紅樹林植物來(lái)源內(nèi)生真菌構(gòu)巢曲霉MA143次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定

冷 懿

（北京林業(yè)大學(xué)，北京100083）

天然產(chǎn)物在現(xiàn)代疾病治療與防治中依然發(fā)揮著重要作用，一直是許多新藥制劑或藥物先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源[1]。如今，一些治療重大疾病,如癌癥、感染性疾病、代謝紊亂、免疫缺陷的藥物依然主要來(lái)源于天然產(chǎn)物或其類似物[1-2]。從天然產(chǎn)物的來(lái)源來(lái)看，微生物次生代謝產(chǎn)物是天然藥物或先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。微生物能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣、活性廣泛顯著的次生代謝產(chǎn)物，如臨床上使用的阿司匹林、環(huán)洛伐他汀、紫杉醇、嗎啡等，成為人們進(jìn)行新藥研發(fā)的重要研究對(duì)象[3](如圖1-2)。本文以紅樹林植物來(lái)源內(nèi)生真菌構(gòu)巢曲霉MA143為研究對(duì)象，對(duì)其ICI培養(yǎng)基發(fā)酵粗提物的化學(xué)成分進(jìn)行初步研究,以期從紅樹林植物中分離得到具有顯著生物活性的新化合物，用于如抗腫瘤、抗真菌等醫(yī)藥用途。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象——構(gòu)巢曲霉MA143

構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans，也稱為 Emericella nidulans，構(gòu)巢裸胞殼）（如圖3）通常為單倍體，但能誘導(dǎo)為異核體或二倍體，產(chǎn)生有性和無(wú)性孢子，而其他大部分曲霉是無(wú)性的。構(gòu)巢曲霉是遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究得最廣泛的微生物之一，已經(jīng)成為真核生物細(xì)胞生物學(xué)上一個(gè)重要模式生物，可表達(dá)哺乳動(dòng)物基因。構(gòu)巢曲霉是工業(yè)和醫(yī)學(xué)上使用較多的曲霉菌如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉（A.oryzae）、黃曲霉（A.flavus）和煙曲霉（A.fumigatus）等的近緣種。構(gòu)巢曲霉基因組約31 Mb是目前NCBI上公開發(fā)表的47種真菌的基因組序列之一。研究構(gòu)巢曲霉的次生代謝產(chǎn)物具有重要意義，這將有助于了解構(gòu)巢曲霉的生物學(xué)特性，還能促進(jìn)疫苗和藥物的研制開發(fā)。

圖1 天然產(chǎn)物是醫(yī)藥發(fā)展的重要?jiǎng)恿igure1 Natural products is the important driving force of the development of the medicine

圖2 紅樹林內(nèi)生真菌活性代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展Figure2 Mangrove endophytic fungi active metabolites were reviewed

圖3 構(gòu)巢曲霉MA143Figure3 Structure aspergillus MA143 nest

1.2 ICI培養(yǎng)基配方

表1 ICI培養(yǎng)基配方Table1 ICI medium formula

1.3 培養(yǎng)方式

自然光照，靜置發(fā)酵30天。

1.4 主要分離方法原理及操作[4-7]

1.4.1 硅膠柱層析

分離原理：根據(jù)硅膠對(duì)物質(zhì)的吸附力不同而達(dá)到分離目的。正常情況下，極性大的物質(zhì)容易被硅膠吸附，極性較小的物質(zhì)不易被硅膠吸附，適用于分離極性小的化合物。

其主要操作步驟如下：

拌樣：用最少量的低沸點(diǎn)合適有機(jī)溶劑（如二氯化碳）將待分離的樣品充分溶解，與能充分吸附該樣品量的100～200目硅膠攪拌均勻，揮干溶劑，得到柱層析所用樣品；

裝柱：根據(jù)拌樣量硅膠量的多少，選擇直徑、長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)牟Ａеb入適量300～400目的硅膠(使拌樣的硅膠高度與固定相填料的高度比在1：15左右)，用真空泵抽勻、抽實(shí)；

上樣：將拌樣得到的硅膠樣品在層析柱上表面均勻鋪撒，再用真空泵抽勻、抽實(shí)，然后在樣品上表面添加保護(hù)層硅膠和脫脂棉；

洗脫：根據(jù)TLC薄層板中化合物的比移值（Rf值）不同，所要得到的化合物的Rf值大小，選擇適當(dāng)?shù)南疵搫?，按極性從小到大的順序，選擇不同的梯度連續(xù)洗脫，收集洗脫劑組分；

回收組分的處理：通過(guò)薄層層析分析法顯色后，把含有相同Rf值并且顯色相同的組分合并在一起。合并到一起的各個(gè)組分分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40℃左右減壓濃縮，得到濃縮浸膏或干粉顆粒。

1.4.2 凝膠柱層析（Sephadex LH-20）

分離原理：凝膠柱層析也叫分子篩過(guò)濾，它是利用分子篩效應(yīng)過(guò)濾分離物質(zhì)的方法，其所用載體，如Sephadex-LH-20，具有三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)在有機(jī)溶劑中充分溶脹后裝入色譜柱中，加入樣品混合物，用同一溶劑洗脫時(shí)，由于凝膠網(wǎng)孔半徑的限制，大分子物質(zhì)不能進(jìn)入到凝膠顆粒內(nèi)部網(wǎng)孔中，在顆粒間隙流動(dòng)，隨著洗脫劑一起從柱底流出，小分子化合物因?yàn)槟軌蜻M(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而后流出。從而樣品按分子量從大到小先后流出凝膠色譜柱。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

裝柱：本實(shí)驗(yàn)所用的凝膠為葡聚糖凝膠Sephadex LH-20。凝膠在使用前用甲醇充分溶漲，裝柱完成后再用3倍柱體積的洗脫液置換；

上樣：將濃縮后的樣品用盡量少的溶劑充分溶解(樣品用初始洗脫劑溶解)，上樣結(jié)束后，使樣品全部進(jìn)入柱內(nèi)再用盡量少的洗脫液清洗漏斗及柱壁，

洗脫：待樣品完全進(jìn)入柱材料中時(shí)，緩緩加入洗脫液(甲醇，甲醇與二氯甲烷的混合溶劑)，調(diào)至合適的流速 (流速與柱長(zhǎng)度和直徑有關(guān)系)，常壓過(guò)柱；

回收組分的處理：通過(guò)薄層層析分析法顯色后，把含有相同Rf值并且顯色相同的組分合并在一起。合并到一起的各個(gè)組分分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40℃左右減壓濃縮，得到濃縮浸膏或干粉顆粒。

1.4.3 反相柱層析

分離原理：反相柱層析其固定相為非極性基團(tuán)，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基與苯基等，流動(dòng)相用強(qiáng)極性溶劑，如水、醇、乙腈或者無(wú)機(jī)鹽緩沖溶劑，最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶劑。極性大的組分先流出，極性小的組分后流出，恰好與正向法相反，故稱反向?qū)游?。本法適合于小分子物質(zhì)的分離純化。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

裝柱：本實(shí)驗(yàn)所用的反相柱層析填料為RP-C18。選擇直徑、長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)牟Ａ游鲋瑢⑦m量RP-C18填料和起始梯度的洗脫劑混懸(甲醇)后進(jìn)行裝填；

平衡層析柱：用起始梯度的洗脫劑(不同濃度的甲醇或丙酮)平衡柱子；

上樣：將樣品用適量起始梯度的洗脫劑完全溶解，用漏斗過(guò)濾后，液體上樣；

洗脫：根據(jù)TLC薄層板中化合物的比移值不同，所要得到的化合物的比移值大小，選擇適當(dāng)?shù)南疵搫?，按極性從大到小的順序進(jìn)行洗脫；

回收組分的處理：通過(guò)薄層層析法顯色后，把含有相同Rf值并且顯色相同的組分合并在一起。合并到一起的各個(gè)組分分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40℃左右減壓濃縮，得到濃縮浸膏或干粉顆粒。

1.5 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.5.1 實(shí)驗(yàn)流程圖（如圖4）

1.5.2 發(fā)酵物的處理：

加入乙酸乙酯浸沒菌絲體，72小時(shí)后，過(guò)濾，將濾渣用玻璃棒攪碎，再加入乙酸乙酯浸泡并超聲20 min，然后過(guò)濾。將乙酸乙酯相合并蒸干，得到粗提物浸膏4.6g。（如圖5）為粗提物HPLC譜圖分析。

圖4 實(shí)驗(yàn)流程圖Figure4 Flow chart of the experiment

圖5 粗提物HPLC譜圖分析Figure5 Crude extractings HPLC chromatogram analysis

1.5.3 代謝產(chǎn)物的分離

菌株發(fā)酵浸膏通過(guò)真空柱層析（VLC）進(jìn)行極性分段。用100～200目硅膠拌樣，200～300目硅膠裝柱子，真空泵抽緊后上樣，用不同比例的、極性從小到大的石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇溶液進(jìn)行層析洗脫。收集到的各個(gè)組分，再經(jīng)反復(fù)的正相、反相色譜層析和重結(jié)晶等方法，分離純化得到單體化合物。綜合運(yùn)用現(xiàn)代波譜技術(shù) (旋光、UV、1H-NMR、13CNMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC) 以及與標(biāo)準(zhǔn)品或文獻(xiàn)比對(duì)，共鑒定了3個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)結(jié)果見圖5-圖14

化合物1的1H和13C譜數(shù)據(jù)（如圖6-7）

圖6 化合物1的氫譜數(shù)據(jù)Figure6 Compounds 1 h NMR data

圖7 化合物1的碳譜數(shù)據(jù)Figure7 c NMR data of compounds 1

化合物2的1H和13C譜數(shù)據(jù)（如圖8-9）：

圖8 化合物2的氫譜數(shù)據(jù)Figure8 Compounds 2 h NMR data

圖9 化合物2的碳譜數(shù)據(jù)Figure9 Compounds 2 c NMR data

化合物3的1H和13C譜數(shù)據(jù)（如圖10-11）：

2.1 化合物1為白色針狀晶體，有亮藍(lán)色熒光，茴香醛顯綠色。該化合物的一維核磁數(shù)據(jù)顯示了氧雜蒽酮（xanthones）的結(jié)構(gòu)特征，經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)[8]查閱和比對(duì)，發(fā)現(xiàn)化合物1與sterigmatocystin（柄曲菌素）的數(shù)據(jù)幾乎完全一致，因此將其鑒定為sterigmatocystin（如圖12）。該化合物被報(bào)道對(duì)人肝癌腫瘤細(xì)胞株Bel-7402和人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCIH-460有微弱抑制活性。

圖10 化合物3的氫譜數(shù)據(jù)Figure10 Compounds 3 h NMR data

圖11 化合物3的碳譜數(shù)據(jù)Figure11 Compounds 3 c NMR data

圖12 化合物1結(jié)構(gòu)Figure12 Compounds 1 structure

2.2 化合物2為橙黃色固體粉末，有黃色熒光，茴香醛顯黃色。該化合物的一維核磁碳譜數(shù)據(jù)顯示了蒽醌類化合物的結(jié)構(gòu)特征，經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)查閱和比對(duì)，發(fā)現(xiàn)化合物2與Versicolorin A（雜色曲霉素）的數(shù)據(jù)幾乎完全一致，因此將其鑒定為Versicolorin A（如圖13）。

圖13 化合物2結(jié)構(gòu)Figure13 Compounds 2 structure

2.3 化合物3為紅色固體粉末，有黃色熒光，茴香醛顯血紅色。該化合物的一維核磁碳譜數(shù)據(jù)顯示了蒽醌類化合物的結(jié)構(gòu)特征，經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)查閱和比對(duì)，發(fā)現(xiàn)化合物3與Averufanin的數(shù)據(jù)幾乎完全一致，因此將其鑒定為Averufanin（如圖14）。

圖14 化合物3結(jié)構(gòu)Figure14 Compounds 3 structure

3 結(jié)論

紅樹林植物開發(fā)新型生物活性物質(zhì)的潛能不可低估[9]，開發(fā)其藥物價(jià)值,發(fā)揮其經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益，促進(jìn)海岸居民對(duì)其加以保護(hù)和種植,具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義[10]。