小麥麩皮水不溶性阿拉伯木聚糖提取及其酶解產(chǎn)物分析

黎 芳，劉 佳，王冉冉，劉必慧，李 沖，易若琨，趙 欣*

（1.重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心 重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心重慶市功能性食品研發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室，重慶400067；2.重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶400067）

小麥麩皮是小麥制粉加工中的主要副產(chǎn)品，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，每年產(chǎn)量可達(dá)3 000萬(wàn)t以上[1-2]。目前，小麥麩皮很少用于深加工和再利用。小麥麩皮作為面粉廠的大宗副產(chǎn)品，來(lái)源充足、價(jià)格低廉，若能將其深加工，將具有很高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

阿拉伯木聚糖（arabinoxylans，AX）作為小麥麩皮中的主要成分，與纖維素、果膠、β-葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖等其它多糖共同構(gòu)成了細(xì)胞壁，作為細(xì)胞骨架的一部分，維持組織的完整性[3]。根據(jù)水溶性的差異可將AX分為水溶性阿拉伯木聚糖和水不溶性阿拉伯木聚糖。其中，水不溶性阿拉伯木聚糖占整個(gè)AX含量的80%以上[4-5]。目前主要采用堿法提取水不溶性阿拉伯木聚糖[6-9]，常用的堿有NaOH、Ca（OH）2、Ba（OH）2等。鄭學(xué)玲[10]采用堿提法對(duì)麩皮中水不溶性阿拉伯木聚糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化得出，提取劑為Ba（OH）2時(shí)，提取率較NaOH高；馬福民等[11]也采用堿提法對(duì)全麥粉中的水不溶性阿拉伯木聚糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化得出，最佳提取工藝條件為料液比1∶188（g∶mL）、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間3 h，提取率為31.87%。在堿性條件下，提取率較高，但會(huì)破壞阿拉伯木聚糖結(jié)構(gòu)中如阿魏酸等功能基團(tuán)。

阿拉伯木聚糖經(jīng)酶解后得到的阿拉伯低聚木糖（arabinoxylan oligosaccharides，AXOS）為一種新型的益生元，可特異性地促進(jìn)益生菌的增殖，尤其是對(duì)雙歧桿菌（Bifidobacterium）增殖作用的效果顯著優(yōu)于果寡糖[12]。因木聚糖來(lái)源和木聚糖酶的酶學(xué)特性的不同，導(dǎo)致阿拉伯低聚木糖也有差異，如低聚木糖（木二、木三等）、木糖、阿拉伯糖等支鏈水解產(chǎn)物，因此，有必要對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖酶解產(chǎn)物進(jìn)行研究。

本研究以Ba（OH）2作為堿提劑，采用堿提法對(duì)小麥麩皮中水不溶性阿拉伯木聚糖進(jìn)行提取，以其得率為響應(yīng)指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以提取的水不溶性阿拉伯木聚糖為底物，選用不同來(lái)源及種類的木聚糖酶酶解阿拉伯木聚糖，并采用薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）分析酶解產(chǎn)物中低聚木糖的差異性，以期篩選最適木聚糖酶，為今后阿拉伯低聚木糖的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥：河南農(nóng)科院；耐高溫α-淀粉酶（120 KNU/g）、高轉(zhuǎn)化率糖化酶（300 AGU/mL）、堿性蛋白酶（10 KU/mL）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；地衣酚、D-木糖、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（均為分析純）：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；木糖、木二塘、木三塘、木四糖（純度均＞95%）：愛爾蘭Megazyme公司。

木聚糖酶：分別為A～F，其中A來(lái)源于鏈霉菌（Streptomyces）L10904；B來(lái)源于鏈霉菌L10608，為11家族酶；C來(lái)源于鏈霉菌L10608，為10家族酶；D來(lái)源于嗜熱踝節(jié)菌（Talaromyces thermophilus）F1208；E來(lái)源于鏈霉菌L10904重組酶；F來(lái)源于鏈霉菌L10904改造酶（替換N端部分序列：第一個(gè)賴氨酸替換成丙氨酸），具體信息見表1。

表1 木聚糖酶的酶活及最適作用條件Table 1 Enzyme activities and optimum reaction conditions of xylanases

1.2 儀器與設(shè)備

I9型紫外可見分光光度計(jì)：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；Stuart系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京首選科技有限公司；FreeZone-6L冷凍干燥設(shè)備：美國(guó)Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥麩皮中水不溶性阿拉伯木聚糖的提取

小麥麩皮的制備：小麥經(jīng)麩皮分離小麥磨粉機(jī)得到粗麩皮，粗麩皮經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

水不溶性阿拉伯木聚糖的提取參考文獻(xiàn)[13]，并根據(jù)實(shí)際情況加以調(diào)整。

稱取水不溶性木聚糖粗提物1.0 g，按一定料液比加入飽和Ba（OH）2堿溶液，在一定溫度條件下、150 r/min攪拌，提取結(jié)束后調(diào)pH值至7.0，離心后取上清液真空濃縮至10 mL，于截留分子質(zhì)量為10 000 Da的透析膜中進(jìn)行透析，透析液為高純水，透析過夜，冷凍干燥，得到水不溶性阿拉伯木聚糖。

1.3.2 水不溶性阿拉伯木聚糖提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

料液比的確定：設(shè)定提取溫度50 ℃，提取時(shí)間2 h，考察料液比（1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250）對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影響，其計(jì)算公式如下：

采用單因素輪換法依次考察提取時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、提取溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影響。

1.3.3 水不溶性阿拉伯木聚糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）3個(gè)因素為自變量，以水不溶性阿拉伯木聚糖得率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 水不溶性阿拉伯木聚糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for the extraction process optimization of water insoluble arabinoxylans

1.3.4 分析測(cè)定

水不溶性阿拉伯木聚糖含量的測(cè)定：采用地衣酚-鹽酸法[14]。

蛋白含量的測(cè)定：參照GB/T 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[15]中的微量凱氏定氮法。

淀粉含量的測(cè)定：參照AOAC 996.11方法用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，該方法適用于測(cè)定谷物中總淀粉的含量。

水分含量的測(cè)定：參照GB/T 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》[16]。

1.3.5 酶解產(chǎn)物薄層色譜分析

采用不同木聚糖酶（A～F）對(duì)最優(yōu)提取工藝條件下提取的水不溶性阿拉伯木聚糖進(jìn)行酶解，酶解產(chǎn)物經(jīng)陰陽(yáng)離子樹脂吸附過夜，以除去樣品中的離子，點(diǎn)樣于TLC板上，將點(diǎn)好的板放入展開槽內(nèi)展開兩次，吹干，進(jìn)行顯色。所用展開劑為正丁醇∶冰醋酸∶重蒸水=2∶1∶1（V/V），顯色劑為500 mL甲醇與25 mL濃硫酸的混合液。

2 結(jié)果與分析

2.1 水不溶性阿拉伯木聚糖提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影響

由圖1可以看出，隨著提取劑體積的增加，水不溶性阿拉伯木聚糖得率呈現(xiàn)先升高后穩(wěn)定的趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S著提取劑體積的增大，粗提物與提取溶劑接觸界面增大，傳質(zhì)速率提高，導(dǎo)致得率增大。當(dāng)料液比達(dá)到1∶150時(shí)，水不溶性阿拉伯木聚糖得率達(dá)到22.67%。繼續(xù)增加提取劑體積，水不溶性阿拉伯木聚糖得率趨于穩(wěn)定。從節(jié)約資源，減少環(huán)境污染角度考慮，選擇最優(yōu)料液比為1∶150。

圖1 料液比對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影響Fig. 1 Effect of solid to liquid ratio on the yield of water insoluble arabinoxylan

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影響

由圖2可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，水不溶性阿拉伯木聚糖得率呈現(xiàn)先增高后穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為4 h時(shí)，水不溶性阿拉伯木聚糖得率達(dá)到27.40%。繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，水不溶性阿拉伯木聚糖得率趨于穩(wěn)定。因此，最優(yōu)提取時(shí)間為4 h。張曉娜等[17]提取玉米皮中的阿拉伯木聚糖最優(yōu)提取時(shí)間為3 h。

圖2 提取時(shí)間對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影響Fig. 2 Effect of extraction time on the yield of water insoluble arabinoxylan

2.1.3 提取溫度對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影響

由圖3可以看出，隨著提取溫度的升高，水不溶性阿拉伯木聚糖得率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度達(dá)到60℃時(shí)，水不溶性阿拉伯木聚糖得率達(dá)到最大值，為30.9%。繼續(xù)提高提取溫度后，水不溶性阿拉伯木聚糖得率減小，分析原因可能是隨著提取溫度的升高，提取劑揮發(fā)，同時(shí)小麥麩皮中的淀粉易產(chǎn)生糊化現(xiàn)象，從而影響水不溶性阿拉伯木聚糖得率，導(dǎo)致水不溶性阿拉伯木聚糖得率降低。因此，最優(yōu)提取溫度為60 ℃。遲燕平等[18]采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化米糠中阿拉伯木聚糖提取條件，選擇最優(yōu)提取溫度為66 ℃，與本研究的提取溫度60 ℃接近。

圖3 提取溫度對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影響Fig. 3 Effect of extraction temperature on the yield of water insoluble arabinoxylan

2.2 水不溶性阿拉伯木聚糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）3個(gè)因素為自變量，水不溶性阿拉伯木聚糖得率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 水不溶性阿拉伯木聚糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for the extraction process optimization of water insoluble arabinoxylan

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert軟件對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到水不溶性阿拉伯木聚糖得率對(duì)提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=50.06+3.02A+5.04B+4.86C-3.10AB+0.80AC+4.28BC-12.07A2-7.34B2-6.14C2。

由表4可知，模型的P值=0.000 3＜0.01，極顯著，失擬項(xiàng)P值=0.676 2＞0.05，不顯著，說明模型可靠，可用于分析預(yù)測(cè)水不溶性阿拉伯木聚糖提取工藝的優(yōu)化程度。3個(gè)因素對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影響主次順序?yàn)锽＞C＞A，即提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度。一次項(xiàng)B、C和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)A及交互項(xiàng)BC對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），交互項(xiàng)AB、AC對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。各個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面如圖4所示。

由圖4可知，交互作用BC的響應(yīng)面存在最高點(diǎn)，響應(yīng)面呈拋物線型，等高線呈橢圓形，說明交互作用BC對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖得率的影響顯著，而其他交互作用影響不顯著。

圖4 提取溫度、提取時(shí)間及料液比交互作用對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖得率影響的響應(yīng)面曲線及等高線Fig. 4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between extraction temperature, time and solid to liquid ratio on the yield of water unextractable arabinoxylan

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化，得到水不溶性阿拉伯木聚糖的最佳提取工藝條件：提取溫度61.21 ℃、提取時(shí)間4.99 h、料液比1∶193.00（g∶mL），在此優(yōu)化條件下，水不溶性阿拉伯木聚糖得率達(dá)到52.82%?？紤]到試驗(yàn)的可操作性，將最佳的提取條件調(diào)整為提取溫度61 ℃、提取時(shí)間5 h、料液比1∶193（g∶mL）。在此最優(yōu)提取條件下，水不溶性阿拉伯木聚糖得率為51.61%，與理論預(yù)測(cè)值相差不大。

2.3 提取物中主要成分分析

對(duì)最佳提取工藝條件下提取的水不溶性阿拉伯木聚糖的基本成分進(jìn)行測(cè)定，以便進(jìn)行后期酶解產(chǎn)物分析研究，測(cè)定結(jié)果如表5所示。

表5 最佳工藝條件下提取物中主要成分的測(cè)定Table 5 Determination of main components in the extract at the optimum condition

由表5可知，在最佳提取工藝條件下提取的水不溶性阿拉伯木聚糖含量較高（72.19%），蛋白質(zhì)（2.09%）及淀粉（0.18%）的含量很低，有利于后期試驗(yàn)研究。張梅紅等[19]采用NaOH提取阿拉伯木聚糖，含量為69.67%，說明本研究所得水不溶性阿拉伯木聚糖的純度相對(duì)更高。

2.4 酶解產(chǎn)物的薄層色譜分析

采用不同木聚糖酶（A～F）對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖進(jìn)行酶解，酶解產(chǎn)物進(jìn)行TLC分析，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，不同種類的木聚糖酶對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖進(jìn)行酶解，其酶解產(chǎn)物的種類、含量是不同的，酶解產(chǎn)物以木二糖為主。其中木聚糖酶A的酶解產(chǎn)物種類最多，木聚糖酶D的酶解產(chǎn)物種類相對(duì)較少，木聚糖酶D對(duì)水不溶性阿拉伯木聚糖的水解率不高，說明該木聚糖酶水解堿提水不溶性阿拉伯木聚糖并不能產(chǎn)生大量的活性低聚糖。有大量研究表明，當(dāng)不同結(jié)構(gòu)和組成成分的木聚糖與木聚糖酶結(jié)合時(shí)，由于木聚糖酶空間結(jié)構(gòu)的容納性，導(dǎo)致結(jié)合方式的改變引起產(chǎn)物發(fā)生變化[20-21]，從薄層色譜可以看出木聚糖酶A酶解產(chǎn)物種類和含量相對(duì)其他木聚糖酶酶解產(chǎn)物種類和含量更多。

圖5 不同木聚糖酶酶解產(chǎn)物薄層色譜分析結(jié)果Fig. 5 Thin layer chromatography analysis results of enzymatic hydrolyzed products of different xylanases

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得出小麥麩皮中水不溶性阿拉伯木聚糖的最佳提取工藝條件為料液比1∶193（g∶mL）、提取溫度61 ℃，提取時(shí)間5 h。在此最優(yōu)提取條件下，水不溶性阿拉伯木聚糖的得率達(dá)51.61%。以堿提法提取的水不溶性阿拉伯木聚糖為底物，用不同種類的木聚糖酶（A～F）進(jìn)行酶解，TLC分析結(jié)果表明，鏈霉菌L10904來(lái)源的木聚糖A對(duì)堿提法提取的水不溶性阿拉伯木聚糖有較好的底物特異性，酶解產(chǎn)物豐富且酶解產(chǎn)物以木二糖為主，為阿拉伯低聚木糖的制備提供理論依據(jù)。