新型阿爾茨海默癥Tau蛋白PET顯像劑18F-T807的合成

王治國 左 峰 張國旭* 石慶學(xué) 張宗鵬 吳銳先

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease， AD)是老年癡呆的主要原因，腦區(qū)和大腦皮層的纖維蛋白沉積是其特征性病理性改變，細(xì)胞內(nèi)多聚Tau蛋白的沉積及細(xì)胞外間隙的β淀粉樣蛋白(β amyloid，Aβ)，兩者在病理形態(tài)學(xué)上分別體現(xiàn)為神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)及老年斑(SP)[1]。Tau蛋白是體內(nèi)含量最高的微管相關(guān)蛋白，在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富，Tau的病理發(fā)展過程與AD認(rèn)知損傷程度密切相關(guān)，有可能作為AD潛在的治療靶點(diǎn)[2]。腦內(nèi)特定部位Tau蛋白沉積的無創(chuàng)檢查對(duì)疾病早期預(yù)測及診斷很有幫助。正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission tomography， PET)是一種無創(chuàng)分子探針成像方法，可對(duì)人腦生物學(xué)進(jìn)程進(jìn)行廣泛的半定量分析。

近年來，研究者們研發(fā)的多種Tau蛋白PET顯像劑用于觀察腦內(nèi)神經(jīng)疾病的病理改變顯像，其中包括18F-3-(6-[18F]氟吡啶基)-5氫-吡啶并[4，3-b]吲哚(18F-T807)、THK-5117和PBB3[3-4]。利用Tau蛋白放射性示蹤劑PET實(shí)現(xiàn)對(duì)局部以及全身Tau蛋白顯像，這項(xiàng)檢查技術(shù)的發(fā)展將為臨床提供及時(shí)、準(zhǔn)確的鑒別診斷，并且在監(jiān)測疾病進(jìn)展和實(shí)驗(yàn)性臨床治療上提供有力幫助[5-6]。隨著18F標(biāo)記的放射性顯像劑在PET顯像技術(shù)中的應(yīng)用，對(duì)18F標(biāo)記顯像劑的合成與開發(fā)提出更高的要求。本研究旨在探討Tau蛋白顯像劑18FT807的合成方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采用minitrace加速器(美國GE公司)；18F-FPPI前體(江蘇華益公司)；合成用QMA柱、K222、碳酸鉀水溶液、乙腈以及乙醇均為德國ABX公司；分離用乙醇(色譜純，國藥化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸(國藥分析質(zhì)檢中心)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)99.9%超干溶劑(北京百靈威科技有限公司)，C18柱(美國Waters公司)；富18O水(日本大陽日酸株式會(huì)社)；Oasis HLB型固相萃取(solid-phase extraction，SPE)柱(美國Waters公司)；0.22 μm液體濾膜(Millex-GS)及空氣濾膜(Millex-25)均為德國默克公司。

1.2 合成方法

18F離子由minitrace加速器生產(chǎn)，轟擊束流45 μA，轟擊時(shí)間40 min，轟擊結(jié)束由氦氣作為載氣傳輸?shù)絋RACERLAB FXFN合成器靶水瓶內(nèi)。合成器示意如圖1所示。

(1)自動(dòng)化合成主要有以下步驟：①18F離子的柱分離純化及蒸餾干燥；②原料的18F離子親核取代反應(yīng)；③在線溶劑轉(zhuǎn)換；④產(chǎn)品經(jīng)高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)分離純化；⑤C18柱再次純化。

(2)合成器的具體步驟：①18F離子由18O(p，n)18F反應(yīng)制得，并經(jīng)過靶水線(FROM TARGET)傳送到靶水瓶，后由11號(hào)QMA固相萃取(由1 ml乙醇，2 ml水活化)分離柱捕獲；②18F離子(753±7.53)mCi(1 Ci=3.7×1010Bq)由1號(hào)瓶內(nèi)加入的15 mg K222溶于1 ml乙腈溶劑及1.5 mg的K2CO3溶于0.5 ml水的混合溶劑沖洗入V12號(hào)反應(yīng)瓶；③混合液在氮?dú)獯捣飨掠?5 ℃減壓蒸餾8 min，再于110 ℃氮?dú)獯捣? min；④加入V3號(hào)瓶內(nèi)的前體(1 mg溶于1.2 ml的DMSO溶劑)并加熱到130 ℃，V24關(guān)閉，反應(yīng)瓶加熱反應(yīng)10 min；⑤反應(yīng)瓶降溫到50 ℃，開V24，V25恢復(fù)大氣壓，然后加入V5號(hào)瓶內(nèi)的10 ml水；⑥反應(yīng)后混合液經(jīng)由V5和V6內(nèi)的1.5 ml的HPLC流動(dòng)相(28%乙醇水溶液，調(diào)整pH值至2.0)分別沖洗到V26閥門下收集瓶內(nèi)，打開V26在N2氣壓力下經(jīng)由Fluid進(jìn)入HPLC進(jìn)樣環(huán)，在Fluid控制下進(jìn)樣環(huán)旋轉(zhuǎn)，進(jìn)入HPLC半制備柱(X-Select HSS T3，250×10.00 mm，5 μl)，流動(dòng)相以5 ml/min的流速通過柱子分離。流動(dòng)相以紫外(UV，λ=254 nm)和放射計(jì)數(shù)器監(jiān)測。18F-T807的保留時(shí)間為21.5 min；⑦正常HPLC分離出產(chǎn)品即可滿足質(zhì)量要求，放射化學(xué)純度＞95%，也可以通過V18閥門將產(chǎn)品收集到V18閥門下圓底燒瓶，圓底燒瓶內(nèi)裝有2 ml 8.4%的K2CO3和20 ml無菌注射用水；經(jīng)16號(hào)位置的Oasis HLB SPE柱(以5 ml乙醇和10 ml水活化)純度將提高＞98%；⑧產(chǎn)物會(huì)掛在柱子上，然后V7號(hào)瓶內(nèi)預(yù)裝的10 ml水沖洗柱子，可以沖掉鹽、乙腈和氟離子；⑨SPE柱經(jīng)由V8號(hào)瓶內(nèi)的0.8 ml乙醇沖洗進(jìn)入產(chǎn)品羊角瓶，產(chǎn)品瓶內(nèi)裝有8 ml、0.9%生理鹽水，然后產(chǎn)品經(jīng)由V16和產(chǎn)品管線在N2氣壓力下經(jīng)過0.22 μm液體濾膜過濾進(jìn)入分裝室的收集瓶。

圖1 TRACERLAB FXFN合成器示意圖

圖2 18F-T807合成化學(xué)方程式示圖

產(chǎn)品分析質(zhì)量控制經(jīng)由分析HPLC與標(biāo)準(zhǔn)品分別及混合進(jìn)樣確認(rèn)產(chǎn)品。如果用于人體按相關(guān)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量控制。18F-T807合成化學(xué)方程式如圖2所示。

2 結(jié)果

2.1 合成結(jié)果

18F-T807合成用時(shí)63 min，使用普通原料產(chǎn)量37.7 mCi(1 Ci=3.7×1010Bq)，未校正產(chǎn)率5%，使用叔丁氧羰基(t-Butyloxy carbonyl，BOC)保護(hù)的原料產(chǎn)率會(huì)提高至15%。經(jīng)過SPE柱滯留在柱子上的大部分是未反應(yīng)的18F離子。

2.2 合成產(chǎn)物質(zhì)量控制檢測

對(duì)3批連續(xù)生產(chǎn)的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量控制。HPLC分析結(jié)果放射化學(xué)純度和化學(xué)純度合格。HPLC分析柱(Ultimate C-18，4.6×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相是50%甲醇/水[pH=2，鹽酸(HCl)調(diào)]流速1.3 ml/min，紫外檢測器(UV，λ=254 nm)，6 h后pH值為5.5，活度計(jì)測得半衰期為109.7 min，不包含長半衰期核素(＞5 d)，細(xì)菌內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)合格。氣相色譜結(jié)果顯示，殘留丙酮、乙腈、DMSO等溶劑都在檢測線下。各項(xiàng)結(jié)果表明產(chǎn)品符合人體使用標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

合成及分離產(chǎn)物時(shí)間從加速器轟擊結(jié)束開始共(63±5)min，放射化學(xué)產(chǎn)率經(jīng)過衰減校正后為(15±5)%(n=20)，化學(xué)純度＞95%，放射化學(xué)純度＞99%，產(chǎn)品的無菌及無熱原要求均符合規(guī)定。

反應(yīng)總產(chǎn)率較低(15%)，使用t-BOC保護(hù)后產(chǎn)率得到提高，推測原因是合成溫度較高(130 ℃)，原料N原子上的H還原性更高，易發(fā)生不良反應(yīng)，而使用t-BOC保護(hù)后活性降低，相應(yīng)不良反應(yīng)極大降低。

神經(jīng)顯像劑顯像效果受雜質(zhì)影響較大，故提高放射化學(xué)純度有實(shí)際意義，本研究通過V18閥門將產(chǎn)品收集到V18閥門下圓底燒瓶，圓底燒瓶內(nèi)裝有2 ml，8.4%的K2CO3和20 ml無菌注射用水；經(jīng)16號(hào)位置的Oasis HLB SPE柱(以5 ml乙醇和10 ml水活化)純度將提高＞98%。

在GE TRACERLAB FXFN合成器上使用一步法合成的18F-T807，由HPLC純化，使用SPE柱再次純化保證純化效果。合成后進(jìn)行各種質(zhì)量控制檢測均顯示符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。該合成方法簡便易行，適合醫(yī)院及各中心的Tau蛋白顯像劑的合成。