乳酸鏈球菌素協(xié)同納他霉素在豆腐保鮮中的應用

李作美，黃恩澤

（蚌埠學院 食品與生物工程學院，安徽 蚌埠233000）

豆腐中含有人體所必需的多種微量元素（如鐵、鈣、磷和鎂等），還含有糖類、脂肪和優(yōu)質蛋白，素有“植物肉”之稱[1]。豆腐是老少皆宜的食療佳品[2]。在豆腐的工業(yè)化生產發(fā)展中，保鮮期時間短是其發(fā)展的一個重要限制因素。雖然我國豆腐行業(yè)近年來發(fā)展較快，但是相比較一些發(fā)達國家，還是存在著一定的差距，技術設備和工藝條件落后，技術力量嚴重不足，尤其是產品保鮮期過短[4]。

乳酸鏈球菌素（nisin）和納他霉素是一種天然的生物防腐劑，相比較化學防腐劑而言，生物防腐劑對人體的基本無毒害作用，且具有抗菌防腐能力強，作用范圍廣泛等優(yōu)點。nisin提取自乳酸鏈球菌株，是一種多肽類化合物，對許多革蘭氏陽性菌有很強的抑制作用[5]。但其抗菌譜比較窄，只能殺死或抑制革蘭氏陽性菌[6]。納他霉素是一種天然抗真菌化合物，是由一種鏈霉菌發(fā)酵產生的，不僅對各種霉菌和酵母菌的生長有著有效的抑制作用，而且還可以抑制真菌毒素的產生。但因為其溶解度低的特點，通常只被用于食品的表面進行防腐[7-8]。本課題主要是研究nisin協(xié)同納他霉素在豆腐保鮮中的應用，考慮到nisin抗菌譜較窄，納他霉素溶解度低，通過同時添加兩種防腐劑組合成復合防腐劑以便達到協(xié)同互補的目的。該研究通過單因素試驗探究nisin和納他霉素對豆腐保鮮時間延長的最合適的添加量以及在此過程中的一些其他影響因素，然后通過正交試驗確定nisin和那他霉素在豆腐中的最適添加量及其他影響因素，從而達到延長豆腐保鮮期的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆：市售；石膏（食品級）：荊門市磊鑫石膏制品有限公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：上海展云化工有限公司；nisin：浙江銀象生物工程有限公司；納他霉素：浙江多味化工食品有限公司；0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）：四川科倫藥業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；YXQLS-50A壓力蒸汽滅菌器、GNP-908恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋：常州朗越儀器制造有限公司；DZ400/2C真空包裝機：上海青葩包裝機械有限公司；FA1604電子天平：上海精密科學儀器有限公司；JYK-328豆?jié){機：九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豆腐加工工藝流程[10]

原料大豆稱取→浸泡沖洗→磨漿→過濾→煮漿→點漿→分裝（添加Nisin）→壓榨成型→噴灑納他霉素混懸液→真空包裝→水浴殺菌→冷卻→豆腐成品

1.3.2 操作要點

（1）原料的預處理：挑選顆粒飽滿的大豆，然后去皮清洗放入盆中浸泡3～4 h，使其充分吸收水分。

（2）豆腐的制作：將浸泡好的大豆放入豆?jié){機中，加入一定比例的水，用豆?jié){機將大豆打成豆?jié){，再用紗布將打好的豆?jié){過濾，分離漿渣，將分離后的豆?jié){放入鍋中進行煮漿，控制煮漿溫度在90～95 ℃，煮漿時間在40 min左右，煮好后加入石膏粉進行點漿，然后壓榨成型。

（3）防腐劑的添加：每一組試驗稱取100 g還未成型的豆?jié){按一定比例添加Nisin，充分攪拌均勻，待豆腐成型后，在其表面均勻噴灑與Nisin相同比例的納他霉素混懸液，然后分別裝入透明的蒸煮袋中。

（4）真空包裝：打開真空包裝機進行預熱，預熱后調整工作電壓至36 V，設置真空時間為30 s，熱封時間為20 s，然后將已經分裝好的透明蒸煮袋平整的放置在真空包裝機抽氣封口處，避免因袋口不平整產生皺褶而導致漏氣，放置好后蓋上真空包裝機的密封頂蓋進行真空包裝。

（5）水浴殺菌：將真空包裝好的試樣放入恒溫水浴鍋中，用一定的溫度保溫適當的時間，然后取出用流水冷卻降溫至常溫，得到豆腐成品。

1.3.3 不同因素對豆腐保鮮影響的單因素試驗

（1）Nisin和納他霉素添加量的確定：在確定了其他工藝條件都相同的情況下，稱取6份0.1 kg的豆腐，選擇Nisin與納他霉素分別按照5個濃度梯度0.04 g/kg、0.08 g/kg、0.12 g/kg、0.16 g/kg、0.20 g/kg添加到豆腐中，在85 ℃的恒溫水浴鍋中水浴25 min后，冷卻并放入設定溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每隔1 d對試樣進行一次感官評定，并在第7天時測定其菌落總數，根據測定和評定結果確定Nisin和納他霉素最適的添加量。

（2）滅菌溫度的確定：在確定了其他工藝條件都相同的情況下，稱取5份豆腐，以試驗（1）中得出的最適的Nisin和納他霉素添加量添加，選擇滅菌溫度的5個溫度梯度75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃放入水浴鍋中滅菌25 min，滅菌完成后冷卻并放入設定溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每隔1 d對試樣進行一次感官評定，并在第7天時測定其菌落總數，根據測定和評定結果確定最適滅菌溫度。

（3）滅菌時間的確定：在確定了其他工藝條件都相同的情況下，稱取5份豆腐，添加試驗（1）中得出的最適的Nisin和納他霉素添加量，放入設定了試驗（2）中得出的最適滅菌溫度的恒溫水浴鍋中，選擇滅菌時間的5個時間梯度15 min、20 min、25 min、30 min、35 min對試樣進行滅菌，滅菌完成后冷卻并放入設定溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每隔1 d對試樣進行一次感官評定，并在第7天時測定其菌落總數，根據測定和評定結果確定最適的滅菌時間。

1.3.4 不同因素對豆腐保鮮影響的正交試驗豆腐的保鮮時間與豆腐在制作過程中防腐劑的添加量（A），滅菌溫度（B）和滅菌時間（C）等因素有著重要的關系，根據單因素試驗的結果選擇進行3因素3水平正交試驗，根據保溫試驗第7天得出的不同單因素對豆腐保鮮時間的影響，研究出最適合豆腐保鮮的的工藝條件[11]。正交試驗因素水平設計見表1。

表1 豆腐保鮮條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for tofu preservation conditions optimization

1.3.5 菌落總數測定方法

按照GB4789.2—2010《食品微生物學菌落總數測定》的規(guī)定對試樣進行菌落總數的測定，國家散裝豆腐規(guī)定其菌落總數應小于1×105CFU/g[12]。

1.3.6 感官評定標準[13]

綜合感官評價指標由色澤、組織狀態(tài)、氣味和滋味4個指標構成，按照評分標準請10名同學組成感官評價小組，各自打分，最終計算的平均分作為評價指標主要從口色澤（30分）、組織狀況（30分）、氣味（20分）、滋味（20分）四個方面來進行評價，總分為100分[13]。具體感官評分標準如表2。

表2 豆腐感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of tofu

續(xù)表

2 結果與分析

2.1 豆腐保鮮條件優(yōu)化單因素試驗[14]

2.1.1 Nisin和納他霉素的最適添加量的確定

Nisin和納他霉素的添加量對微生物菌落總數的影響見表3，對感官評分的影響見圖1。由表3可知，Nisin與納他霉素的添加量對豆腐中微生物菌落總數的測定結果具有一定的影響，隨著Nisin和納他霉素添加量的增加，豆腐試樣中菌落總數呈先逐步減少而后緩慢增加趨勢，在排除試驗污染的情況下，很可能是兩者添加量的增加，使得樣品內環(huán)境發(fā)生了改變，不能充分發(fā)揮兩者的協(xié)同作用的效果。由圖1可知，隨著保溫試驗時間的延長，豆腐試樣的感官評分都呈逐步下降趨勢，但nisin與納他霉素的添加量都為0.12 g/kg時，感官評分下降趨勢較緩，最終感官評分也最高。從抑菌效果、節(jié)約成本及感官評價等方面綜合考慮，nisin與納他霉素的添加量為0.12 g/kg時，豆腐試樣的保鮮效果最佳。

表3 乳酸鏈球菌素和納他霉素的添加量對豆腐微生物菌落總數的影響Table 3 Effect of nisin and natamycin addition on total bacterial counts of tofu

圖1 乳酸鏈球菌素和納他霉素的添加量對豆腐感官評分的影響Fig. 1 Effect of nisin and natamycin addition on sensory evaluation of tofu

2.1.2 滅菌溫度的確定

滅菌溫度對微生物菌落總數的影響見表4，對感官評分的影響見圖2。由表4可知，豆腐試樣的滅菌溫度對豆腐試樣中微生物菌落總數的測定具有一定的影響，隨著滅菌溫度的增加，菌落總數隨之減少，滅菌溫度在85～95 ℃時菌落總數減少的幅度不大，在0.51×104～0.57×104CFU/g，抑菌效果較好。由圖2可知，隨著保溫試驗時間的延長，豆腐試樣的感官評分呈逐步下降趨勢，但滅菌溫度為85 ℃時，感官評分下降趨勢較緩，最終感官評分也最高。綜合來看，選擇滅菌溫度為85 ℃時，豆腐試樣的保鮮效果最優(yōu)。

表4 滅菌溫度對豆腐微生物菌落總數的影響Table 4 Effect of sterilization temperature on total bacterial counts of tofu

圖2 滅菌溫度對豆腐感官評分的影響Fig. 2 Effect of sterilization temperature on sensory evaluation of tofu

2.1.3 滅菌時間的確定

滅菌時間對微生物菌落總數的影響見表5，對感官評分的影響見圖3。由表5可知，豆腐試樣的滅菌時間對豆腐試樣中微生物菌落總數的測定具有一定的影響，隨著滅菌時間的增加，菌落總數呈現減少的趨勢，當滅菌時間為25 min以后，菌落總數減少較慢。由圖3可知，隨著滅菌時間的延長，豆腐試樣的感官評分呈逐步下降趨勢，在7 d內的感官評定中，滅菌時間為25 min時，感官評分相對較高，所以綜合滅菌效果和感官評分兩方面來看，選擇滅菌時間為25 min時，豆腐試樣的保鮮效果最優(yōu)。

表5 滅菌時間對豆腐微生物菌落總數的影響Table 5 Effect of sterilization time on total bacterial counts of tofu

圖3 滅菌時間對豆腐感官評分的影響Fig. 3 Effect of sterilization time on sensory evaluation of tofu

2.2 豆腐保鮮條件優(yōu)化正交試驗

按照單因素試驗結果，選擇單因素Nisin與納他霉素的添加量0.08 g/kg、0.12 g/kg和0.16 g/kg作為單因素A的三個水平，選擇單因素滅菌溫度80 ℃、85 ℃和90 ℃作為單因素B的三個水平，選擇滅菌時間20 min、25 min和30 min作為單因素C的三個水平，以感官評分和菌落總數為評價指標設計正交試驗，正交試驗結果與分析見表6，方差分析結果見表7。

表6 豆腐保鮮條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal experiments for tofu preservation conditions optimization

表7 以感官評分為評價指標的正交試驗結果方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal experiments results using sensory score as evaluation index

由表6的極差R可知，正交試驗各因素對豆腐保鮮影響的主次順序依次為A＞B＞C，即Nisin與納他霉素的添加量對試驗結果影響最大。最佳的配方組合為A2B3C1，即當Nisin與納他霉素的添加量為0.12 g/kg，滅菌溫度為90 ℃，滅菌時間為20 min時，豆腐試樣的感官評分最高為93分，微生物菌落總數最少為0.53×104CFU/g。由表7可知，3個因素對感官評分影響極顯著（P＜0.01）。

3 結論

在對Nisin與納他霉素的添加量，滅菌溫度和滅菌時間等主要影響因素進行單因素試驗的基礎上，通過正交試驗，確定了以Nisin與納他霉素的添加量分別為0.12 g/kg，滅菌溫度為90 ℃，滅菌時間為20 min為豆腐試樣的加工工藝條件時，豆腐試樣在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，感官評分達到93分，屬于優(yōu)質豆腐級別，菌落總數為0.53×104CFU/g。雖然GB 2712—2014《食品安全國家標準 豆制品》取消了定型包裝非發(fā)酵豆制品菌落總數指標，但當菌落總數超過一定限值時，產品的性狀就會發(fā)生改變，也就是說通過感官特征就可以識別，在同樣條件下對照組保存1 d就會聞到臭味，感官評低于50分。綜合以上情況，通過試驗提高了豆腐的保鮮質量，達到了保鮮目的[16-20]。