肉桂醛水乳劑制備及其柑橘青霉抑菌效果測定

林麗萍，陳妍妍，田博文，廖安平，陳金印

1(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)與質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江西 南昌，330045) 2(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，江西 南昌，330045) 3(萍鄉(xiāng)學(xué)院，江西 萍鄉(xiāng)，337055)

柑橘是世界第一大類水果，全世界范圍內(nèi)柑橘產(chǎn)業(yè)栽培品種結(jié)構(gòu)逐漸趨于合理化，鮮果漸成消費主流，調(diào)查數(shù)據(jù)顯示寬皮柑橘94.3%用于鮮食[1]。應(yīng)對鮮銷首要的策略就是降低損耗，延長貯藏時間，以提高利潤。柑橘采摘后特別容易受到霉菌的侵染，導(dǎo)致柑橘的腐爛，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至影響到相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展[2]?；瘜W(xué)防治的危害[3-4]眾所周知，物理防治措施往往需要一定的設(shè)備投入，生物防治效果又受環(huán)境限制[5-6]。有研究結(jié)果表明，植物源抑菌活性物質(zhì)不僅能有效抑菌、增強(qiáng)活體防護(hù)效果，并且能夠誘導(dǎo)果實的抗病性[7]。

肉桂醛(cinnamaldehyde)是一種從肉桂等植物當(dāng)中提取的具有抑菌功能的醛類有機(jī)化合物。對草莓、番茄、油桃、香菇等多種果蔬均具有顯著的防腐保鮮效果[8]。王德德等[9]證實納米化后的肉桂醛對辣椒疫霉病原菌的抑菌能力提高了50%～100%。JO等[10]以吐溫20作為乳化劑制備出粒徑<200 nm肉桂醛微乳，對甜瓜汁有一定的保鮮作用。課題組前期工作證實肉桂醛能有效增強(qiáng)贛南臍橙和新余蜜桔對青霉病害的防護(hù)效果以及誘導(dǎo)果實對柑橘青霉的抗病性[11-12]。說明肉桂醛具有良好的開發(fā)植物源柑橘保鮮劑的潛力。

鑒于肉桂醛難溶于水、熔點低、沸點高、易氧化、易揮發(fā)的特性[13]，綜合評估肉桂的特性及目前對果蔬保鮮劑水基化、緩釋化、省力化的需求方向[14-15]，擬將植物源有效抑菌成分肉桂醛制備成水乳劑，綜合評估其穩(wěn)定性和抑菌活性，優(yōu)選出后續(xù)肉桂醛柑橘保鮮劑的基礎(chǔ)配方。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 指示菌

柑橘青霉病原菌：指狀青霉(Penicilliumdigitatum)，購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，保存于江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，用做抑菌試驗指示菌。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，瓊脂20 g，pH自然，121 ℃滅菌20 min。作指示菌的活化、培養(yǎng)及抑菌試驗用。

肉桂醛(≥95%GC)；乳化劑：司盤20(S20)、司盤80(S80)、吐溫60(T60)、吐溫80(T80)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 主要儀器

LDZX-40B自動立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SHP-160型生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫循環(huán)水浴鍋，國華電器有限公司；Vortex-Genie2漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；BK5000數(shù)碼生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 水乳劑的制備

一種失水山梨糖醇酐酯(S20、S80)分別與一種聚氧乙烯失水山梨醇酐酯(T60、T80)配制成HLB值在9.0～14.5的復(fù)合乳化劑。采用乳化劑在水中法制備肉桂醛水乳劑，固定體系總量及油相(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的肉桂醛)用量，改變復(fù)合乳化劑的用量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8%、6%和4%)，以旋渦混合器8檔4 min 輸入能量。試驗重復(fù)3次。

乳化劑的HLB值參考文獻(xiàn)[16]，S80、S20、T60、T80的HLB值分別為4.3、8.6、14.6、15.0，復(fù)合乳化劑HLB值計算公式為：

(1)

式中：w1和w2分別為2種乳化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；HLB為相應(yīng)乳化劑的親水親油平衡值；HLB1和HLB2分別為2種乳化劑的親水親油平衡值。

1.2.2 肉桂醛水乳劑穩(wěn)定性的測定

離心穩(wěn)定性，參考邵明輝[17]法，稍作改動。制備水乳劑分裝于10 mL離心管中，經(jīng)10 000 r/min，4 ℃離心10 min，若水乳劑仍保持均勻乳白色則離心穩(wěn)定性合格；有析油、沉淀或分層情況則不合格。

低溫穩(wěn)定性試驗[18-19]，制備水乳劑分裝于10 mL 離心管中，(4±1) ℃冰箱中保存7 d，若低溫出現(xiàn)析油、沉淀或分層情況，置于室溫，這些現(xiàn)象逐漸消失，或者經(jīng)過適當(dāng)振搖可以恢復(fù)原來乳狀液的情況，則低溫穩(wěn)定性合格，否則為不合格。

高溫穩(wěn)定性試驗[18-20]，制備水乳劑分裝于10 mL 離心管中，(54±1) ℃恒溫箱中，貯存14 d，外觀保持均勻，若出現(xiàn)分層，室溫振搖后可以恢復(fù)原狀即為高溫穩(wěn)定性合格；否則為不合格。

稀釋穩(wěn)定性試驗[18]，將1 mL肉桂醛水乳劑，用標(biāo)準(zhǔn)硬水稀釋20倍，攪拌均勻，靜置1 h，觀察現(xiàn)象，并記錄。無沉淀和浮油為合格。

1.2.3 肉桂醛水乳劑貯藏性測評

制備好的水乳劑于37 ℃恒溫箱中保存14 d，觀察析油情況、黃層高度及色澤，記錄實驗現(xiàn)象。參考華乃震關(guān)于水乳劑應(yīng)符合的基本性質(zhì)[22]描述，擬定評判肉桂醛水乳劑經(jīng)時穩(wěn)定性的表觀評定指標(biāo)，應(yīng)用加權(quán)評分法對不同水乳劑評分，滿分為100分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 肉桂醛水乳劑的表觀評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Rating criteria of emulsion in water of cinnamaldehyde

1.2.4 肉桂醛水乳劑分散性測定

于100 mL量筒中裝入99.5 mL標(biāo)準(zhǔn)硬水，用注射器吸0.5 mL待測水乳劑樣品，從距量筒水面5 cm處滴入水中，觀察其分散狀況，按其分散性能的好壞分為優(yōu)、良、劣三級。

優(yōu)級：在水中呈云霧狀自動分散，無可見顆粒下沉。

良級：在水中能自動分散，有顆粒下沉，下沉顆?？陕稚⒒蚪?jīng)輕微搖動后分散。

劣級：在水中不能自動分散，有顆粒呈絮狀下沉，經(jīng)強(qiáng)烈搖動后才能分散。

1.2.5 肉桂醛水乳劑形態(tài)

將制備好的水乳劑用水溶性染料美藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，并測定油滴的粒徑大小。

1.2.6 肉桂醛水乳劑抑菌效果測定

取0.2 mL指示菌孢子懸液，均勻涂布于PDA培養(yǎng)基表面，杯碟法檢測不同肉桂醛水乳劑的抑菌效果。(28±1) ℃，培養(yǎng)48 h，十字交叉法測量抑菌圈，取平均值做抑菌圈直徑。試驗重復(fù)3次。

1.2.7 肉桂醛水乳劑最小抑菌濃度

以復(fù)合乳化劑為稀釋劑，二倍稀釋法[23]將水乳劑稀釋為肉桂醛濃度分別為1 000、500、250、125、62.5 μg/g。采用杯碟法檢測不同濃度肉桂醛水乳劑的抑菌效果。以肉桂醛濃度從低到高首次出現(xiàn)抑菌圈的濃度為最小抑菌濃度。試驗重復(fù)3次。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

所有水乳劑制備試驗和抑菌試驗均重復(fù)3次，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式給出。采用Excel 2010對肉桂醛水乳劑貯藏性評分值做圖，IBM SPSS 20對不同肉桂醛水乳劑表觀評分值及抑菌圈大小進(jìn)行方差分析及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂醛水乳劑穩(wěn)定性試驗結(jié)果

肉桂醛水乳劑穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表2和表3。

表2 司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 2 The stability test results of emulsion in water from Span20-Tween60/Tween80- cinnamaldehyde

表3 司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 3 The stability test results of emulsion in water from Span80-Tween60/Tween80-cinnamaldehyde

復(fù)合乳化劑HLB值在9.0～14.5，司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑與司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑的低溫和稀釋穩(wěn)定性均合格，能夠保持均勻一致的乳白色乳狀液。離心穩(wěn)定性以司盤80-吐溫80-肉桂醛水乳劑合格率最高為100%，其他3個組(司盤20-吐溫60-肉桂醛、司盤20-吐溫80-肉桂醛和司盤80-吐溫60-肉桂醛)中復(fù)合乳化劑用量為8%時，經(jīng)10 000 r/min，4 ℃離心10 min，會出現(xiàn)浮油或者白色沉淀，不能保持白色均勻水乳劑狀態(tài)。

制備好的水乳劑經(jīng)(54±1) ℃恒溫箱中，貯存14 d后，大部分出現(xiàn)析油和白色沉淀情況；僅復(fù)合乳化劑用量為4%的司盤20-吐溫60(HLB值為11.2和12.3)和司盤80-吐溫60(HLB值為別為9.0、10.1、11.2和12.3)6個處理的肉桂醛水乳劑高溫穩(wěn)定性測定指標(biāo)為合格；其他組中復(fù)合乳化劑用量為4%的處理，也只有少量析油。

2.2 肉桂醛水乳劑貯藏性測評結(jié)果

按照表1評分標(biāo)準(zhǔn)對37 ℃恒溫箱中保存14 d的司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑表觀特征進(jìn)行評分，結(jié)果見圖1。

圖1 司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑評分值Fig.1 The rating value of emulsion in water from Span20-Tween60/Tween80-cinnamaldehyde

除乳化劑用量為8%的司盤20-吐溫60-肉桂醛組在HLB 10.1時出現(xiàn)了最大評分值(83.0分)外，其他處理組隨HLB值增加，表觀評分值均呈逐漸上升趨勢；至HLB值分別為13.4和14.5時，12個處理的評分值均≥80.0分，均可保持較穩(wěn)定的均勻乳白色水乳劑，或有少量黃色細(xì)小油滴，其中最高評分為乳化劑用量6%，HLB值為14.5的司盤20-吐溫80-肉桂醛水乳劑，評分值為87.0分。另外，HLB值為12.3，乳化劑用量為6%的司盤20-吐溫60-肉桂醛處理也能形成較穩(wěn)定的乳白色水乳劑。

同樣，按照表1評分標(biāo)準(zhǔn)對37 ℃恒溫箱中保存14 d的司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛制備水乳劑表觀特征進(jìn)行評分，結(jié)果見圖2。

圖2 司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳評分值Fig.2 The rating value of emulsion in water from Span80-Tween60/Tween80- cinnamaldehyde

乳化劑用量為4%的2個組在HLB值9.0～14.5均不能保持均勻水乳劑狀態(tài)。乳化劑用量為6%和8%的司盤80-吐溫60-肉桂醛組中，均在HLB值為10.1、11.2和12.3時，保持均勻乳白色水乳劑，最高表觀評分值均出現(xiàn)在HLB值11.2，分別為93.0分和91.7分。乳化劑用量為6%和8%的司盤80-吐溫80-肉桂醛組中，HLB值9.0時，均不能保持均勻水乳劑狀態(tài)；乳化劑用量8%，HLB值14.5時，司盤80-吐溫80-肉桂醛也不能保持均勻水乳劑狀態(tài)；其余9個處理均為均勻乳白色水乳劑，有4個處理的評分在90.0分以上。乳化劑用量為6%和8%的司盤80-吐溫80-肉桂醛組中，最高分均出現(xiàn)在HLB值12.3，都是93.0分。

表觀評分值90分以上的水乳劑具備非常好的分散性。水乳劑滴入水中后呈云霧狀分散，形成乳狀液，分散過程中無可見顆粒，分散均勻且較為迅速，評價等級為優(yōu)，見圖3。用水溶性美藍(lán)染料對水乳劑進(jìn)行染色[17]，光學(xué)顯微鏡下可見藍(lán)色的背景和無色的油滴，油滴粒徑多數(shù)分布在2 μm左右，符合穩(wěn)定水乳劑的基本特征[22]。

圖3 肉桂醛水乳劑分散試驗現(xiàn)象Fig.3 The appearance of dispersion test of Cinnamaldehyde water emulsion

司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛制備水乳劑組和司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛制備水乳劑組中共29個處理能形成均勻乳白色水乳劑，對其表觀評分進(jìn)行統(tǒng)計分析(表4)，表觀評分間存在極顯著差異(P<0.01)。按形成水乳劑的較高評分值，從司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑組和司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛水乳劑組各優(yōu)選出4個處理，共計8個處理的水乳劑用來開展后續(xù)柑橘青霉病原菌的抑菌試驗。8個處理形成的水乳劑評分多重比較結(jié)果見表5。復(fù)合乳化劑為司盤80-吐溫60/吐溫80的4個處理形成的水乳劑表觀評分值均高于乳化劑為司盤20-吐溫60/吐溫80的4個處理，且具有極顯著差異。

表4 29個處理的評分值的方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis of rating value for 29 treatments

表5 八個處理的評分值的多重比較結(jié)果Table 5 Multiple comparisons of rating value for 8 treatments

注：采用Duncan法進(jìn)行多重比較。同列標(biāo)有不同大寫字母者表示組間差異極顯著(P<0.01)，標(biāo)有不同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。表6同。

2.3 肉桂醛水乳劑的抑菌試驗結(jié)果

通過貯藏性評分篩選出8個穩(wěn)定性較佳的水乳劑處理，如表6所示。

表6 八個處理的抑菌圈多重比較結(jié)果Table 6 Multiple comparisons of inhibition zone of 8 treatments

對水乳劑做10倍梯度稀釋，杯碟法抑制柑橘青霉病原菌試驗表明，水乳劑稀釋至肉桂醛有效含量為1 mg/g時，能夠形成規(guī)則、穩(wěn)定的抑菌圈。對抑菌圈大小進(jìn)行方差分析，無顯著差異，顯著高于相同濃度肉桂醛對照組。肉桂醛水乳劑最小抑菌濃度均為250 μg/g，肉桂醛對照組的最小抑菌濃度為500 μg/g。

3 討論

3.1 水乳劑穩(wěn)定性

除司盤80-吐溫80-肉桂醛組外，其他組中復(fù)合乳化劑用量為8%時，離心穩(wěn)定性不合格，不能保持白色均勻水乳劑狀態(tài)?？赡芘c復(fù)合乳化劑成分、油相的密度均大于水相密度有關(guān)，在低能量輸入，較多的復(fù)合乳化劑用量情況下導(dǎo)致體系離心后，出現(xiàn)析油或沉淀現(xiàn)象；而吐溫80有更好的乳化性能，同時復(fù)合乳化劑中司盤80的HLB值(4.3)與吐溫80的HLB值(15.0)差值較較大，結(jié)構(gòu)相似[24-25]，因此，司盤80-吐溫80-肉桂醛組形成水乳劑離心穩(wěn)定性好。

高溫穩(wěn)定性試驗，僅有6個處理(全部試驗涉及72個處理)的司盤20/司盤80-吐溫60-肉桂醛水乳劑高溫穩(wěn)定試驗結(jié)果為合格，合格的處理中，復(fù)合乳化劑用量均為4%。其他組中復(fù)合乳化劑用量為4%的處理，也只有少量析油。說明高溫(54 ℃)可進(jìn)一步促進(jìn)水乳劑的形成。關(guān)于高溫對該組水乳劑的形成，有待于進(jìn)一步研究。

3.2 較優(yōu)肉桂醛水乳劑柑橘青霉抑菌活性

比較發(fā)現(xiàn)，司盤80-吐溫60/吐溫80-肉桂醛組中優(yōu)選出的4個水乳劑貯藏性評分值顯著高于司盤20-吐溫60/吐溫80-肉桂醛組中優(yōu)選出的4個水乳劑經(jīng)時評分值；而這8個處理形成水乳劑的柑橘青霉抑菌圈直徑無顯著差異，但都顯著高于相同用量的肉桂醛。8個水乳劑的最小抑菌濃度均為250 μg/g，肉桂醛的最小抑菌濃度為500 μg/g，說明水乳劑配方中的復(fù)合乳化劑有協(xié)同增強(qiáng)肉桂醛對柑橘青霉的抑菌效果。

4 結(jié)論

目前，柑橘采后商品化處理主要采用化學(xué)藥劑做防腐保鮮，常用保鮮劑、殺菌劑有抑霉唑、咪鮮胺、雙胍鹽、噻菌靈等，面臨病原微生物對化學(xué)藥劑產(chǎn)生耐藥性和化學(xué)防腐保鮮效果下降的問題；且果品藥劑殘留，對人體健康造成很大影響。柑橘產(chǎn)業(yè)迫切需求綠色環(huán)保柑橘保鮮劑的開發(fā)。水乳劑是將不溶于水的有效成分以水為介質(zhì)，通過輸入足夠的能量(如高剪切乳化和高壓均化等手段)并借助適當(dāng)表面活性劑的作用，以微小液滴分散在水中，得到動力學(xué)上穩(wěn)定，外觀呈乳白色的水包油型乳狀液劑型[26]。水乳劑以其水基化，表面活性劑用量小，少用或不用有機(jī)溶劑，而成為保鮮劑重點開發(fā)劑型。

試驗以植物源活性抑菌物質(zhì)肉桂醛為原料，低能量輸入法，綜合評估水乳劑穩(wěn)定性、分散性、貯藏性及其對柑橘青霉的抑菌效果，獲得了2個肉桂醛水乳保鮮劑的初級配方，即油相(肉桂醛)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，復(fù)合乳化劑分別為6%的司盤80-吐溫60(HLB值為11.2)和6%的司盤80-吐溫80(HLB值為12.3)。在此基礎(chǔ)上可開展后續(xù)肉桂醛保鮮劑配方優(yōu)化工作。