煙曲霉素5 L罐發(fā)酵條件優(yōu)化及中試

王昊鵬，楊 萌，吳黎明，倪 輝，肖安風，張中印*

（1.河南科技學院 資源與環(huán)境學院，河南 新鄉(xiāng)453003；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京100093；3.集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門361021）

煙曲霉素（fumagillin）是一種重要的天然活性物質(zhì)，是由煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）代謝產(chǎn)生的?，F(xiàn)有研究報道，煙曲霉素能夠防治蜜蜂[1-3]、魚[4-5]和蝦的微孢子蟲??；同時，煙曲霉素及其結(jié)構(gòu)類似物（fumagillin B、TNP-470和CKD-732等）能夠抑制新生血管生成[6]，被作為腫瘤細胞血管生成抑制劑用于癌癥的治療[6-7]；煙曲霉素也用于治療艾滋病患者的感染[8]和器官移植時減輕腸道感染微粒子病[9]的情況；此外，煙曲霉素能夠改善由于飲食誘導的肥胖癥[10-12]，有望成為減肥新藥物。

目前，國內(nèi)關于煙曲霉素的發(fā)酵生產(chǎn)研究還處于實驗室階段，同時由于知識產(chǎn)權(quán)和貿(mào)易保護等因素，使國外的相關研究成果難以參考與借鑒，而煙曲霉素又作為新型的抗生素藥物，在醫(yī)藥、作物病害防治、蜂業(yè)、蠶業(yè)和漁業(yè)養(yǎng)殖[13-17]等方面均有重要應用，因此進行煙曲霉素的發(fā)酵試驗具有十分重要的意義。

發(fā)酵罐是發(fā)酵工業(yè)的心臟，是實現(xiàn)產(chǎn)品由實驗室到商品化成品的必要設備[18]。該研究在煙曲霉素搖瓶發(fā)酵的基礎上，進行5 L發(fā)酵罐的工藝優(yōu)化及中試放大，以獲得具有產(chǎn)業(yè)化應用價值的發(fā)酵工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

煙曲霉（Aspergillus fumigatus）CEA-1701：中國農(nóng)科院蜜蜂研究所。

1.1.2 試劑

煙曲霉素標準品：北京百威靈科技有限公司；甲醇（色譜純）：美國Tedia公司；消泡劑：按照泡敵∶植物油∶水（V/V）=1∶1∶3配制，其中泡敵購自廈門匯盛生物有限公司；玉米粉：漳州閩成玉米制品有限公司；其他生化試劑及藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基：采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，土豆200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，定容至1 000 mL，1×105Pa滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油33.5 g/L，酵母提取粉3.1 g/L，玉米粉1.7 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.013 g/L。初始pH調(diào)整為6.0±0.5，1×105Pa滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀（inertsustainRC18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm））：日本島津公司；MJX 智能型霉菌培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；TDL-40B 臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；PE20實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GZX-DH 電熱恒溫干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；BIOTECH-5BG-7000A 5 L自動發(fā)酵罐：上海保興生物設備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單孢子菌懸液的制備

將煙曲霉CEA-1701接種到PDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d得到成熟孢子。無菌操作下，用無菌生理鹽水洗下孢子，倒入裝有玻璃珠的無菌錐形瓶中，充分振蕩30 min。待孢子充分打散后，測菌懸液OD600nm值，并用無菌生理鹽水調(diào)整其OD600nm至2.0，即得單孢子菌懸液[19]。

1.3.2 初始發(fā)酵條件

5 L發(fā)酵罐，以1%接種量將單孢子菌懸液在火焰保護下接種至裝液量為3.5 L的發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫度30 ℃，初始pH為6.0±0.5，無菌空氣通氣量為0.5 m3/h，攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)168h，每12h取樣測定煙曲霉素含量和生物量產(chǎn)量。

1.3.3 生物量的測定

準確移取5 mL發(fā)酵液于室溫條件下5 000 r/min離心10 min，然后轉(zhuǎn)移、保存上清液測定煙曲霉素的含量，將沉淀的菌體用蒸餾水清洗3次后于80 ℃烘箱內(nèi)烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量，統(tǒng)計生物量。

1.3.4 煙曲霉素含量的測定

樣品處理：將離心得到的上清液，通過0.22 μm的濾膜過濾于棕色進樣瓶中，過程盡量避光。

色譜分析條件：InertsustainRC18反相柱，紫外檢測器檢測波長350 nm，柱溫25 ℃，進樣20 μL，流速0.8 mL/min。流動相為水（A）、甲醇（B），溶劑梯度洗脫程序為：0～2 min，A/B=80∶20（V/V）；2～5 min，A/B=70∶30；5～15 min，A/B=30 ∶70；15 ～25 min，A/B=10 ∶90；25 ～27 min，A/B=10 ∶90；27～28 min，A/B=80∶20；28～40 min，A/B=80∶20。

煙曲霉素標溶液制備：以煙曲霉素標準品1 000 mg/L為母液，色譜純甲醇為溶劑，稀釋成不同質(zhì)量濃度的標準溶液5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L，每個梯度做5個平行，繪制煙曲霉素標準曲線，得到標準曲線回歸方程為y=209 858x-12 376，相關系數(shù)R2=0.999 8，根據(jù)回歸方程計算煙曲霉素質(zhì)量濃度。

1.3.5 發(fā)酵過程中參數(shù)的測定

通過5 L發(fā)酵罐的溶氧電極測定發(fā)酵液的溶氧量（dissolved oxygen，DO），通過pH電極測定發(fā)酵液pH。

1.3.6 單因素試驗優(yōu)化

分別考察不同轉(zhuǎn)速條件（500 r/min、600 r/min、700 r/min、800 r/min）、不同發(fā)酵溫度（25 ℃、30 ℃和35 ℃）、不同發(fā)酵pH（pH為6.0、7.0和自然pH條件（6.2～6.5））、不同接種量（1%、3%、5%）、不同碳源（甘油、葡萄糖和可溶性淀粉）作為單一碳源時，煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素的變化情況。

1.3.7 20 L發(fā)酵罐中試

根據(jù)5L發(fā)酵罐優(yōu)化結(jié)果，采用經(jīng)驗放大法進行20 L罐的中試試驗。在以發(fā)酵溫度30 ℃，自然pH，攪拌轉(zhuǎn)速270 r/min，通氣量0.5 m3/h的條件下，考察0.5%、1%和3%接種量對煙曲霉素產(chǎn)量的影響，發(fā)酵周期內(nèi)每12 h取樣測定煙曲霉素含量和生物量產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同轉(zhuǎn)速對煙曲霉素產(chǎn)量的影響

結(jié)合搖瓶試驗研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中菌絲體形態(tài)對煙曲霉素的產(chǎn)量影響較大，如果發(fā)酵過程出現(xiàn)菌絲體結(jié)團現(xiàn)象將不利于煙曲霉素的合成，在發(fā)酵罐放大試驗中，可以通過攪拌來解決菌絲體結(jié)團的現(xiàn)象。一方面，攪拌能夠提高發(fā)酵液的溶氧量，使菌絲體在剪切力的作用下被充分切碎、打散；另一方面，過高的攪拌轉(zhuǎn)速剪切力過大易引起菌體細胞破損，造成代謝異常，過低的攪拌轉(zhuǎn)速菌絲體相互纏繞結(jié)團形成菌絲球，不利于發(fā)酵生產(chǎn)[20]。

保持5 L發(fā)酵罐初始發(fā)酵條件不變，分別考察500 r/min、600 r/min、700 r/min、800 r/min轉(zhuǎn)速條件對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素、生物量、pH以及DO的影響。結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，煙曲霉素產(chǎn)量變化曲線整體呈現(xiàn)出先增后降再增最后趨于穩(wěn)定的趨勢。攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min時，由于攪拌轉(zhuǎn)速低，煙曲霉CEA-1701生長較慢，在發(fā)酵36 h時才達到最大生物量16.38 g/L，48 h時才在發(fā)酵液中檢測到煙曲霉素，96～168 h DO快速回升表明菌體出現(xiàn)大量衰亡，發(fā)酵周期內(nèi)檢測到煙曲霉素的最高產(chǎn)量為46.01 mg/L；攪拌轉(zhuǎn)速為600 r/min時，煙曲霉素產(chǎn)量得到大幅提高，達到90.78 mg/L，但溶氧從24 h就基本趨于20%的水平，這說明溶氧還可以進一步的提高；攪拌轉(zhuǎn)速為700 r/min和800 r/min時，發(fā)酵曲線變化趨勢基本一致。在36～120 h時，溶氧變化曲線均出現(xiàn)持續(xù)掉零現(xiàn)象[21]，但菌體仍維持一定的生物量產(chǎn)量，這說明煙曲霉CEA-1701為兼性厭氧菌。發(fā)酵周期內(nèi)煙曲霉素的最高產(chǎn)量分別達到90.22 mg/L和94.75 mg/L。綜上所述，最終選擇轉(zhuǎn)速800 r/min進一步優(yōu)化5 L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝。

圖1 不同攪拌轉(zhuǎn)速對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素（A）、生物量（B）、pH（C）以及溶氧量（D）的影響Fig. 1 Effects of different stirring speed on fumagillin production (A),biomass (B), pH (C) and dissolved oxygen (D) by Aspergillus fumigatus CEA-1701

2.2 不同溫度對煙曲霉素產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度的調(diào)控對微生物生長和代謝產(chǎn)物的積累具有重要意義[22]。發(fā)酵溫度過高菌體易老化，細胞內(nèi)部分酶活性降低；發(fā)酵溫度過低菌體無法正常生長，這在搖瓶實驗中已經(jīng)得到驗證?；趽u瓶發(fā)酵溫度的研究結(jié)果，選取25 ℃、30 ℃和35 ℃三個溫度梯度進行5 L發(fā)酵罐溫度優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同發(fā)酵溫度對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素（A）、生物量（B）、pH（C）以及溶氧量（D）的影響Fig. 2 Effects of different fermentation temperatures on fumagillin production (A), biomass (B), pH (C) and dissolved oxygen (D) by Aspergillus fumigatus CEA-1701

由圖2可知，3種不同發(fā)酵溫度煙曲霉素的發(fā)酵曲線趨勢大致相同：其中以30 ℃和35 ℃進行發(fā)酵時較25 ℃能夠較早的產(chǎn)生煙曲霉素，當發(fā)酵溫度為30 ℃時，整個發(fā)酵周期pH變化在5.5～7.0之間，相對較穩(wěn)定，煙曲霉素獲得了較高的產(chǎn)量為94.7 mg/L；35 ℃發(fā)酵時，24～48 h時pH下降較快，96 h后又出現(xiàn)持續(xù)的升高，這是由于35 ℃煙曲霉CEA-1701生長過快導致的，煙曲霉素最高產(chǎn)量達到81.17 mg/L；25 ℃發(fā)酵時，24 h生物量產(chǎn)量仍較低，36～96 h生物量變化曲線出現(xiàn)上下波動，pH明顯較高，這主要是因為發(fā)酵溫度低菌體生長代謝慢，發(fā)酵液粘稠導致的。由圖2（d）可知，25 ℃發(fā)酵時，最先出現(xiàn)溶氧下降，而生物量并不是最先增加的，這是由于發(fā)酵初期溫度低，溶氧量低，菌體生長緩慢導致的；35 ℃和30 ℃的DO變化曲線基本一致，均在發(fā)酵36 h出現(xiàn)掉零現(xiàn)象。綜上所述，30 ℃發(fā)酵時，能夠較早的生成煙曲霉素并且煙曲霉素產(chǎn)量最高達到94.7 mg/L，整個發(fā)酵過程pH變化較穩(wěn)定，因此，進一步的研究選擇發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.3 不同發(fā)酵pH對煙曲霉素產(chǎn)量的影響

發(fā)酵過程的pH是動態(tài)變化的，pH影響菌絲體的生長代謝，過高的pH不利于煙曲霉素的積累[23]，當發(fā)酵液pH值超過7.5時煙曲霉素將會分解，根據(jù)搖瓶實驗及現(xiàn)有報道，選擇pH為6.0、7.0和自然pH條件下，對比不同pH條件下5 L發(fā)酵罐中煙曲霉素產(chǎn)量、生物量、pH以及DO變化情況，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，不同pH條件下的煙曲霉素產(chǎn)量變化曲線、生物量和DO變化曲線基本呈現(xiàn)出一致的變化趨勢。pH為6.0和自然pH條件下，能夠較早的生成煙曲霉素，其中自然pH條件下，煙曲霉素獲得了較高的產(chǎn)量達到82.08mg/L；生物量變化曲線說明，在pH為6.0、7.0和自然條件下煙曲霉CEA-1701均能正常生長，其中以pH為7.0獲得了較高的生物量產(chǎn)量17.5 g/L，煙曲霉素最高產(chǎn)量為72.81 mg/L；DO變化曲線可以看出，自然pH條件下，DO最先出現(xiàn)下降，這說明自然pH條件下更適宜煙曲霉CEA-1701的生長。綜上所述，選擇在自然pH條件下進行。

圖3 不同發(fā)酵pH對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素（A）、生物量（B）、溶氧量（C）的影響Fig. 3 Effects of different fermentation pH on fumagillin production (A), biomass (B), dissolved oxygen (C) by Aspergillus fumigatus CEA-1701

2.4 不同接種量對煙曲霉素產(chǎn)量的影響

對接種量的優(yōu)化，是在解決發(fā)酵菌體結(jié)團的情況下，考察接種量為1%、3%和5%對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素、生物量、pH以及DO的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同接種量對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素（A）、生物量（B）、pH（C）以及溶氧量（D）的影響Fig. 4 Effects of different inoculum on fumagillin production (A), biomass (B), pH (C) and dissolved oxygen (D) by Aspergillus fumigatus CEA-1701

由圖4可以看出，不同接種量條件下的發(fā)酵曲線變化基本一致。1%和3%接種量在發(fā)酵前120 h煙曲霉素產(chǎn)量都略高于5%接種量，1%、3%和5%發(fā)酵周期內(nèi)煙曲霉素最高產(chǎn)量分別達到68.82 mg/L、97.76 mg/L和80.42 mg/L；生物量變化曲線基本一致，都呈現(xiàn)出急速上升然后緩慢下降的趨勢；pH變化曲線顯示，5%接種量的pH變化波動較大；DO變化曲線顯示3%接種量條件下較早的達到了溶氧平衡狀態(tài)，5%接種量發(fā)酵后期DO出現(xiàn)持續(xù)回升。綜合來看，選擇3%接種量進行下一步的研究。

2.5 不同碳源對煙曲霉素產(chǎn)量的影響

根據(jù)搖瓶試驗結(jié)果，可溶性淀粉作為單一碳源發(fā)酵時，菌絲體容易出現(xiàn)結(jié)團現(xiàn)象，考慮到5 L發(fā)酵罐能夠通過攪拌解決菌絲體結(jié)團現(xiàn)象，因此再一次利用可溶性淀粉作為單一碳源，同時對比甘油和葡萄糖作為碳源時的發(fā)酵效果，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同碳源對煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素（A）、生物量（B）、pH（C）以及溶氧量（D）的影響Fig. 5 Effects of different carbon sources on fumagillin production (A), biomass (B), pH (C) and dissolved oxygen (D) by Aspergillus fumigatus CEA-1701

由圖5可以看出，甘油作為碳源能夠較早的合成煙曲霉素，煙曲霉素的最高產(chǎn)量為82.81 mg/L；可溶性淀粉和葡萄糖分別作為發(fā)酵碳源時，煙曲霉素的最高產(chǎn)量分別達到69.47 mg/L和62.81 mg/L。生物量變化曲線顯示發(fā)酵初期可溶性淀粉獲得了較高的生物量，產(chǎn)量達到19.44 g/L，這主要是因為可溶性淀粉作為發(fā)酵碳源初期發(fā)酵液中有部分沉淀導致的；其他兩種碳源發(fā)酵時生物量變化基本一致。pH變化曲線顯示，可溶性淀粉作為發(fā)酵碳源時，整個發(fā)酵周期pH都較高；葡萄糖作為發(fā)酵碳源，發(fā)酵初期pH較低，這是因為葡萄糖作為碳源產(chǎn)生酸性物質(zhì)較多；甘油作為碳源時，發(fā)酵周期內(nèi)pH變化較穩(wěn)定。溶氧變化曲線可以看出，可溶性淀粉作為發(fā)酵碳源在發(fā)酵72 h時就出現(xiàn)DO持續(xù)升高，這可能是因為發(fā)酵pH過高導致菌體過早死亡；甘油作為發(fā)酵碳源時，從36 h溶氧DO就出現(xiàn)持續(xù)掉零，這說明菌體代謝活動旺盛。

綜上所述，再解決發(fā)酵菌體接團現(xiàn)象時，可溶性淀粉未能獲得較高的煙曲霉素產(chǎn)量，經(jīng)過對比，適宜煙曲霉CEA-1701產(chǎn)煙曲霉素的發(fā)酵碳源為甘油。

2.6 20 L發(fā)酵罐不同接種量發(fā)酵曲線

根據(jù)5 L罐的發(fā)酵條件，首先控制20 L罐與5 L罐保持相同的發(fā)酵溫度、pH、通氣量和允許的最高轉(zhuǎn)速270 r/min進行發(fā)酵試驗，對比不同接種量時煙曲霉素的發(fā)酵效果，同時為了能夠了解擴大培養(yǎng)后的發(fā)酵周期，在煙曲霉素產(chǎn)量出現(xiàn)下降時再終止發(fā)酵，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同接種量條件下的煙曲霉CEA-1701 20 L罐發(fā)酵曲線Fig. 6 Fermentation curve of Aspergillus fumigatus CEA-1701 in 20 L fermenter with different inoculum

由圖6（a）可以看出，3%和1%接種量較0.5%接種量能夠較早的生成煙曲霉素，這主要是接種量高能夠較快的積累一定的生物量；3%和1%接種量分別發(fā)酵至228 h和216 h時煙曲霉素產(chǎn)量達到最高分別為75.91 mg/L和113.58 mg/L；0.5%接種量72 h后煙曲霉素發(fā)酵曲線呈現(xiàn)出持續(xù)增長的趨勢，240 h時測得煙曲霉素產(chǎn)量達到113.31 mg/L，此時煙曲霉素曲線仍呈上升趨勢，后續(xù)又接著發(fā)酵了24 h最終煙曲霉素產(chǎn)量達到130.57 mg/L。

由圖6（b）可知，不同接種量的生物量變化曲線總體呈現(xiàn)出先增后平穩(wěn)再降低的趨勢，其中3%和1%接種量的生物量積累速度快于0.5%接種量；3%和0.5%接種量的生物

量最高分別達到18.62 g/L和17.5 g/L，1%接種量生物量較低，最高生物量積累量為8.37 g/L。

由圖6（c）可知，0.5%接種量時整個發(fā)酵過程pH變化較穩(wěn)定，3%和1%接種量發(fā)酵后期pH出現(xiàn)持續(xù)升高，這跟6（d）DO變化曲線相關，發(fā)酵至144 h后3%和1%接種量的DO都出現(xiàn)明顯回升，主要是因為大量菌體的自溶，含氮物質(zhì)的分解試放導致的。0.5%接種量發(fā)酵至192 h后DO才出現(xiàn)緩慢的增長，這說明在無法提高轉(zhuǎn)速和改善發(fā)酵液溶氧量的情況下，較低的接種量反而有利于發(fā)酵狀態(tài)的穩(wěn)定。

3 結(jié)論

5 L發(fā)酵罐優(yōu)化得到的發(fā)酵條件為：甘油為碳源，攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min，發(fā)酵溫度30 ℃，接種量3%，通氣量0.5 m3/h，自然pH，在此發(fā)酵條件下發(fā)酵培養(yǎng)168 h，煙曲霉素產(chǎn)量達到97.76 mg/L。

通過對轉(zhuǎn)速的優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，在通氣量一定的條件下，一定范圍內(nèi)提高轉(zhuǎn)速有利于煙曲霉素的積累；溫度優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期適當?shù)母邷赜欣跓熐笴EA-1701的快速繁殖，發(fā)酵后期適當降低溫度有利于煙曲霉素積累，這一點可以考慮后續(xù)進行分段控溫發(fā)酵。pH優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初期較高的pH有利于生物量的積累；對接種量進行優(yōu)化，得出3%的接種量更有利于煙曲霉CEA-1701的生長和煙曲霉素的積累；通過不同碳源發(fā)酵對比，發(fā)現(xiàn)利用甘油作為單一碳源有利于煙曲霉素的積累。

20 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵時，發(fā)酵周期較長，0.5%接種量較1%和3%接種量更有利于煙曲霉素的積累，發(fā)酵168 h時煙曲霉素產(chǎn)量達到62.55 mg/L，發(fā)酵至252 h煙曲霉素積累量達到最高130.57 mg/L，中試效果良好。