冠突散囊菌對燕麥黃酮含量的影響

劉善鑫，劉素純，2*，李再貴

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙410128；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

燕麥（Avena sativa L.）是一種禾本科燕麥屬一年生的全價營養(yǎng)谷物[1]，研究發(fā)現(xiàn)，日常飲食攝入燕麥產(chǎn)品可以有效預(yù)防肥胖癥及其并發(fā)癥[2]，燕麥中的β-葡聚糖能夠清除人體內(nèi)的自由基[3]、促進(jìn)血液循環(huán)、降低膽固醇[4]，從而降低心腦血管疾病的發(fā)病率[5]；且其具有豐富的生物活性成分，如燕麥生物堿、燕麥皂苷、多酚、黃酮等[6]。黃酮作為一種重要的活性物質(zhì)[7]，具有抗氧化[8]、抑菌[9]、抗病毒[10]、降血脂[11]、提高免疫力[12]、消炎[13]、護(hù)肝[14]、治療腦血栓[15]的功能。

使用微生物發(fā)酵谷物不僅可以改善其生理活性，還可能賦予其獨(dú)特的風(fēng)味和質(zhì)地。冠突散囊菌（Eurotium cristatum）俗稱“金花”[16]，是散囊菌屬的一種真菌[17]，也是存在于茯磚茶中使其產(chǎn)生特征風(fēng)味的優(yōu)勢益生菌[18]。王吉成等[19]研究發(fā)現(xiàn)，冠突散囊菌可以顯著性提高桑葉中的黃酮含量；王家琛等[20]研究發(fā)現(xiàn)，冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥能顯著提高其多酚含量。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）是類黃酮合成途徑上游的關(guān)鍵酶，楊慧芹等[21]研究了攀援型和矮生型四棱豆在遭受干旱時苯丙氨酸解氨酶活性和黃酮含量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PAL活性與總黃酮之間存在顯著的正相關(guān)。

國內(nèi)外有很多研究人員利用微生物發(fā)酵研發(fā)新產(chǎn)品[23-24]，本研究利用冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥，以黃酮含量為考察指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化燕麥固態(tài)發(fā)酵條件，并探討發(fā)酵過程中黃酮含量與苯丙氨酸解氨酶活力動態(tài)變化的相關(guān)性，為燕麥加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸燕麥：黑龍江黑土香燕麥產(chǎn)業(yè)股份有限公司；冠突散囊菌（Eurotium cristatum）：分離自湖南安化白沙溪茶廠的茯磚茶，保存于食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室。

蘆?。兌?9%）：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、L-苯丙氨酸、四硼酸鈉、三氯化

鋁、乳酸、醋酸鉀、硼酸、石英砂、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、甘油（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-25085-Ⅱ生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DGG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；XMTD數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；FW135中草藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；RXⅡSeries高速低溫冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；SP-752型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 燕麥固態(tài)發(fā)酵工藝

將50 g裸燕麥于水中浸泡12 h，瀝水后置于500 mL三角瓶中，在121 ℃條件下滅菌25 min，然后分別接入冠突散囊菌，混勻，于28 ℃條件下發(fā)酵。

1.3.2 冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥條件優(yōu)化單因素試驗

按照方法1.3.1發(fā)酵燕麥，依次考察發(fā)酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d）、冠突散囊菌接種量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）、基質(zhì)pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）及發(fā)酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）對燕麥黃酮含量的影響。初始發(fā)酵條件為接種量1%、基質(zhì)pH值為5.0、發(fā)酵溫度28 ℃。

1.3.3 冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥條件優(yōu)化正交試驗

為確定燕麥的最佳發(fā)酵條件，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以黃酮含量（Y）為考察指標(biāo)，選擇發(fā)酵溫度（A）、基質(zhì)pH值（B）、接種量（C）和發(fā)酵時間（D）進(jìn)行4因素4水平正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1 冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for solid-state fermentation conditions optimization of oat by Eurotium cristatum

1.3.4 燕麥黃酮含量的測定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取蘆丁10 mg，用無水乙醇溶解并定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL于10 mL比色管中，分別加2 mL 0.1 mol/L的AlCl3溶液，再加入3 mL 1 mol/L的醋酸鉀溶液，無水乙醇補(bǔ)充至10 mL，避光靜置30 min后，于波長420 nm處測定吸光度值[25]。以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=0.082 4x+0.000 8（R2=0.997 4），R2＞0.99，線性關(guān)系良好，可用于黃酮含量的測定。

樣品中黃酮的提?。喊l(fā)酵后的燕麥置于烘箱45 ℃條件下烘干10 h，粉碎后過40目，得到發(fā)酵的燕麥干粉，取10 g燕麥干粉置于三角瓶，加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，50 ℃條件下浸提3 h，過濾，收集濾液，以體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇補(bǔ)足至100 mL為待測樣品溶液。

樣品中黃酮的測定：吸取待測樣品溶液1 mL置于10 mL比色管中，加入2mL0.1mol/L的AlCl3溶液，再加入3mL1mol/L的醋酸鉀溶液，無水乙醇補(bǔ)充至10 mL，避光靜置30 min后，于波長420 nm處測定吸光度值。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算黃酮的含量。

1.3.5 苯丙氨酸解氨酶活力的測定[26]

取不同發(fā)酵時間培養(yǎng)的發(fā)酵燕麥10g，加10.0mL0.1mol/L的硼酸緩沖液與適量石英砂，研磨勻漿后，4 ℃、10 000 r/min條件下離心8 min，取1 mL上清液為酶提取液，加1.0 mL 0.02 mol/L的L-苯丙氨酸，用0.1 mol/L硼酸緩沖液定容至10.00 mL，空白不加酶液，40 ℃恒溫水浴60 min，使用紫外分光光度計測定波長290 nm處的吸光度值。

苯丙氨酸解氨酶活力定義：以每小時每毫升增加0.01吸光度值為一個酶活力單位（U）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理使用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，Pearson相關(guān)系數(shù)證明其相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對燕麥黃酮含量的影響

不同發(fā)酵時間對燕麥黃酮含量的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同發(fā)酵時間對燕麥黃酮含量的影響Fig. 1 Effect of different fermentation time on flavones content in oat

由圖1可知，3種微生物發(fā)酵燕麥后，隨著發(fā)酵時間的延長，黃酮含量均呈先上升后下降的趨勢，冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥第9天時，黃酮含量達(dá)到最高，為41.21 mg/g，是未發(fā)酵燕麥的2.7倍；冠突散囊菌發(fā)酵的燕麥中黃酮含量上升，可能是因為冠突散囊菌發(fā)酵時產(chǎn)生的苯丙氨酸解氨酶等降低了細(xì)胞壁對黃酮類化合物溶出的阻滯作用，從而使得黃酮含量增加[26]；冠突散囊菌在生長代謝的過程中利用其他營養(yǎng)物質(zhì)如淀粉、多糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化而生成黃酮類物質(zhì)[27]。發(fā)酵10 d后，燕麥黃酮含量開始下降，可能是發(fā)酵后期營養(yǎng)物消耗導(dǎo)致黃酮類化合物被利用為營養(yǎng)基質(zhì)所致[28]。因此，選擇最佳發(fā)酵時間為7 d。

2.1.2 接種量對燕麥黃酮含量的影響

不同接種量對燕麥黃酮含量的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同接種量對燕麥黃酮含量的影響Fig.2 Effect of different inoculum on flavones content in oat

由圖2可知，隨著冠突散囊菌接種量的增大，燕麥黃酮含量呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)接種量為1.0%時，燕麥黃酮含量最高，為40.03 mg/g；當(dāng)接種量＞1.0%之后，燕麥黃酮含量降低，分析原因可能是接種量較大，導(dǎo)致菌株營養(yǎng)和基質(zhì)溶氧量不足，冠突散囊菌之間對基質(zhì)的營養(yǎng)進(jìn)行競爭，發(fā)酵能力下降，燕麥黃酮含量降低[29-30]。因此，選擇最佳接種量為1.0%。

2.1.3 基質(zhì)pH值對燕麥黃酮含量的影響

不同基質(zhì)pH值對燕麥黃酮含量的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同基質(zhì)pH值對燕麥黃酮含量的影響Fig. 3 Effect of substrates with different pH values on flavones content in oat

由圖3可知，隨著燕麥基質(zhì)pH值的增加，燕麥黃酮含量呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)基質(zhì)pH值為5.0時，燕麥黃酮含量最高，為41.16 mg/g。當(dāng)pH＞5.0之后，燕麥黃酮含量降低，分析原因可能是冠突散囊菌更適合在弱酸環(huán)境中生長，其產(chǎn)酶過程及酶促反應(yīng)均會受pH環(huán)境的影響，pH過高和過低均會抑制酶促反應(yīng)的效率[31]，從而導(dǎo)致燕麥黃酮含量較低。因此，應(yīng)選擇基質(zhì)的最佳pH值為5.0。

2.1.4 發(fā)酵溫度對燕麥黃酮含量的影響

不同發(fā)酵溫度對燕麥黃酮含量的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同發(fā)酵溫度對燕麥黃酮含量的影響Fig. 4 Effect of different fermentation temperature on flavones content in oat

由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，燕麥黃酮含量呈先上升后略微下降的趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，燕麥黃酮含量最高，為41.21 mg/g。說明冠突散囊菌在30 ℃時生長狀況較好，能夠有效利用營養(yǎng)物質(zhì)，使得酶促反應(yīng)效率較高；當(dāng)溫度為32 ℃時，黃酮含量略微下降，可能是溫度略高影響了菌體生長，從而對黃酮類物質(zhì)的積累造成了影響[32]。因此，選擇30 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.2 冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以黃酮含量（Y）為考察指標(biāo)，選擇發(fā)酵溫度（A）、基質(zhì)pH值（B）、接種量（C）及發(fā)酵時間（D）為考察因素進(jìn)行4因素4水平的正交試驗，試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for solid-sate fermentation conditions optimization of oat by Eurotium cristatum

續(xù)表

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，燕麥黃酮含量影響因素的主次順序為A（發(fā)酵溫度）＞D（發(fā)酵時間）＞B（基質(zhì)pH值）＞C（接種量），試驗組最佳水平組合為A3B3C1D2；而通過極差分析得出的最佳水平組合為A4B2C2D2。經(jīng)驗證，最佳水平組合為A3B3C1D2，即發(fā)酵溫度30 ℃，基質(zhì)pH值6.0，接種量0.5%，發(fā)酵時間7 d，在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，燕麥黃酮含量最高，為58.13 mg/g，是未發(fā)酵燕麥的3.8倍。由表3可知，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對燕麥黃酮含量的影響極顯著（P＜0.01）；基質(zhì)pH值對燕麥黃酮含量的影響顯著（P＜0.05），而接種量對燕麥黃酮含量的影響不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同發(fā)酵時間對苯丙氨酸解氨酶活性的影響

苯丙氨酸解氨酶是黃酮類化合物合成的第一個關(guān)鍵酶，對苯丙氨酸解氨酶活性與黃酮含量變化進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著發(fā)酵時間的延長，丙氨酸解氨酶活性呈先上升后緩慢下降的趨勢，在第7天達(dá)到最高，為50.9 U/mL。

圖5 發(fā)酵過程中苯丙氨酸解氨酶活性的變化Fig. 5 Changes of phenylalanine ammonia lyase activity during fermentation

由圖1、圖5可知，苯丙氨酸解氨酶活性及黃酮含量均隨著發(fā)酵時間的增加呈先增加后下降的趨勢，黃酮含量與苯丙氨酸解氨酶活性間的相關(guān)性分析結(jié)果見表4。

表4 黃酮含量與苯丙氨酸解氨酶活性間的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between phenylalanine ammonia lyase activity and flavones content

由表4可知，Pearson相關(guān)系數(shù)＞0.8（P＜0.01），表現(xiàn)為顯著正相關(guān)，說明發(fā)酵過程中黃酮含量的變化與苯丙氨酸解氨酶活性的變化密切相關(guān)，所以使用冠突散囊菌發(fā)酵燕麥時，苯丙氨酸解氨酶活性的增加能提高黃酮含量。

3 結(jié)論

利用冠突散囊菌對燕麥進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，能夠提升燕麥中的黃酮含量。冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵燕麥的最優(yōu)條件為發(fā)酵溫度30 ℃、基質(zhì)pH值為6.0、接種量0.5%、發(fā)酵時間7 d，在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，燕麥黃酮含量最高，為58.13 mg/g，較優(yōu)化前提高41.06%，是未發(fā)酵燕麥的3.8倍。在冠突散囊菌發(fā)酵過程中，黃酮含量的變化與苯丙氨酸解氨酶活性的變化呈顯著正相關(guān)。