通過分析計算出以菊粉為底物時Km為19.28 mg/mL,Vmax為0.18 mg/(min·mL)。

    圖9 重組菊粉外切酶的Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.9 Lineweave-Burk double reciprocal curve of recombinant exo-inulinase

    來源不同的菊粉外切酶動力學(xué)常數(shù)差別較大,可能是由于酶活測定方法、底物組成以及計算方法等的差異引起的。其中CHEN等[20]在大腸桿菌中表達AspergillusficuumJNSP5-06中克隆出菊粉外切酶,以菊粉為底物的Km和Vmax分別為(7.1±0.2) mmol/L和(1 000.0±0.1) μmol/(min·mg)。MA等[21]將Kluyveromycescicerisporus中的菊粉外切酶基因在PichiapastorisX-33中進行表達,Km為0.322 mmol/L,Vmax為4 317 μmol/(min·mg)。李益民等[18]將來自于KluyveromycesmarxianusYX01的外切菊粉酶于PichiapastorisGS115中進行表達,以菊粉為底物時,Km和Vmax分別為80.53 g/L和4.49 g/(L·min)。

    3 結(jié)論

    通過RF克隆成功將來源于類芽孢桿菌Paenibacillussp. Lfos16的菊粉外切酶基因重組到pET-28a(+)表達載體上,并在E.coliBL21(DE3)實現(xiàn)了高效表達。通過鎳柱親和層析獲得了電泳純的重組菊粉外切酶。重組菊粉外切酶的表觀分子質(zhì)量為87 kDa,水解菊糖的產(chǎn)物為果糖,且I/S為0.438,確定為外切酶活性。以菊粉為底物,重組菊粉外切酶的比酶活為348.30 U/mg,最適作用溫度和pH分別為40 ℃和pH 6,且當(dāng)溫度低于30 ℃,pH在6.6~7.6時時酶活較穩(wěn)定;Ag+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Hg2+、Fe3+具有顯著抑制作用;重組菊粉外切酶對菊粉的Km為19.28 mg/mL,Vmax為0.18 mg/(min·mL)。

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