益生菌改善尿毒癥大鼠腸道巨噬細胞介導(dǎo)的細菌移位

孫凌霜 劉 華 梁珊珊 薛瑾虹 魏 萌 蔣紅利

尿毒癥患者的不良預(yù)后與體內(nèi)持續(xù)存在的微炎癥狀態(tài)密切相關(guān)[1]。我們團隊前期的研究發(fā)現(xiàn)示蹤大腸桿菌密度在尿毒癥大鼠模型腸道組織中明顯增加并且腸道外組織中大腸桿菌基因DNA增加[2-3]，結(jié)合其他研究，提示腸道細菌和內(nèi)毒素移位進入血循環(huán)可能是微炎癥產(chǎn)生的原因[4]。促炎表型的巨噬細胞在很多腎臟疾病的進展中起到重要角色[5-6]。M細胞(microfold cell)吞噬腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic escherichia coli,EHEC)并且之后被派伊爾淋巴結(jié)(Peyer’s patches)中的巨噬細胞吞噬可能是影響其感染效能的關(guān)鍵步驟[7]。脂多糖(LPS)是細菌的組成成分和Toll樣受體的配體，表達在許多免疫細胞表面，包括巨噬細胞。Toll樣受體4(TLR4)是動脈粥樣硬化的中介，增強的LPS/TLR4信號可能是慢性腎臟疾病患者動脈粥樣硬化加速啟動因素[8]。LPS也誘導(dǎo)巨噬細胞表面的早期生長因子1(early growth response 1，EGR1)激活，并通過轉(zhuǎn)錄因子EGR1和核因子κB(NF-κB)誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達[9]。因此，細菌產(chǎn)物可能激活巨噬細胞和其他免疫細胞以產(chǎn)生促炎介質(zhì)并且觸發(fā)炎癥發(fā)生[10]。我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)尿毒癥大鼠存在腸道微生態(tài)失調(diào)，表現(xiàn)為益生菌的減少，病原菌和條件致病菌數(shù)量增加[11]。因此，補充益生菌可能會對尿毒癥狀態(tài)有益，減輕細菌移位和微炎癥狀態(tài)[3]。另外，乳酸桿菌減少黏膜微生態(tài)失調(diào)，并且在維持腸道屏障功能、改善局部腸道免疫、增強病原體的拮抗作用起到關(guān)鍵的角色[12-13]。因此，本研究旨在揭示腸道巨噬細胞在尿毒癥大鼠細菌移位中的作用；通過評估細菌移位、巨噬細胞功能、尿毒癥大鼠的微炎癥狀態(tài)調(diào)查乳酸桿菌的作用。

材料和方法

材料

示蹤細菌 通過重組的綠色熒光蛋白質(zhì)粒構(gòu)建，以適應(yīng)大腸桿菌DH5細胞。接種在含有100 μg/ml的氨芐青霉素Luria-Bertani培養(yǎng)基內(nèi)，在37℃恒溫培養(yǎng)搖床過夜，終濃度調(diào)整到108CFU/ml。

動物模型 SPF級成年健康雄性SD大鼠，體重200～250g，行5/6腎臟切除術(shù)造尿毒癥模型。55只大鼠一期手術(shù)切除約2/3體積的左腎皮質(zhì)；1w后，二期手術(shù)切除右側(cè)腎臟。同時，20只大鼠進行兩次打開腎包膜的手術(shù)操作。二期手術(shù)后10w，模型組存活且達到尿毒癥診斷標準的有40只，隨機的分成兩組：尿毒癥組(n=20)和尿毒癥+益生菌組(n=20)；假手術(shù)組存活20只。尿毒癥+益生菌組每日灌胃益生菌1 ml(109CFU/ml)，持續(xù)4周。研究方案被西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準。二期手術(shù)后14w，10%水合氯醛溶液0.5 ml/100g腹腔注射麻醉取材，每組隨機選10只大鼠麻醉取材前2h灌胃綠色熒光蛋白(GFP)標記的示蹤菌1 ml。

檢測指標和方法

CD68和GFP共定位 低溫恒溫器切割腸道組織成5 μm厚的樣本并在0.1%的胰蛋白酶(Difco Laboratories,Detroit,MI)中孵化，在37℃的PBS中浸泡30 min，加入10%羊血清37 ℃封閉60 min，滴加1∶ 200 小鼠抗大鼠-CD68的或者1∶ 200抗兔GFP 的 (Abcam,Cambridge,MA)一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4℃過夜；之后加二抗，滴加的1∶ 1 000 抗小鼠Dylight633 IgG和1∶ 1 000 抗兔異硫氰酸熒光素(FITC) IgG ( CWBio,武漢)二抗37℃孵育1h。

腸道形態(tài) 腸道組織標本修剪成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm，常規(guī)染色處理后H-7650電子顯微鏡(日立，東京)觀察。

腸道通透性 二期手術(shù)后10w，隨機選取每組10只大鼠，禁食8h，單獨放入代謝籠。飲水自由，1ml水中含5 μCi的锝99標記的二乙烯三胺五乙酸(99mTc-DTPA)。檢測24h尿液中99mTc-DTPA濃度。搜集總計500 μl的外周血和尿液使用γ射線計數(shù)器測放射性水平。計算腸道通透性。

EGR1和TLR4基因表達 二期手術(shù)后14w每組選取3只大鼠制備腸組織勻漿，Trizol法提取總RNA (CWbio,北京,中國)。引物序列如下:EGR1:forward:5′-AGCCTTCGCTCACTCCACTA-3′,reverse:5′-GACTCAACAGGGCAAGCATAC-3′; andTLR4:forward:5′-TGGCATCATCTTCATTGTCC-3′,reverse:5′-CAGAGCATTGTCCTCCCACT-3′。

EGR1、TLR4蛋白表達水平 二期手術(shù)后14周每組選取3只大鼠，取腸上皮組織進行勻漿，提取總蛋白，用BCA法測蛋白濃度(CWbio,北京)。加樣40 μg/孔，10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃搖床封閉2h；加入1∶ 800 抗EGR1,1∶ 800 抗TLR4 (Abcam),和1∶ 1 000抗β-actin (CWbio,中國)一抗，4℃過夜，洗膜；加入HRP-共位的抗小鼠IgG(1∶ 3 000)或者抗兔IgG(1∶ 3 000) (Boster)二抗，室溫下2h，洗膜，使用化學(xué)發(fā)光HRP試劑盒(Millipore,Billerica,MA)顯色。

內(nèi)毒素、血漿炎癥指標 二期手術(shù)后14w每組隨機選取10只大鼠，腹主動脈采血后分離出血清，檢測肌酐、尿素氮、LPS、 C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細胞介素6(IL-6)、 TNF-α。

統(tǒng)計學(xué)方法采用IBM SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表示為均值±標準差。連續(xù)變量用Student’s T檢驗。分類變量用卡方檢驗或者Fisher’s精確檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

三組大鼠一般資料尿毒癥組和尿毒癥+益生菌組的血尿素氮、肌酐濃度為假手術(shù)組的2～3倍(P<0.05)(表1)。

表1 三組大鼠的體重、紅細胞壓積、肌酐、尿素氮、尿量(均數(shù)±標準差)

*：與假手術(shù)組比較,P<0.05

腸道黏膜形態(tài)尿毒癥組(D～F)較假手術(shù)組(A～C)的腸道上皮細胞之間的空隙增加并且緊密連接電子密度降低，橋粒連接模糊不清楚，上皮細胞內(nèi)線粒體空泡形成(圖1 C、F、I)。尿毒癥+益生菌組(圖1G～I)的可見損傷明顯修復(fù)，微絨毛數(shù)量增加，固有層炎細胞浸潤明顯減輕，上皮細胞排列整齊，緊密連接結(jié)構(gòu)較清晰、橋粒連接電子密度較高。尿毒癥組中示蹤菌黏附于絨毛少的上皮細胞上，并且通過壞死的上皮細胞進入黏膜層(圖1E、F)。

圖1 透射電子顯微鏡觀察的大鼠腸道黏膜(A，D，G)空腸，(B，E，H)回腸，(C，F(xiàn)，I)結(jié)腸；(A～C)假手術(shù)組，(D～F)尿毒癥組，(G～I)尿毒癥+益生菌組；↑指示示蹤菌(A～I，除外)；指示緊密連接(A，B，C，E，H，I)；指示橋粒連接(B，C，I)；△指示線粒體(C，F(xiàn)，I)；尺標:2 μm(空腸)；1 μm(回腸，結(jié)腸)；尿毒癥+益生菌組的腸道黏膜與尿毒癥組比較可見微絨毛數(shù)量增加，固有層炎細胞浸潤明顯減輕，上皮細胞排列整齊，緊密連接結(jié)構(gòu)較清晰、橋粒連接電子密度較高

尿毒癥大鼠的細菌移位用抗GFP抗體(綠色)標記示蹤菌，可以看到尿毒癥組綠色熒光出現(xiàn)在回腸(圖2E)，肝臟、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)(MLNs)用抗CD68 抗體(紅色)標記腸道巨噬細胞，可以看到紅色熒光在回腸(圖2D)，肝臟、脾臟和MLNs。尿毒癥組中共定位巨噬細胞標記CD68和GFP標記的示蹤菌，產(chǎn)生黃色熒光提示細菌與巨噬細胞在一起(圖2F)。

假手術(shù)組只有回腸固有層可以看到很少數(shù)量的紅色和綠色熒光(圖2A、B)。巨噬細胞和GFP標記的示蹤菌在尿毒癥+益生菌組中是共定位的(圖2G～I)。

益生菌對腸通透性、血漿內(nèi)毒素和炎性因子的影響尿毒癥+益生菌組比尿毒癥組的腸道通透性明顯下降(P<0.05)，血中內(nèi)毒素和IL-6、TNF-α、CRP明顯減低(P<0.05)(圖3)。

益生菌對巨噬細胞形態(tài)的影響尿毒癥+益生菌組與尿毒癥組比較巨噬細胞呈明顯活化狀態(tài)的表現(xiàn)，細胞體積增大并且細胞突出物和偽足也增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，細胞內(nèi)的初級和次級溶酶體明顯增加(圖4)。

圖2 三組大鼠回腸腸道切片標記CD68和GFPCD68(紅色熒光小點)、GFP細菌(綠色熒光小點)，DAPI(藍色熒光小點)。尿毒癥組可見顯著的紅色和綠色熒光，尺標:50 μm，CD68標記的巨噬細胞和GFP標記的示蹤菌在尿毒癥組中是共定位的GFP:綠色熒光蛋白；DAPI：4′，6-二脒基-2-苯基吲唑

圖3 三組大鼠的腸通透性、內(nèi)毒素、IL-6、CRP、TNF-α的水平IL-6:白細胞介素6;CRP:C反應(yīng)蛋白;TNF-α:腫瘤壞死因子α;*與假手術(shù)組比較,P<0.05；#與尿毒癥組比較,P<0.05

圖4 透射電子顯微鏡觀察的大鼠腸道巨噬細胞細箭頭指示巨噬細胞(A～I)，長厚箭頭指示將要死亡的巨噬細胞(E)，短厚箭頭指示電子密度降低的巨噬細胞(F)；尺標:2 μm；尿毒癥+益生菌組與尿毒癥組比較巨噬細胞呈明顯活化狀態(tài)的表現(xiàn)

Egr1和Tlr4表達尿毒癥+益生菌組的所有腸段Egr1和Tlr4 mRNA平均倍數(shù)均顯著低于尿毒癥組(與尿毒癥組比較P<0.05，圖5A)。

免疫印跡結(jié)果中尿毒癥+益生菌組的所有腸段TLR4蛋白條帶與尿毒癥組腸段比較，蛋白表達要顯著地降低(圖5B、C)。

圖5 三組各腸段的EGR1和TLR4表達SH:假手術(shù)組;UR:尿毒癥組;UP:尿毒癥+益生菌組。EGR1:早期生長因子1;TLR4:Toll樣受體4;TLR4和EGR1基因表達的倍數(shù)變化。每個柱形圖表示數(shù)據(jù)為均數(shù)±標準差。*與假手術(shù)組空腸比較,P<0.05；#與尿毒癥組各個對應(yīng)腸段比較,P<0.05

討 論

本研究用GFP標記示蹤菌，首次在尿毒癥大鼠模型中直觀觀察到示蹤菌出現(xiàn)在腸外組織(肝臟、脾臟、MLNs)。腸道巨噬細胞和示蹤菌共定位，提示承載細菌的巨噬細胞穿過腸道黏膜幫助促進尿毒癥時的細菌移位。尿毒癥時腸道巨噬細胞向促炎癥型分化，加重微炎癥反應(yīng)，腸道巨噬細胞吞噬功能障礙。尿毒癥大鼠使用乳酸桿菌治療后微炎癥狀態(tài)明顯緩解，由于減輕了腸道巨噬細胞炎癥激活和改善巨噬細胞吞噬功能、黏膜免疫屏障，因此細菌移位也有所減輕。

尿毒癥時腸道細菌可以移位穿過不完整的腸道屏障，進入腸道、腸外組織及全身血循環(huán)內(nèi)，并且對微炎癥狀態(tài)有貢獻[14]。細菌可能經(jīng)過M細胞或者不完整的腸上皮緊密連接穿過腸道屏障[15]。血中增加的內(nèi)毒素水平也支持尿毒癥時細菌移位的發(fā)生，并且有利于評估細菌移位的程度。由于腸道細菌過度生長和巨噬細胞的吞噬功能受損，腸道巨噬細胞不能及時清除細菌，并且未被殺滅的腸道細菌還利用巨噬細胞進入腸外組織和血循環(huán)。巨噬細胞被高水平的LPS刺激時會向促炎型轉(zhuǎn)變[16]。巨噬細胞通過TLR4 被LPS激活，產(chǎn)生TNF-α[17]。本研究的結(jié)果表明，尿毒癥組的腸道組織EGR1 mRNA增加，這與其他研究者發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)刺激巨噬細胞產(chǎn)生EGR1一致[18]。換言之，LPS激活TLR4和EGR1，最終引起巨噬細胞遷移和活化，巨噬細胞釋放促炎因子和炎癥趨化因子(例如TNF-α 和IL-6)。尿毒癥時某些革蘭氏陰性細菌過度生長并且腸道屏障完整性被破壞，腸道巨噬細胞將細菌吞噬并通過其遷移轉(zhuǎn)移，使內(nèi)毒素進入血循環(huán)并刺激促炎細胞因子，導(dǎo)致持續(xù)性系統(tǒng)性炎癥[10,19]。

本研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌可以減少細菌移位，降低巨噬細胞激活標志物、內(nèi)毒素、促炎因子水平。另外，乳酸桿菌修復(fù)腸道巨噬細胞微觀形態(tài)。首先，乳酸桿菌增加益生菌數(shù)量同時減少條件致病菌數(shù)量，競爭性拮抗病原體黏附和定植腸道黏膜[20]。第二，乳酸桿菌通過正常化緊密連接蛋白幫助保持腸道黏膜的完整性[21]。第三，乳酸桿菌可能調(diào)節(jié)非特定的細胞免疫反應(yīng)，改善腸道巨噬細胞吞噬功能，減少腸道巨噬細胞活化程度[22]。提示益生菌可能對尿毒癥時改善腸道炎癥反應(yīng)以及減輕腸道巨噬細胞炎癥反應(yīng)和吞噬功能有幫助。

因此，本研究直接證實尿毒癥時腸道細菌通過腸道巨噬細胞發(fā)生移位。尿毒癥大鼠使用乳酸桿菌治療后減輕了腸道巨噬細胞炎癥激活、改善巨噬細胞吞噬功能、黏膜免疫屏障，因此微炎癥狀態(tài)和細菌移位明顯減輕。