紫鉚花素對黑色素瘤細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)體系中黑色素合成的影響*

高莉，霍仕霞，譚雪，彭曉明，閆明

(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學重點實驗室，烏魯木齊 830049)

驅蟲斑鳩菊(VernoniaanthelminticaWilld.)是維吾爾醫(yī)治療白癜風方劑中最常采用的藥材，維吾爾醫(yī)認為驅蟲斑鳩菊可以通過清除患者體內過盛黏液質，促進色素沉著，恢復皮膚顏色，從而治療白癜風[1]。有研究表明[2-4]，紫鉚花素是驅蟲斑鳩菊的主要有效成分之一，對體外培養(yǎng)的黑色素瘤細胞的黑色素合成和黑色素合成相關的酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)活性有調節(jié)作用，提示其可能對白癜風等色素性疾病具有一定應用開發(fā)前景。然而，人體內黑色素合成是一個極為復雜的過程，它由黑色素細胞內合成，通過黑色素細胞樹枝狀突起被傳遞到鄰近角質形成細胞內，并隨角質形成細胞向表皮上層移動，從而影響皮膚顏色[5-6]。因此，筆者在文獻[4]基礎上，采用A375細胞和Hacat細胞共培養(yǎng)體系進一步考察紫鉚花素對黑色素合成功能的作用，以期深入研究紫鉚花素治療白癜風的機制。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 人黑色素瘤細胞A375，中國科學院上海細胞庫提供；人永生化角質形成細胞HaCaT，武漢大學細胞庫提供。

1.2藥品與試劑 紫鉚花素(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所自制，批號：20151208，含量≥95%)；Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-High glucose(DMEM)干粉培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：1645780)；胎牛血清(美國HycLone公司，批號：NZJ1221)；噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT，美國Amresco公司，批號：YY11351)；左旋多巴(L-DOPA，美國Sigma公司，批號：LC0922B5011J)； Trizol(Invitrogen，批號：149101)；M-MLV First Strand Kit(Invitrogen，批號：8212007)；SYBR Green qPCR SuperMix(Invitrogen，批號：8212113)；TYR1 F：GCTTTCCTGTCCTACCC，R：GCTTTCCTGTCCTACCC；β-actin F：CCTAGACTTCGAGCAAGAGA，R：GGAAGGAAGGCTGGAAGA；常規(guī)生化試劑購自天津市永大化學試劑有限公司。

1.3實驗儀器 電子分析天平(德國Sartorius公司，型號：SQP，感量：0.01 mg)；生物安全柜(上海蘇凈公司，型號：YJ-875)；倒置顯微鏡(上海光學六廠，型號：37XB)；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司，型號：MCO-18AIC)；生化培養(yǎng)箱(上海博遠實業(yè)有限公司，型號：SPX-150B-Z)；酶標儀(德國Thermo公司，型號：Go 1510)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad 公司，型號：CFX96)。

1.4方法

1.4.1紫鉚花素母液的配制 精密稱取紫鉚花素樣品0.1 g，以二甲亞砜(DMSO)溶解，配制成100 g·L-1母液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2共培養(yǎng)細胞體系的建立 取對數(shù)生長期角質形成細胞HaCaT，每個培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰酶1 mL消化，計數(shù)細胞濃度為5×105·mL-1密度，接種到需要規(guī)格的細胞培養(yǎng)板中，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)6 h使細胞充分貼壁；取對數(shù)生長期黑色素瘤細胞A375，每個培養(yǎng)瓶加入0.25%胰酶1 mL消化，計數(shù)細胞濃度為2.5×105·mL-1密度，接種于已有角質形成HaCaT細胞貼壁生長的細胞培養(yǎng)板中，使角質形成細胞HaCaT和黑色素瘤細胞A375接種比例為2：1，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中24 h。

1.4.3MTT法檢測細胞增殖率[7]建立共培養(yǎng)細胞體系，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，分別加入終濃度0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 μg·mL-1含紫鉚花素培養(yǎng)液，另設不加藥物的陰性對照組，即黑色素瘤細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)體系，空白對照組(不含細胞，僅加入相同體積培養(yǎng)液，用于計算細胞增殖率時消除溶液本底誤差)。每組設10個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，陰性對照組和空白對照組以及紫鉚花素各給藥組每孔均加入5 g·L-1MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，上述每孔加入DMSO200 μL，震蕩10 min，使結晶完全溶解，立即于酶標儀490 nm波長處測定吸光度值(A值)，計算各組細胞增殖率。細胞增殖率(%)=[(加藥組A值-空白對照組A值) /(陰性對照組A值-空白對照組A值)]×100%。

1.4.4酶學方法測定TYR活性 建立共培養(yǎng)細胞體系，培養(yǎng)24 h后，設不同濃度(0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 μg·mL-1)紫鉚花素組，另設不加藥物的陰性對照組即黑色素瘤細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)體系和不接種細胞僅加入相同體積培養(yǎng)液的空白對照組(本組不含細胞，僅用于計算TYR活性時消除溶液本底誤差)。每組設8個復孔。給藥48 h后，采用多巴氧化速率法測定每組的TYR活性，酶標儀測定490 nm處A值，測定各組的TYR活性[5]。TYR活性(%)=(加藥組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100%。

1.4.5氫氧化鈉(NaOH)裂解法測定黑色素合成 建立共培養(yǎng)細胞體系，培養(yǎng)24 h后，設不同濃度(0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 μg·mL-1)紫鉚花素組，另設不加藥物的陰性對照組即黑色素瘤細胞與角質形成細胞共培養(yǎng)體系)和不接種細胞僅加入相同體積培養(yǎng)液的空白對照組(不含細胞，僅用于計算黑色素合成率時消除溶液本底誤差)。每組設8個復孔。給藥48 h后采用NaOH裂解法測定細胞黑色素含量，酶標儀測定460 nm波長處A值。黑色素合成率(%)=(加藥組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100%。

1.4.6酪氨酸相關蛋白1(tyrosine-related protein-1，TRP-1)、酪氨酸相關蛋白2(tyrosine-related protein -2，TRP-2)基因表達的檢測 建立共培養(yǎng)細胞體系，培養(yǎng)24 h，設陰性對照組和不同濃度(0.1，0.5，1.0，5.0，10.0 μg·mL-1)紫鉚花素組，每組設3個重復。給藥48 h后收集細胞，Trizol提取各組細胞總RNA，取RNA 5 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測RNA完整性，然后使用反轉錄酶按40 μL體系進行反轉錄合成cDNA，進行cDNA純化、RNA電泳并檢測RNA濃度，進行實時熒光聚合酶鏈反應(Real-time PCR)檢測。

2 結果

2.1紫鉚花素對黑色素瘤細胞A375和角質形成細胞HaCaT共培養(yǎng)細胞體系細胞增殖率的影響 MTT結果顯示，與陰性對照組比較，A375細胞和HaCaT細胞共培養(yǎng)體系與不同濃度紫鉚花素共孵育48 h后，1.0，5.0 μg·mL-1紫鉚花素組細胞增殖率顯著增高(P<0.05或P<0.01)，10.0 μg·mL-1紫鉚花素組細胞存活率則被明顯抑制(P<0.01)。見表1。

表16組細胞增殖率測定結果

組別劑量/(μg·mL-1)A490增殖率/%陰性對照組-0.68±0.04100.00±5.87紫鉚花素組0.10.62±0.0389.98±4.620.50.67±0.1197.70±16.651.00.76±0.08*1111.56±11.87*15.00.80±0.13*2118.48±20.50*210.00.38±0.04*252.59±5.72*2

與陰性對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with negative control group，*1P<0.05，*2P<0.01

2.2紫鉚花素對人黑色素瘤細胞A375和角質形成細胞HaCaT共培養(yǎng)體系TYR含量的影響L-Dopa氧化速率法測定TYR活性，結果顯示，與陰性對照組比較，1.0，5.0 μg·mL-1紫鉚花素能明顯上調黑色素瘤細胞A375和角質形成細胞HaCaT共培養(yǎng)體系中A375細胞TYR活性(P<0.05 或P<0.01)。5.0 μg·mL-1紫鉚花素促進作用最強(P<0.01)，見表2。

表26組細胞TYR活性測定結果

組別劑量/(μg·mL-1)A490TYR活性/%陰性對照組-0.12±0.01106.05±17.75紫鉚花素組0.10.13±0.02118.45±28.800.50.12±0.01104.26±17.831.00.14±0.03*1142.13±39.83*15.00.18±0.01*2199.85±11.45*210.00.11±0.1496.50±22.38

與陰性對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with negative control group，*1P<0.05，*2P<0.01

2.3紫鉚花素對黑色素瘤細胞A375和角質形成細胞HaCaT共培養(yǎng)體系黑色素合成的影響 NaOH裂解法結果顯示，與陰性對照組比較，在0.5～5.0 μg·mL-1濃度范圍，各劑量紫鉚花素組黑色素合成率均明顯提高(P<0.05 或P<0.01)，紫鉚花素5.0 μg·mL-1時，促黑色素合成作用最強(P<0.01)。見表3。

表36組細胞中黑色素合成率測定結果

組別劑量/(μg·mL-1)A490黑色素合成率/%陰性對照組-0.08±0.01100.00±23.41紫鉚花素組0.10.10±0.01130.87±29.110.50.10±0.01*1151.55±2806*11.00.10±0.00*1153.10±3.85*15.00.12±0.02*2191.78±58.54*210.00.08±0.0181.02±16.56

與陰性對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01.

Compared with negative control group，*1P<0.05，*2P<0.01

2.4紫鉚花素對黑色素瘤細胞A375 和角質形成細胞HaCaT共培養(yǎng)體系中TYR活性相關基因TRP-1、TRP-2 mRNA表達的影響 Realtime PCR檢測結果顯示，與陰性對照組比較，在0.1～5.0 μg·mL-1濃度范圍，紫鉚花素各劑量組黑色素細胞TRP-1表達水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)、在0.5～5.0 μg·mL-1濃度范圍、紫鉚花素各劑量組黑色素細胞TRP-2 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.01)，且紫鉚花素為1.0 μg·mL-1時作用最強。見表4。

表46組細胞中TRP-1、TRP-2mRNA表達測定結果

組別劑量/(μg·mL-1)TRP-1 mRNATRP-2 mRNA陰性對照組-1.00±0.001.00±0.00紫鉚花素組0.11.13±0.05*11.01±0.070.51.22±0.02*21.18±0.03*21.01.42±0.07*21.42±0.06*25.01.40±0.03*21.38±0.02*210.00.98±0.071.00±0.11

與陰性對照組比較，*1P<0.05，*2P<0.01

Compared with negative control group，*1P<0.05，*2P<0.01

3 討論

白癜風是一種由于黑色素細胞選擇性破壞所致的皮膚獲得性慢性色素脫失病[8]。表現(xiàn)為皮膚或毛發(fā)中黑色素細胞功能喪失，或兩者兼而有之，導致皮膚產生白斑[9]。研究認為，該病主要由黑色素細胞的破壞和黑色素合成途徑阻塞造成。黑色素由黑色素細胞內合成，傳遞到鄰近的角質形成細胞，并隨角質形成細胞向表皮上層移動，影響皮膚顏色[10]。黑色素在黑色素小體中由多巴醌合成，其合成受酶級聯(lián)調節(jié)，TYR是黑色素生成的限速酶，酪氨酸家族基因TRP-1、TRP-2負責色素沉著的轉錄調控[8]。

紫鉚花素是驅蟲斑鳩菊有效成分，對體外單獨培養(yǎng)的黑色素瘤細胞A375的黑色素合成和TYR活性的調節(jié)作用已經(jīng)得到證明[11]。筆者在本實驗考察不同濃度紫鉚花素作用于A375細胞和Hacat細胞共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)0.5，1.0，5.0 μg·mL-1紫鉚花素可明顯促進共培養(yǎng)細胞增殖及黑色素細胞TYR活性和黑色素合成，顯著提高TRP-1、TRP-2 mRNA表達，但紫鉚花素在10.0 μg·mL-1時表現(xiàn)出明顯抑制共培養(yǎng)體系細胞增殖率以及黑色素合成的作用，提示紫鉚花素促進共培養(yǎng)體系細胞增殖與濃度有關，超過一定濃度能夠對細胞增殖形成抑制，該藥可能存在一定的細胞毒性。本實驗結果顯示，紫鉚花素促進共培養(yǎng)體系細胞TYR活性和黑色素合成的濃度與體外單獨培養(yǎng)的黑色素瘤細胞A375一致，但其促進作用明顯增強，提示紫鉚花素可以通過作用于Hacat細胞促進黑色素細胞黑色素形成，該結果與文獻[12]報道一致，說明紫鉚花素促進黑色素合成的作用機制不僅與A375細胞和Hacat細胞相關，還與上述兩種細胞間相互作用有關。

A375細胞和Hacat細胞共培養(yǎng)能較好地模擬表皮微環(huán)境，筆者在本實驗中觀察到紫鉚花素明顯促進共培養(yǎng)細胞的黑色素合成以及提高TRP-1、TRP-2 mRNA表達，說明調節(jié)TRP-1、TRP-2基因表達以及影響A375細胞和Hacat細胞之間的相互作用，可能是紫鉚花素治療白癜風的作用機制之一，但其是否能促進黑色素小體的轉運及其轉運機制尚不明確，需要繼續(xù)研究。