麥門冬湯對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肺泡上皮細(xì)胞分化的影響*

劉 銳，雷寧寧，伍娟娟，葉傳冬，陳斯寧

（1．廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院老年病科，南寧 530011；2．廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530011）

肺纖維化（Pulmonary Fibrosis）是多種病因引起的一種慢性炎癥性間質(zhì)性肺疾病，幾乎是所有肺組織損傷及病變發(fā)展到末期的最終歸宿，目前主要以抗炎、免疫調(diào)節(jié)等治療方法為主，治療效果不顯著且存有局限性。因此，需從其發(fā)病機(jī)制入手，以發(fā)病機(jī)制為重點(diǎn)尋找有效的治療手段迫在眉睫。研究表明，肺內(nèi)上皮細(xì)胞與上皮干細(xì)胞衰竭可引起肺纖維化[1]，近期更有研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性肺纖維化可通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）發(fā)揮作用從而改變其病理結(jié)果，表現(xiàn)為延緩甚至逆轉(zhuǎn)肺纖維化的進(jìn)程[2－3]，這一發(fā)現(xiàn)為治療肺纖維化提供了一條可能的新途徑，并顯示出巨大的研究前景。

肺纖維化在臨床上的表現(xiàn)主要有進(jìn)行性加重的呼吸困難、氣短、喘息、刺激性干咳，中醫(yī)屬“肺痿”范疇。肺痿病名最早見于張仲景的《金匱要略》，麥門冬湯主治。本實(shí)驗(yàn)以張仲景治療肺痿經(jīng)方麥門冬湯為研究對象，觀察麥門冬湯含藥大鼠血清，對BMSC細(xì)胞肺表面活性蛋白C（SP－C）、水通道蛋白5（AQP－5）表達(dá)的影響，為麥門冬湯經(jīng)BMSCs途徑治療肺纖維化尋找確切依據(jù)，并為BMSCs植入治療肺纖維化尋找可靠的多環(huán)節(jié)調(diào)控中藥。

1 .實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的BMSC細(xì)胞株（GFP－BMSC）由杭州赫貝科技公司細(xì)胞庫提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 參照張仲景《金匱要略》麥門冬湯原方組成及劑量，麥門冬70 g，法半夏10 g，生曬參6 g，甘草6 g，大棗10 g。以上藥物以500 mL水煎煮去渣，濃縮至100 mL，約含生藥1．1 g/mL。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥劑室制備。

1.3 含藥血清制備

1.3.1 麥門冬湯含藥血清的制備 取雌性SD大鼠（體質(zhì)量200～220 g），并予麥門冬湯按每100 g體質(zhì)量1 mL藥液進(jìn)行灌胃（相當(dāng)于成人每日有效劑量），每日1次，連續(xù)5 d，然后取10%水合氯醛麻醉大鼠，75%乙醇浸泡身體10 min，在無菌條件下下腔靜脈取血，37℃靜置1 h，后1 500 r/min離心15 min，取上清液。

1.3.2 肺纖維化模型血清的制備 使用5%苯巴比妥鈉腹腔麻醉8周齡雌性大鼠。待大鼠失去知覺之后，使用無菌剪刀在其咽喉部剪開5 mm左右的切口。然后用無菌彎鑷撥開喉部肌肉，暴露氣管，用1 000μL微量注射器注入5 mg/kg博萊霉素溶液，輕輕搖晃，使藥物分布均勻，縫合切口，待大鼠蘇醒。造模24 h后取10%水合氯醛麻醉大鼠，75%乙醇浸泡身體10 min，在無菌條件下下腔靜脈取血，37℃靜置1 h，后1 500 r/min離心15 min，取上清液。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：Cyagen Company，貨號：RASMX－90011。胎牛血清：Cyagen Company，貨號：RASMX－05001－50。DMEM培養(yǎng)基：GIBCOCompany。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。SP－C（FL－197）抗體：SANTA CRUZ，貨號：sc－13979。

AQP5（H－200）抗體（SANTA CRUZ，貨號：sc－28628），兔兩步法檢測試劑盒（北京中杉，貨號：PV6001），高純總RNA快速提取試劑盒（Generay公司，貨號：GK3016；批次：1512G14），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRTreagent Kit（TaKaRa公司，貨號：RR037A；批次：AK5302－1），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑SuperReal PreMix Color（SYBR Green，TIANGEN公司，貨號：FP215－02；批次：O3911）。實(shí)驗(yàn)引物由上海桑尼生物科技有限公司合成純化。

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（3111型，Thermo公司），倒置顯微鏡（IX73型，Olympus公司），臺式低速離心機(jī)[80－2型，上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司]。細(xì)胞培養(yǎng)皿（Fisher Scientific公司），OD值測量儀器（高精度分光光度計(jì)）為Merinton SMA4000。定量PCR儀為CFX connect Real－Time PCRSystem，配套使用的分析軟件為BIO－RADCFX Manager。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) GFP－BMSC細(xì)胞株的培養(yǎng)條件：含10%FBS和1×青鏈霉素的Cyagen基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 鋪板 取處于對數(shù)期正常培養(yǎng)的GFP－BMSC細(xì)胞株，用0．25%Typsin消化，1 500 r/min離心5 min，計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)，鋪24孔板，4組細(xì)胞每孔均加入1×104個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中靜置24 h。

2.3 加藥 細(xì)胞貼壁24 h后，每孔加入500μL不同藥物的大鼠血清，分別作用14 d，藥物分組如下：

正常對照（DMEM）組：大鼠BMSCs培養(yǎng)液中加入等量的DMEM；麥門冬湯血清組：大鼠BMSCs培養(yǎng)液中加入5%麥門冬湯含藥血清；模型大鼠血清組：大鼠BMSCs培養(yǎng)液中加入5%肺纖維化模型大鼠血清（博來霉素組）；模型大鼠+麥門冬湯血清組：大鼠BMSCs培養(yǎng)液中加入5%肺纖維化模型血清及5%麥門冬湯含藥血清。

2.4 免疫組化檢測SP－C、AQP－5蛋白表達(dá) 免疫組化蛋白表達(dá)的陽性信號表達(dá)為細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色。用平均灰度值來表示信號的強(qiáng)弱，陽性反應(yīng)程度越高其灰度值越小，表達(dá)也越強(qiáng)。隨機(jī)選擇3個(gè)不同的視野（×200）來觀察每張免疫組化切片陽性細(xì)胞的形態(tài)和分布，然后進(jìn)行圖像的采集與分析，使用聯(lián)有三目光學(xué)顯微鏡的Optimas數(shù)字彩色圖像顯微系統(tǒng)進(jìn)行采集并分析各區(qū)域平均灰度值。

2.5 qPCR檢測SP－C、AQP－5 mRNA表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）分析軟件BIO－RAD CFX Manager對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行自動統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。使用正常對照組作為對照模板計(jì)算每個(gè)樣品的Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參基因，計(jì)算每個(gè)樣品的目的基因的相對表達(dá)量2－△△Ct。

△△Ct＝[待測組目的基因平均Ct值－待測組內(nèi)參基因平均Ct值]－[對照組目的基因平均Ct值－對照組內(nèi)參基因平均Ct值]。

引物序列如下：

Rat GAPDH Forward：

GGCAAGTTCAACGGCACAG

Rat GAPDH Reverse：

CGCCAGTAGACTCCACGACA

PCR產(chǎn)物大小為：142 bp

Rat AQP－5 Forward：

CTTCAAGGCGGTGTTCG

Rat AQP－5 Reverse：

GAGTAATGGCTGGATTGATGTG

PCR產(chǎn)物大小為：192 bp

Rat SP－CForward：GAGCCAGTTTCGCATTCCC

Rat SP－CReverse：CCCATGAGCAGAGCCCCTA

PCR產(chǎn)物大小為：108 bp

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA），方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用組間兩兩比較Dunnett’s T3法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 免疫組化檢測SP－C、AQP－5蛋白表達(dá)結(jié)果

3.1.1 SP－C蛋白 模型大鼠+麥門冬湯組、模型組SP－C蛋白表達(dá)，明顯高于正常對照組、麥門冬湯組（P＜0．01），其中模型大鼠+麥門冬湯組SP－C蛋白表達(dá)又明顯高于模型（P＜0．01）。見表1、圖1。

3.1.2 AQP5蛋白 模型大鼠+麥門冬湯組、模型組AQP5蛋白表達(dá)，明顯高于正常對照組、麥門冬湯組（P＜0．01），其中模型大鼠+麥門冬湯組AQP5蛋白表達(dá)又明顯高于模型（P＜0．01）。見表2、圖2。

表1 各組SP-C蛋白表達(dá)免疫組化染色圖像分析結(jié)果（Tab.1 Resultsof immunohistochemical staining of SP-C protein expression in each group

表1 各組SP-C蛋白表達(dá)免疫組化染色圖像分析結(jié)果（Tab.1 Resultsof immunohistochemical staining of SP-C protein expression in each group

注：與正常對照組比較，*P＜0．01；與麥門冬湯組比較，△P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．01。

動物數(shù)10 10 10 10組別正常對照組麥門冬湯血清組模型大鼠血清組模型大鼠+麥門冬湯血清組SP－C（MOD）218．3±25．10 209．0±33．14 167．7±15．92*△132．7±23．13*△#

表2 各組AQP5蛋白表達(dá)免疫組化染色圖像分析結(jié)果（Tab.2 Results of immunohistochemical staining of APQ5 protein expression in each group

表2 各組AQP5蛋白表達(dá)免疫組化染色圖像分析結(jié)果（Tab.2 Results of immunohistochemical staining of APQ5 protein expression in each group

注：與正常對照組比較，*P＜0．01；與麥門冬湯組比較，△P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．01。

動物數(shù)10 10 10 10組別正常對照組麥門冬湯血清組模型大鼠血清組模型大鼠+麥門冬湯血清組AQP－5（MOD）166．3±22．15 152．0±16．23 113．7±26．30*△85．7±18．42*△#

圖1 免疫組化檢測SP-C在各組的表達(dá)（×200）Fig.1 Expression of SP-C in each group by immunohistochemistry（×200）

圖2 免疫組化檢測AQP-5在各組的表達(dá)（×200）Fig.2 Expression of AQP-5 in each group by immunohistochemistry（×200）

3.2 qPCR檢測SP－C、AQP－5 mRNA表達(dá)結(jié)果

3.2.1 SP－CmRNA表達(dá)結(jié)果 設(shè)正常對照組的相對表達(dá)量為1。模型大鼠+麥門冬湯血清組的相對表達(dá)量最高4．46±0．36，模型大鼠血清組為2．39±0．21，麥門冬湯血清組為1．12±0．26。模型大鼠+麥門冬湯血清組、模型大鼠血清組SP－CmRNA表達(dá)，明顯高于正常對照組、麥門冬湯血清組（P＜0．01），其中模型大鼠+麥門冬湯組SP－CmRNA表達(dá)又明顯高于模型大鼠血清組（P＜0．01）。見表3。

3.2.2 AQP－5 mRNA表達(dá)結(jié)果 設(shè)DMEM組的相對表達(dá)量為1。模型大鼠+麥門冬湯血清組的相對表達(dá)量最高14．46±0．36，模型組的相對表達(dá)量最低1．39±0．21，麥門冬湯血清組為4．332±0．221。模型大鼠+麥門冬湯血清組、模型大鼠血清組AQP－5 mRNA表達(dá)，明顯高于正常對照組、麥門冬湯血清組（P＜0．01），其中模型大鼠+麥門冬湯組AQP－5 mRNA表達(dá)又明顯高于模型大鼠血清組（P＜0．01）。見表4。

表3 各組SP-C蛋白表達(dá)qPCR分析結(jié)果Tab.3 Result of qPCR of SP-C protein expression in each group（

表3 各組SP-C蛋白表達(dá)qPCR分析結(jié)果Tab.3 Result of qPCR of SP-C protein expression in each group（

注：與正常對照組比較，*P＜0．01；與麥門冬湯組比較，△P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．01。

動物數(shù)10 10 10 10組別正常對照組麥門冬湯血清組模型大鼠血清組模型大鼠+麥門冬湯血清組SP－C（MOD）1 1．12±0．26 2．39±0．21*△4．46±0．36*△#

4 討論

肺纖維化在多種炎癥性肺部疾病中常見，如肺炎、慢性阻塞性肺疾病、矽肺等，西醫(yī)多采用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素或細(xì)胞毒藥物進(jìn)行治療，雖有一定療效，但不良反應(yīng)較大[4]。一般認(rèn)為，肺纖維化可對應(yīng)中醫(yī)學(xué)中的“肺痿”和“肺痹”，其在臨床上的表現(xiàn)主要有進(jìn)行性加重的呼吸困難、氣短、喘息、刺激性干咳。中醫(yī)對肺纖維化的主要治法為益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)、養(yǎng)肺化痰和養(yǎng)肺清熱；多數(shù)學(xué)者認(rèn)同肺纖維化的中醫(yī)病機(jī)主要是虛、瘀及痰[5－6]。張仲景的《金匱要略》中設(shè)有專方治療肺痿，即麥門冬湯，其具有潤肺益胃，降逆下氣的功效；原文記載：“大（火）逆上氣，咽喉不利，止逆下氣者，麥門冬湯主之”。在治療肺痿常用方劑中，根據(jù)馬錦地[7]對文獻(xiàn)的分析整理發(fā)現(xiàn)麥門冬湯應(yīng)用頻率最高，運(yùn)用麥門冬湯治療肺纖維化治法則多體現(xiàn)為益氣養(yǎng)陰。臨床實(shí)踐證實(shí)麥門冬湯可以明顯改善肺纖維化癥狀，保護(hù)肺功能，提高患者生活質(zhì)量[8－9]。實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)麥門冬湯可以通過影響肺組織中腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、轉(zhuǎn)化生長因子－β1（TGF－β1）、血小板衍生因子（PDGF）、白介素（IL）－10等因子的表達(dá)，減輕博來霉素所致的大鼠肺纖維化[10－15]。

表4 各組AQP-5蛋白表達(dá)qPCR分析結(jié)果Tab.4 Result of qPCR of APQ-5 protein expression in each group

表4 各組AQP-5蛋白表達(dá)qPCR分析結(jié)果Tab.4 Result of qPCR of APQ-5 protein expression in each group

注：與正常對照組比較，*P＜0．01；與麥門冬湯組比較，△P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．01。

動物數(shù)10 10 10 10組別正常對照組麥門冬湯血清組模型大鼠血清組模型大鼠+麥門冬湯血清組AQP－5（MOD）1 1．02±0．23 3．07±0．30*△5．22±0．75*△#

麥門冬湯以人參、麥門冬、半夏為主藥，近年來研究發(fā)現(xiàn)人參中的多種成分具有促進(jìn)BMSCs增殖[16]，干預(yù)BMSCs轉(zhuǎn)化為多潛能干細(xì)胞[17]，誘導(dǎo)向BMSCs向心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞分化的作用[18－19]。并且BMSCs具有自我更新和可多向分化的能力，在損傷的神經(jīng)組織微環(huán)境中可以向神經(jīng)細(xì)胞分化[20]，或者分泌成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、神經(jīng)生長因子（NGF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子[21－22]來促進(jìn)軸突生長和髓鞘形成[23]。BMSCs可以感知損傷信號并遷移到受損區(qū)域。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，可以避免同種異體移植時(shí)的免疫排斥[24]。人參皂苷對低氧－無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的BMSCs的凋亡有一定的保護(hù)作用，即能抑制其凋亡[25]。半夏也被證實(shí)具有促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖，并向心肌細(xì)胞分化的作用[26]。為此，筆者推測麥門冬湯可能通過促進(jìn)BMSCs向肺泡上皮細(xì)胞的分化，而達(dá)到療肺纖維化的作用。

干細(xì)胞移植后的治療療效與移植后的細(xì)胞存活數(shù)量多少有著密切的關(guān)系。在大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥的預(yù)處理及其含藥血清對干細(xì)胞增殖預(yù)處理具有促進(jìn)作用，可以提高細(xì)胞移植后的存活數(shù)量，提高治療療效。張文信等[27]研究發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸復(fù)方含藥血清通過轉(zhuǎn)化BMSCs的細(xì)胞有絲分裂間期，而抑制BMSCs的凋亡，并通過提高新西蘭兔BMSCs的活性，從而促進(jìn)其BMSCs的增殖。詹菲等[28]發(fā)現(xiàn)作為補(bǔ)腎益精的代表方—左歸丸對衰老的大鼠BMSCs的凋亡有協(xié)同抑制作用，在相關(guān)方面上證實(shí)了后天之“精”相關(guān)中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究與BMSCs的聯(lián)系，驗(yàn)證了BMSCs衰老以及人類衰老的根本所在是“腎精虧虛”。

肺表面活性蛋白C（SP－C）是成熟的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞合成和分泌的最具特征性的蛋白，AQP－5是Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物。在本研究中，麥門冬湯組+模型組SP－C、AQP－5蛋白表達(dá)顯著高于模型組、正常對照組，說明其具有促進(jìn)BMSC往肺泡上皮細(xì)胞分化的作用。該作用可能是麥門冬方有效改善肺纖維化的作用機(jī)制之一。同時(shí)，筆者也注意到肺纖維化模型組SP－C、AQP－5蛋白表達(dá)也明顯高于正常對照組，據(jù)此筆者推測肺纖維化模型大鼠血清中可能含有某些物質(zhì)，能夠改變BMSC細(xì)胞微環(huán)境，并促使其往肺泡上皮細(xì)胞分化。但具體是何種物質(zhì)改變了細(xì)胞微環(huán)境，值得進(jìn)一步研究。