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    應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)

    2019-03-06 14:50陳天剛胡永芳
    健康大視野 2019年2期
    關(guān)鍵詞:流式細(xì)胞術(shù)結(jié)核分枝桿菌

    陳天剛 胡永芳

    【摘要】目的:建立流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)的方法。方法:利用結(jié)核分枝桿菌水解HDA的特點(diǎn),選取HDA作為帶有熒光的材料。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測20株結(jié)核分枝桿菌對RFP,INH,SM和EMB的敏感性。MI值由不同濃度藥物影響細(xì)菌后培養(yǎng)物檢測到的平均熒光強(qiáng)度與陽性對照的比值來推斷[1]:20株結(jié)核分枝桿菌的流式細(xì)胞儀藥敏試驗(yàn)結(jié)果與比例法基本一致。結(jié)論:建立流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌藥敏具有快速、準(zhǔn)確、簡便等優(yōu)點(diǎn),可用于臨床結(jié)核分枝桿菌藥敏的檢測。

    【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌;微生物敏感性試驗(yàn);流式細(xì)胞術(shù)

    【中圖分類號】R378.911【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號】1005-0019(2019)02-056-01

    結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。近年來,世界上結(jié)核病的發(fā)病率明顯增加,中國也不例外。在結(jié)核病控制過程中,結(jié)核分枝桿菌的耐藥性,尤其是耐多藥結(jié)核分枝桿菌的耐藥性,已成為結(jié)核病預(yù)防工作的嚴(yán)重障礙。耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MDR-TB)與非標(biāo)準(zhǔn)臨床治療密切相關(guān),需要快速、靈敏的藥物檢測方法。建立結(jié)核分枝桿菌快速藥敏試驗(yàn)是有效控制結(jié)核病的重要方法。目前,比例法已廣泛應(yīng)用于國內(nèi)各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)。這種方法在分離菌株后獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果需要四周的時(shí)間。在二十世紀(jì)八十年代建立的BACTECTB 460分枝桿菌檢測系統(tǒng)基礎(chǔ)上開發(fā)的BACIECMG TI960可縮短獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果的時(shí)間到5-8天,但存在要求特殊儀器、試劑比較昂貴、有一定的污染率等缺點(diǎn)。近年來,隨著流式細(xì)胞儀器在醫(yī)院中的普及,流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)菌藥敏試驗(yàn)中的應(yīng)用得到了很大的發(fā)展。細(xì)菌與熒光染料的結(jié)合程度可判斷細(xì)菌的活性。快速藥物敏感性試驗(yàn)具有重要意義。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)已取得一定進(jìn)展。然而,中國卻沒有媒體報(bào)道這一點(diǎn)[2]我們對此進(jìn)行了研究。研究過程和結(jié)果如下:

    1材料

    1.1 菌株 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株,以及于2018年1月至2018年2月在重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室采集到的臨床分離株,鑒定出20株結(jié)核分枝桿菌,其中10株為耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MDR-TB)。

    1.2試劑? 利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇、乙酰乙酸熒光素和IMSQ均購自Signa,7H9液體培養(yǎng)基購自美國BD公司。FDA溶于DMSO,配置為1g/L的溶液,儲存在-20C。

    1.3儀器? 流式細(xì)胞儀為BD FACSCalibur型號,是美國BD公司制造的。

    2方法

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的藥敏試驗(yàn)? 在羅氏培養(yǎng)基上挑取H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落,在含有玻璃珠的無菌瓶中磨成干酪樣品。用生理鹽水制備1g/L菌懸液。將1 g/L菌懸浮液稀釋至10-2 g/L細(xì)菌提取物Q1MI,接種到含有不同濃度藥物的7H9液體培養(yǎng)基中。INH的最終濃度為1.25、2.5、5、10、20mg/L,RFP為1.25、2.5、5、10、20mg/L,SM為2、4、8、16、32mg/L,EMB為0.625、1.25、2.5、5、10mg/L,7 H9培養(yǎng)基為空白對照。然后將8%多聚甲醛添加到FDA37℃培養(yǎng)30min,用流式細(xì)胞術(shù)來確定最終和平均熒光強(qiáng)度。

    2.2臨床菌株的藥敏試驗(yàn)? 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)菌株藥敏試驗(yàn),篩選出檢測臨床菌株的最佳實(shí)驗(yàn)方案。將20株臨床分離的結(jié)核分枝桿菌接種于含不同藥物濃度的7H9液體培養(yǎng)基中,最終INH濃度為2.5、5、10mg/L,RFP為5、10、20mg/L,SM為8、16、32mg/L,EMB為1.25、2.5、5 mg/L,在37℃培養(yǎng)72h,分別加入終濃度為250Lg/L的FDA 37℃孵育30min, 加入8%多聚甲醛處理40min,用流式細(xì)胞儀測定細(xì)菌的平均熒光強(qiáng)度。

    2.3流式細(xì)胞儀檢測? 首先,利用熒光微球?qū)x器的光路和液體流動系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)定,確保儀器各項(xiàng)指標(biāo)均在允許范圍內(nèi),并將前角(FSC)和側(cè)角(SSC)的信號值設(shè)定為對數(shù)a。美化。根據(jù)FSC/SSC的信號調(diào)節(jié)電壓,以發(fā)現(xiàn)最集中的細(xì)菌。通過直方圖計(jì)算FDA在FL通道上的平均熒光強(qiáng)度(MF I),最低抑菌濃度(MIC)。通過比較藥物管與不含藥物的陽性對照管的MF的60%或更多來確定。

    2.4比例法檢測結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗(yàn)? 參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》91操作。

    2.5統(tǒng)計(jì)分析? 使用? SPS91.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,配對資料采用X2檢驗(yàn),RQ05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3結(jié)果

    流式細(xì)胞術(shù)檢測不同時(shí)間的對照結(jié)果,可以看出培養(yǎng)時(shí)間為72個小時(shí)最為適宜,在流式細(xì)胞術(shù)檢測臨床株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果與絕對濃度法結(jié)果比較上,我們可以發(fā)現(xiàn)通過這兩種方法檢測的結(jié)果沒有差別。

    4討論

    FDA是一種無極性、無熒光酯,本身不發(fā)熒光,滲入活細(xì)胞后,可被胞質(zhì)中的酯酶迅速水解釋放出熒光素,在488mm的藍(lán)光激發(fā)下,發(fā)射出黃綠色的熒光,可經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。? 利用FDA的特點(diǎn),使之與結(jié)核分枝桿菌作用,該物質(zhì)能穿透活的分枝桿菌細(xì)胞壁并能被胞質(zhì)中的非特異性酯酶迅速水解為游離的熒光素,而死菌和被抗結(jié)核藥物抑制的細(xì)菌因缺乏活性酯酶而不能有效地水解FDA游離熒光素產(chǎn)生會相應(yīng)減少,通過流式細(xì)胞儀檢測帶熒光的分枝桿菌的熒光強(qiáng)度的變化來推斷MIC獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果[3]首先建立了結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37R的流式藥敏試驗(yàn)方法,藥物和細(xì)菌作用后我們可以得到結(jié)果,結(jié)果和狀態(tài)或與樣品的處理有關(guān)。在試驗(yàn)過程中為防止實(shí)驗(yàn)室污染,保證操作者的安全,上樣前對樣品用8%的多聚甲醛處理,使結(jié)核桿菌失活,但發(fā)現(xiàn)甲醛的處理后會使部分試驗(yàn)管的熒光強(qiáng)度有所降低,在一定程度上影響了試驗(yàn)結(jié)果,這一問題還有待解決。

    5結(jié)語

    結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞學(xué)敏感性試驗(yàn)簡便、快速、靈敏、重復(fù)性好。如果它被發(fā)展成一套成熟的方法,它可以作為一個常規(guī)的臨床試驗(yàn)來執(zhí)行。因此,結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的快速檢測,從28天到2-3天,一方面有利于結(jié)核病的治療,另一方面也能及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐多藥結(jié)核患者,減少結(jié)核患者的傳播。

    參考文獻(xiàn)

    [1]李慶炎.翟志敏.流式細(xì)胞術(shù)用于念珠菌快速藥敏試驗(yàn)的研究[J]中國臨床保健雜志201 10(2) 1227-1229.

    [2]馬筱玲,李志敏.流式細(xì)胞術(shù)檢測抗生素最低抑菌濃度[J]中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2016(4)3639-3645.

    [3]夏曉華,泉.流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于金黃色葡萄球菌體外藥敏試驗(yàn)的初步研究[J]中國人獸共患病雜志,20164)5053-5058.

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