內(nèi)異止痛方對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠相關(guān)mRNA E-cadherin、mRNAβ-catenin的影響*

朱小琳，韓亞光，包 蕾，郭文海，張雪芝，王雪蓮，韓延華

（1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001；2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040）

子宮內(nèi)膜異位癥（EMs）簡稱“內(nèi)異癥”，是一種慢性、周期性、良性雌激素依賴性疾病，因其發(fā)病具有臨床隱匿性，形態(tài)多樣性、病變廣泛性、侵襲性和易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。新近研究報(bào)道[1]，育齡期婦女中80%的痛經(jīng)、50%的不孕癥可能與子宮內(nèi)膜異位癥有關(guān)，并且呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重影響女性的身心健康。黏附這一動(dòng)態(tài)過程是異位細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的第一步，也是內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的源起點(diǎn)[2]，而E－鈣黏蛋白（E－cadherin）、β－連環(huán)蛋白（β－catenin）主要介導(dǎo)上皮細(xì)胞間黏附，維持胞間穩(wěn)定性。因此探討有效方藥調(diào)控相關(guān)靶基因，是防治本病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

①孔底淤積厚度不大于10 cm；②含砂量不大于10%，黏度不大于30s；③密度不大于1.05 g/cm3。

2.2.2 Decomposition of vanillin to small carboxylic acids

1 主要實(shí)驗(yàn)方法

1.1 自體移植法構(gòu)建EMs大鼠模型 將大鼠麻醉后采用自體移植法在大鼠下腹正中、恥骨聯(lián)合上1cm處（或尿道口上端約1 cm處）做一長約2～3 cm的切口，逐層開腹進(jìn)入腹腔，于膀胱背側(cè)游離左側(cè)找到并暴露“Y”子宮，結(jié)扎子宮系膜血管以及需要切除的子宮上下端，切下左側(cè)子宮長約2 cm，行遠(yuǎn)端結(jié)扎，包埋術(shù)。取下后立即放入37℃生理鹽水培養(yǎng)皿中，剪去多余的脂肪組織，去除大部分子宮漿膜層及肌層組織，將子宮內(nèi)膜剪成大小約為5 mm×5 mm組織，內(nèi)膜面緊貼于雙側(cè)腹壁腹膜面，5－0腸線四角縫合于腹部兩側(cè)血管豐富處。

1.2 蘇木精－伊紅（HE）染色法鑒定模型 隨機(jī)抽取5只造模成功的EMs大鼠，取異位病灶組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下組織病理學(xué)觀察。

內(nèi)異止痛方藥物組成為：三棱10 g，莪術(shù)10 g，丹參20 g，鱉甲20 g，桃仁15 g，白芍20 g，連翹15 g，桂枝10 g，甘草10 g，當(dāng)歸15 g，五靈脂10 g，延胡索20 g，香附15 g組成。藥物劑型為中藥免煎顆粒，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診中藥局（江陰天江公司）。上述藥物加蒸餾水混勻后，密封，4℃保存待用。

2 實(shí)驗(yàn)藥物

1.3 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）檢測 本實(shí)驗(yàn)采用BIOER PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，使用iQTM5軟件分析PCR過程各檢測樣品的Ct值，各樣本做3個(gè)復(fù)孔，取其平均Ct值；同時(shí)檢測各樣本PCR反應(yīng)液的溶解曲線。采用2－△△CT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)相對定量分析。引物由primer permier 5．0軟件設(shè)計(jì)，由上海invitrogen公司合成，見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

達(dá)那唑膠囊，0．2 g×30粒，購自江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 異位病灶HE染色結(jié)果 HE染色鏡下可見EMs模型大鼠異位病灶上皮細(xì)胞多見空泡，胞核排列紊亂，間質(zhì)疏松，并可見新生血管，腺體結(jié)構(gòu)不完整，提示異位內(nèi)膜組織形成，正常的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞排列緊密，腺體結(jié)構(gòu)清晰，上皮完整，見圖1。

圖1 假手術(shù)組在位內(nèi)膜A與模型組異位內(nèi)膜B病理形態(tài)學(xué)比較（HE染色）Fig.1 Comparison of histopathologic morphology of endometrium in the sham operation A and model group B(HE staining)

E－cadherin和β－catenin是黏附分子復(fù)合體結(jié)構(gòu)中的重要組成部分，在介導(dǎo)細(xì)胞間黏附、維持血管通透性方面有著不可忽視的作用[3]。血瘀現(xiàn)代研究認(rèn)為血液運(yùn)行不暢，或積于脈內(nèi)，或溢于脈外，可見于各種疾病。胞宮藏瀉有度，則月經(jīng)周期而至，溢出脈外；若腎精不足、肝失疏泄、脾失健運(yùn)損傷沖任，胞宮藏瀉失常而致經(jīng)血不循常道形成“離經(jīng)之血”。反之，瘀血內(nèi)結(jié)，氣血運(yùn)行不暢，新血不得歸經(jīng)，進(jìn)一步加重瘀血形成，形成惡性循環(huán)。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者的血液大多處于濃稠黏聚狀態(tài)，流動(dòng)緩慢，與中醫(yī)血瘀證特點(diǎn)相似，進(jìn)一步證實(shí)了血瘀為子宮內(nèi)膜異位癥的核心病機(jī)[4]。

表2 各組E-cadherin、β-catenin基因轉(zhuǎn)錄水平（x±s）Tab.2 Level of E-cadherin andβ-catenin gene transcription of each group

表2 各組E-cadherin、β-catenin基因轉(zhuǎn)錄水平（x±s）Tab.2 Level of E-cadherin andβ-catenin gene transcription of each group

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．01；與中藥低劑量組比較，△P＜0．01。

組別 E－cadherin mRNA（2－△△CT） β－catenin（2－△△CT）模型組 0．699±0．086* 43．211±3．452*中藥低劑量組 12．421±0．921# 32．069±2．868#中藥高劑量組 22．496±2．413#△ 17．569±1．662#△陽性藥物組 33．277±3．244# 7．961±1．013#假手術(shù)組 1 1

4 討論

3.2 內(nèi)異止痛方對E－cadherin、β－catenin基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組E－cadherin轉(zhuǎn)錄水平顯著降低且β－catenin基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（P＜0．01）；與模型組相比，各治療組基因轉(zhuǎn)錄水平E－cadherin顯著升高、β－catenin顯著降低（P＜0．01）；陽性藥物組各基因轉(zhuǎn)錄水平優(yōu)于中藥治療組（P＜0．01）；中藥高劑量組各基因轉(zhuǎn)錄水平優(yōu)于低劑量組（P＜0．01），提示中藥治療組可有效升高異位病灶組織E－cadherin mRNA、降低β－catenin mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平，且中藥高劑量組優(yōu)于中藥低劑量組（P＜0．01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明內(nèi)異止痛方在改善異位病灶組織基因轉(zhuǎn)錄水平上療效顯著。見表2。

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

內(nèi)異止痛湯是導(dǎo)師韓延華教授臨床應(yīng)用近20年的治療子宮內(nèi)膜異位癥的經(jīng)驗(yàn)方，具有活血化瘀、緩急止痛之力，能夠改善子宮內(nèi)膜異位癥的臨床癥狀。方中三棱、莪術(shù)兩藥相和，即為三棱丸，最早見于《經(jīng)驗(yàn)良方》，共為君藥，三棱為血中之氣藥，莪術(shù)為氣中之血藥，“專走肝家，破積聚惡血”，兩藥合用散盡一切血瘀氣結(jié)。延胡索、香附、五靈脂、丹參4藥合用共為臣藥，具有疏肝行氣、活血止痛之功。鱉甲軟堅(jiān)散結(jié)而潛陽，桃仁活血祛瘀而生新，當(dāng)歸補(bǔ)肝體之陰，白芍養(yǎng)肝血平肝痛、桂枝配白芍，可溫通經(jīng)脈，緩急止痛，連翹取其清熱解毒散結(jié)之功效。使藥一味甘草，緩急止痛，調(diào)和諸藥。

此外，對于預(yù)防子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生，導(dǎo)師提出了幾點(diǎn)建議：1）合理性生活：防止經(jīng)血逆流，要做到“合之有道”，即不在經(jīng)期或經(jīng)期前后發(fā)生性生活、盡量減少或避免宮腔內(nèi)操作。2）調(diào)暢情志：女子為病，素性抑郁，病位在肝，故多以情志不遂為多，并認(rèn)為EMs疾病的預(yù)防，首先要做到調(diào)暢情志，正如古人所言：“一身血?dú)庵芰鳎瑹o有阻滯，則百病不生”。因此，在現(xiàn)代繁忙緊張的環(huán)境下，每個(gè)人都要保持寬廣的胸懷和無私的情操，并且還要不斷提高自身的文化修養(yǎng)，只有遵守這個(gè)原則，才能有利于保持心情愉悅。