侗藥血馬鞭水提物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的急性非感染咽喉炎大鼠的保護(hù)作用研究*

譚艷輝，張 宇，龍 娟，李 輝，劉文杰，劉志華，吳衛(wèi)華，劉建新

（1．湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，懷化 418000；2．侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，懷化 418000）

咽喉炎是一種炎癥免疫性疾病，曾被認(rèn)為是教師的職業(yè)病。由于空氣污染、氣候環(huán)境等多方面因素的影響，咽喉炎的發(fā)病率現(xiàn)已高達(dá)30%～50%，成為臨床上的一種常見(jiàn)病和多發(fā)病，且仍有上升趨勢(shì)[1－2]。咽喉炎的病因復(fù)雜、病程較長(zhǎng)、且較難徹底治愈嚴(yán)重影響了人們的日常工作和生活[3]。病理研究發(fā)現(xiàn)，咽喉炎的主要病理表現(xiàn)為黏膜充血，淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎癥性細(xì)胞的浸潤(rùn)[4]。目前臨床上用于治療咽喉炎的藥物比較欠缺且不能完全治愈，停藥后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)[5]?？咕幬锉粡V泛地用于治療感染性的咽喉炎，但針對(duì)非感染性的咽喉炎，抗菌藥物則不能發(fā)揮其作用[6]。糖皮質(zhì)激素類藥物也被用于治療非感染性咽喉炎，但長(zhǎng)期使用則容易出現(xiàn)很多全身性的不良反應(yīng)[7]。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)針對(duì)非感染性咽喉炎新的安全有效的治療藥物是當(dāng)前急需解決的難題。

侗藥血馬鞭即廣東紫珠（Callicarpa kwangtungensis Chun）是馬鞭草科紫珠屬植物，收載入《中華人民共和國(guó)藥典》2015版[8]，主要產(chǎn)于中國(guó)湖南、湖北、江西、廣西等省。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，藥材中主要含有黃酮、苯丙素糖苷、三萜、酚酸等化學(xué)成分[9]。據(jù)民間用藥記錄，侗藥血馬鞭的根、莖、葉、花、籽均可入藥，有清熱解毒、涼血止血、消炎生肌、抗腫瘤等諸多功效。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，侗藥血馬鞭具有抗炎（總黃酮）、抑菌（乙醇提取物、揮發(fā)油）、鎮(zhèn)痛（總黃酮）、止血（乙醇提取物）等作用[10]，提示侗藥血馬鞭在炎癥免疫性疾病中具有很好和廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 侗藥血馬鞭水提取物浸膏由湖南懷化正好制藥有限公司提供。制備工藝：取1倍份血馬鞭藥草莖葉切段（2～3 cm），加入8倍份水，加熱至100℃煮沸后，文火保持煮沸狀態(tài)2 h過(guò)濾保留濾液。濾渣加入3倍份水重復(fù)上述步驟，取第2次過(guò)濾濾渣加入2倍份水重復(fù)提取過(guò)濾。將3次過(guò)濾的濾液合并，100℃加熱濃縮至約1倍份容量，冷卻后置于4℃降低溫度，隨后置于低溫真空凍干儀中過(guò)夜凍干成干燥棕色粉末浸膏；地塞米松，片劑，安徽金太陽(yáng)生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)為1605102。

1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016－0002。

1.3 試劑 伊文思藍(lán)（EB），規(guī)格每瓶1 g，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；吡啶，規(guī)格每瓶500 mL，購(gòu)自天津市化學(xué)試劑六廠三分廠；戊巴比妥鈉，規(guī)格每瓶100 g，購(gòu)自美國(guó)GENEWIZ公司；甲酰胺，規(guī)格每瓶500mL，購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 儀器 UV－4802紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；AUY120分析天平，Shimadzu（島津）制作所；RM2235病理切片機(jī)，Leica（萊卡）微系統(tǒng)有限公司；Axio Scope A1顯微鏡，ZEISS（蔡司）公司；Histostar包埋機(jī)，Thermo Shandon Limited（賽默飛世爾科技）有限公司。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物分組、給藥及造模 將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組（灌胃生理鹽水，咽部擦拭生理鹽水）、模型對(duì)照組（灌胃生理鹽水；咽部擦拭10%吡啶）、吡啶+侗藥血馬鞭灌胃組（灌胃低、高劑量500、1000mg/kg，咽部擦拭10%吡啶）、吡啶+地塞米松組（灌胃地塞米松4 mg/kg，咽部擦拭10%吡啶）。大鼠預(yù)處理給藥連續(xù)5 d，每天早晚各1次。最后1次給藥1 h后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（劑量60 mg/kg，濃度2%）麻醉。約5 min后，大鼠尾靜脈注射EB（劑量30 mg/kg，濃度5 mg/mL）。10 min后，用止血鉗和鑷子打開(kāi)大鼠口腔，將大鼠舌往外稍提出并拉往一邊，采用棉簽吸取130μL 10%吡啶溶液，并將其深入大鼠咽部直到感受到阻力，再稍微往回拉，停留轉(zhuǎn)動(dòng)5 s，連續(xù)3次。造模1 h后，處死大鼠，拍照并取材。

1.5.2 EB－甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取0．052 5 g EB固體粉末溶于7 mL甲酰胺溶劑中，渦旋混勻，取1 mL用等體積稀釋法將其再依次稀釋4個(gè)濃度梯度（5個(gè)濃度分別為7．5、3．25、1．812 5、0．906 25、0．453 125μg/mL），紫外可見(jiàn)分光光度法（620 nm）分別測(cè)定5個(gè)不同濃度的EB－甲酰胺溶液的吸光度，并根據(jù)吸光度值和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 咽部組織中EB滲透含量測(cè)定 取各組大鼠咽部組織，并稱質(zhì)量。加入3．5 mL甲酰胺溶劑，55℃溫育24 h，然后測(cè)量每個(gè)樣品在620 nm處的吸光度值，根據(jù)EB－甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)樣本的EB量。

1.5.4 咽部組織病理檢測(cè) 每組隨機(jī)取3只大鼠不行EB注射，使其咽部組織不被染料滲透，其余實(shí)驗(yàn)步驟同前。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后獲取大鼠咽部組織，用生理鹽水將其洗凈并吸干表面水分后置于4%甲醛溶液固定3 d，然后將組織采用乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸入軟蠟除去二甲苯，隨后進(jìn)行包埋、切片。采用蘇木精－伊紅（HE）染色法染色，封片后鏡下觀察組織形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad Prism 5．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 侗藥血馬鞭水提物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的大鼠咽部組織形態(tài)損傷的影響Fig.1 Effect of the water extract of Callicarpa kwangtungensis Chun on pyridine-induced morphological damage of rat

2 結(jié)果

2.1 侗藥血馬鞭水提取物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的急性咽喉炎大鼠咽喉部炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用 見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組大鼠咽喉組織部位藍(lán)色較淺，提示EB滲出較少、咽喉組織部位未有明顯的炎癥反應(yīng)。10%吡啶溶液涂抹大鼠咽喉部位造模后，模型對(duì)照組大鼠的咽喉組織部位藍(lán)色明顯加深，提示EB大量滲出、咽喉組織存在明顯的炎癥反應(yīng)。陽(yáng)性藥物地塞米松干預(yù)組大鼠咽喉組織部位藍(lán)色深度明顯弱于模型對(duì)照組大鼠，提示地塞米松可抑制吡啶所誘導(dǎo)的咽喉部組織炎癥反應(yīng)。與地塞米松組大鼠相似，侗藥血馬鞭水提取物高、低劑量組大鼠咽喉組織部藍(lán)色也明顯弱于模型對(duì)照組大鼠，且呈劑量依賴，提示侗藥血馬鞭水提取物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的大鼠咽喉炎具有很好的保護(hù)作用。

2.2 侗藥血馬鞭水提取物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的急性咽喉炎大鼠咽喉組織EB滲出的影響 以所測(cè)不同濃度EB－甲酰胺溶液的吸光度值為縱坐標(biāo)，EB濃度為橫坐標(biāo)作圖得到EB－甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2?；貧w方程為＝0．052 8X+0．001 4，該標(biāo)曲線性關(guān)系較好，R2＝0．999 8。見(jiàn)表1，與正常對(duì)照組相比，吡啶誘導(dǎo)咽喉炎模型對(duì)照組大鼠咽部組織EB滲透量顯著升高（P＜0．01）。與模型對(duì)照組大鼠比較，地塞米松組、1 000 mg/kg侗藥血馬鞭水提取物高劑量組大鼠咽喉組織EB滲透量明顯減少（P＜0．01或P＜0．05），侗藥血馬鞭水提取物低劑量組大鼠咽喉組織EB滲出也有一定程度的下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

圖2 伊文思藍(lán)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curvefor Evansblue

表1 侗藥血馬鞭水提物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的大鼠咽部組織EB滲出的影響Tab.1 Effect of thewater extract of Callicarpa kwangtungensis Chun on Evans Blueextraction in pyridineinduced rat

表1 侗藥血馬鞭水提物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的大鼠咽部組織EB滲出的影響Tab.1 Effect of thewater extract of Callicarpa kwangtungensis Chun on Evans Blueextraction in pyridineinduced rat

注：與正常對(duì)照組比較，##P＜0．01，與模型對(duì)照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01。

（mg/kg） 動(dòng)物數(shù) EB滲出量（μg/g組織）正常對(duì)照組 — 5 0．32±0．07模型對(duì)照組 — 5 0．66±0．20##地塞米松組 4 6 0．33±0．07**血馬鞭水提物高劑量組 1 000 5 0．42±0．06*血馬鞭水提物低劑量組 500 6 0．52±0．11組別 劑量

2.3 侗藥血馬鞭水提取物對(duì)大鼠體質(zhì)量和各臟器的影響 大鼠的體質(zhì)量分別于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天稱質(zhì)量獲得。見(jiàn)表2，除地塞米松組大鼠外，其余各組大鼠的體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中基本保持在穩(wěn)定的水平，未出現(xiàn)明顯的下降。但陽(yáng)性藥物地塞米松組大鼠自實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，大鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)逐漸的下降，到實(shí)驗(yàn)最后一次稱質(zhì)量時(shí)組內(nèi)大鼠體質(zhì)量平均下降約50 g。

大鼠處死后，各臟器包括心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟被分離和稱質(zhì)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組大鼠比較，地塞米松組大鼠肝臟質(zhì)量明顯增加（P＜0．05）而脾臟質(zhì)量則顯著的低于正常組大鼠（P＜0．01），見(jiàn)表3。而其余各組大鼠各臟器質(zhì)量與正常組無(wú)顯著差異。結(jié)果提示，侗藥血馬鞭水提物的治療安全性優(yōu)于地塞米松。

2.4 侗藥血馬鞭水提取物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的急性咽喉炎大鼠咽部組織病理?yè)p傷的影響 大鼠造模完成后，獲取各組大鼠咽喉組織進(jìn)行病理檢測(cè)，見(jiàn)圖3。正常對(duì)照組大鼠咽喉組織黏液腺細(xì)胞排列緊湊、且未觀察到明顯的炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)；而模型對(duì)照組大鼠的咽喉組織中則表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞大量的浸潤(rùn)、黏液腺細(xì)胞排列分散不規(guī)則且部分肥大破裂，并伴隨出血；地塞米松和侗藥血馬鞭水提物高劑量組大鼠咽喉組織僅出現(xiàn)輕微出血、鏡下觀察不到較大的出血點(diǎn)，細(xì)胞排列相比模型對(duì)照組大鼠有相當(dāng)大的改善，僅出現(xiàn)個(gè)別的黏液腺細(xì)胞肥大的狀況；侗藥血馬鞭水提物低劑量組大鼠咽喉組織情況僅比模型組稍有改善，但仍有黏液腺細(xì)胞破裂肥大、中性粒細(xì)胞增多的表現(xiàn)。提示侗藥血馬鞭水提取物和陽(yáng)性藥物地塞米松對(duì)吡啶所誘導(dǎo)的急性咽喉炎大鼠咽喉組織損傷有較好的保護(hù)作用。

3 討論

本研究初步證明了侗藥血馬鞭水提取物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的急性非感染性咽喉炎大鼠模型具有較好的保護(hù)作用。

目前，實(shí)驗(yàn)性咽喉炎動(dòng)物模型的種類不多，其中以氨水直接噴霧大鼠咽喉組織來(lái)復(fù)制的急性咽喉炎大鼠模型較為經(jīng)典[11]，但死亡率過(guò)高，因此使用非常受限。本實(shí)驗(yàn)采用10%的吡啶溶液來(lái)建立大鼠急性咽喉炎模型來(lái)評(píng)估侗藥血馬鞭水提取物的抗咽喉炎作用。該模型于2014年被G．L．Viswanatha等[12]報(bào)道，相比氨水急性咽喉炎模型，具有低死亡率、高成功率等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該模型建立簡(jiǎn)單，且容易控制，造模成功率高。但本模型的建立與G．L．Viswanatha課題組所建立的動(dòng)物模型還存在有一些差異，比如采用尾靜脈注射EB溶液，而他們則需要建立靜脈給藥通道，因此本實(shí)驗(yàn)的操作大大的縮短了模型建立的時(shí)間和減少了對(duì)動(dòng)物的損傷，更有利于藥物的治療評(píng)價(jià)。

圖3 侗藥血馬鞭水提物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的大鼠咽部組織病理?yè)p傷的保護(hù)作用（×400）Fig.3 Protective effect of the water extract of Callicarpa kwangtungensis Chun on against pyridine-induced histological changesin rat(×400)

表2 侗藥血馬鞭水提物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的大鼠體質(zhì)量的影響Tab.2 Effect of thewater extract of Callicarpa kwangtungensis Chun on weight of ratsin pyridine-induced rat（x±s）

表2 侗藥血馬鞭水提物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的大鼠體質(zhì)量的影響Tab.2 Effect of thewater extract of Callicarpa kwangtungensis Chun on weight of ratsin pyridine-induced rat（x±s）

組別 劑量（mg/kg） 動(dòng)物數(shù) 體質(zhì)量（g）第1天 第2天 第3天 第4天 第5天正常對(duì)照組 — 5 249．6±12．1 245．4±9．1 240．6±8．2 241．2±8．2 230．6±13．8模型對(duì)照組 — 5 253．2±6．9 248．1±6．5 240．3±6．0 237．0±4．9 235．7±6．1地塞米松組 4 6 230．9±9．5 228．8±9．5 218．5±14．4 201．1±15．7 182．6±14．9血馬鞭水提物高劑量組 1 000 5 243．4±8．8 234．5±12．4 232．4±12．6 232．4±14．6 223．6±15．5血馬鞭水提物低劑量組 500 6 232．0±13．0 226．7±12．6 224．2±14．2 227．0±13．1 215．0±15．8

表3 侗藥血馬鞭水提物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的大鼠各臟器質(zhì)量的影響Tab.3 Effect of the water extract of Callicarpa kwangtungensis Chun on weight of rat different organsin pyridine-induced rat

表3 侗藥血馬鞭水提物對(duì)吡啶誘導(dǎo)的大鼠各臟器質(zhì)量的影響Tab.3 Effect of the water extract of Callicarpa kwangtungensis Chun on weight of rat different organsin pyridine-induced rat

注：與正常對(duì)照組比較#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 劑量（mg/kg） 動(dòng)物數(shù) 心臟（g） 肝臟（g） 脾臟（g） 兩肺（g） 雙腎（g）正常對(duì)照組 — 5 0．82±0．08 8．77±1．75 0．44±0．17 1．17±0．22 2．16±0．22模型對(duì)照組 — 5 0．90±0．18 10．73±1．37 0．48±0．07 1．27±0．32 2．06±0．77地塞米松組 4 6 0．81±0．10 11．55±1．70# 0．16±0．03## 0．99±0．21 2．16±0．15血馬鞭水提物高劑量組 1 000 5 0．75±0．16 8．81±1．66 0．46±0．16 1．51±0．16 1．84±0．56血馬鞭水提物低劑量組 500 6 0．79±0．07 6．77±1．25 0．52±0．04 0．93±0．38 1．98±0．54

咽喉組織EB滲出量的增加是吡啶誘導(dǎo)建立大鼠咽喉炎模型成功與否的判斷指標(biāo)之一，也是藥物干預(yù)治療作用的主要藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組大鼠咽喉組織EB滲出較正常對(duì)照組大鼠明顯增加，EB滲出檢測(cè)分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明模型復(fù)制成功。侗藥血馬鞭水提取物干預(yù)組大鼠EB滲出較模型組比較有明顯的減少，其中高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，侗藥血馬鞭水提物對(duì)非感染性咽喉炎具有很好的保護(hù)作用。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)侗藥血馬鞭水提物的抗咽喉炎作用和闡明其抗咽喉炎作用是否與減輕咽喉組織局部炎癥反應(yīng)的相關(guān)性，研究中對(duì)各組大鼠咽喉組織進(jìn)行病理檢測(cè)分析。與正常對(duì)照組大鼠相比，模型對(duì)照組的大鼠咽喉組織受損嚴(yán)重，咽喉組織中可觀察到明顯的出血點(diǎn)和大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，這些病理的改變與前期同類模型的報(bào)道一致[14]，進(jìn)一步表明模型建立成功。而采用侗藥血馬鞭藥物干預(yù)組的大鼠咽喉組織病理?yè)p傷明顯減輕、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著降低。這些結(jié)果提示，侗藥血馬鞭水提取物減輕咽喉炎病理?yè)p傷主要與其減少炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性藥物地塞米松組大鼠咽喉組織EB的滲出幾乎和正常對(duì)照組大鼠相當(dāng)，表明地塞米松具有強(qiáng)大的抗急性咽喉喉炎作用。而對(duì)大鼠體質(zhì)量變化分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中地塞米松組大鼠的體質(zhì)量持續(xù)下降，到最后一次給藥，體質(zhì)量較其它組大鼠下降非常明顯。對(duì)各組大鼠各主要臟器質(zhì)量稱質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，地塞米松組大鼠肝臟質(zhì)量明顯增加，而脾臟的質(zhì)量則顯著下降。事實(shí)上，地塞米松經(jīng)常作為抗炎和免疫抑制藥被廣泛的應(yīng)用于臨床，但長(zhǎng)期應(yīng)用所給患者帶來(lái)的不良反應(yīng)也是令臨床醫(yī)生非常所擔(dān)心的問(wèn)題[15]。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)中的試驗(yàn)藥物侗藥血馬鞭水提取物組大鼠并未發(fā)現(xiàn)地塞米松組大鼠所出現(xiàn)的不良反應(yīng)，初步表明侗藥血馬鞭水提取物在用于治療炎癥免疫性疾病中的安全性要明顯優(yōu)于地塞米松。