鴉膽子藥渣抗葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠腸炎作用研究＊

高建勝，黃子健，潘碧妍，何國熙，竇耀星，王彤彤，謝友良，陳建南，蘇子仁＊＊

（1.廣州白云山明興制藥有限公司 廣州 510250；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院 東莞 523808；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 廣州 510405）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種非特異性慢性炎癥，屬于炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）的一種[1]。其臨床特征為結(jié)腸黏膜的彌漫性淺表炎癥[2]。根據(jù)其主要表現(xiàn)：急性疼痛，嘔吐，體重減輕，腹瀉和血便等[3]，在中醫(yī)理論中，UC 被歸屬于“久痢”、“腸澼”、“便血”[4]。據(jù)研究報(bào)道，UC 的發(fā)病率在世界上呈上升趨勢[5]，10 年內(nèi)包括我國在內(nèi)的部分東南亞國家UC 患病率呈指數(shù)增長且增長幅度已翻倍[6]。UC 病程久，復(fù)發(fā)率高，伴隨營養(yǎng)不良、腸道損傷外，還可引起潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌嚴(yán)重的并發(fā)癥，對人們的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[7]。該病病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[8]，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病的發(fā)生是在遺傳、環(huán)境、心理等多種因素共同作用下，導(dǎo)致的腸黏膜局部潰瘍而發(fā)病。目前臨床上治療UC 無特效藥物，主要以氨基水楊酸類制劑、免疫抑制劑、抗生素、類固醇激素等[9]，上述藥物種類和數(shù)量雖多，但全部屬于化藥范疇，療效欠佳，且長期服用常出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，使得治療UC 成為一個(gè)困擾臨床醫(yī)生的難題。因此，尋求安全、有效、患者順應(yīng)好的藥物成為研究UC 領(lǐng)域的熱點(diǎn)。近年來，隨著天然產(chǎn)物的不斷發(fā)現(xiàn)，我們將目光轉(zhuǎn)向我國傳統(tǒng)中草藥療法。

鴉膽子是苦木科（Simaroubaceae）鴉膽子屬植物鴉膽子（Brucea javanica(L.)Merr）的干燥成熟果實(shí)，屬于常用中藥。鴉膽子性寒味苦，歸大腸經(jīng)、肝經(jīng)，有小毒，具有清熱解毒，截瘧，止痢的功效，常用于痢疾，瘧疾。近年來，研究多集中于鴉膽子的抗腫瘤作用及機(jī)制[10-12]，鮮有對其治療痢疾這一傳統(tǒng)應(yīng)用的報(bào)道。不斷有臨床研究表明，口服或者灌腸鴉膽子油及其鴉膽子相關(guān)制劑對UC 均具有很好的治療作用[16-18]。此外，已有研究表明鴉膽子苦醇、鴉膽因D、鴉膽子油乳對DSS 誘導(dǎo)的UC 小鼠模型具有較為良好的治療作用[13-15]。在鴉膽子油實(shí)際生產(chǎn)過程中，石油醚提取鴉膽子油后，會產(chǎn)生大量鴉膽子藥渣。根據(jù)前期研究，鴉膽子藥渣含有鴉膽子苦醇、鴉膽因D 等苦木內(nèi)酯類成分，但是否具有抗UC 的作用，尚未得到證實(shí)。本文擬開展鴉膽子藥渣治療腸炎作用的研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

48 只SPF 級Balb/c 雄性小鼠，體重為20-23 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SYXK（2013-0085）。

1.2 試劑與材料

葡聚糖硫酸鈉（DSS，分子量：36 000-50 000，加拿大MP 生物醫(yī)藥公司）；美沙拉嗪（5-ASA，上海愛的發(fā)制藥有限公司）；TNF-α、IL-1β、IFN-γ酶聯(lián)免疫反應(yīng)Elisa 試劑盒（美國ebioscience 公司）。蘇木素、伊紅購自于廣州化學(xué)試劑總廠。

鴉膽子藥渣提取物：取鴉膽子提油后的藥渣2 500 g，粉碎，經(jīng)100 目篩網(wǎng)過濾得到藥渣粉。按照藥渣粉：乙醇=1∶3（W/V）的比例加入乙醇。加熱回流提取2 次，每次2 h，合并濾液。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮體積，回收乙醇后濃縮得到浸膏70 g。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物的分組、造模及取材處理

造模前，將48 只小鼠飼養(yǎng)在光照/黑暗周期為12小時(shí)的房間中，保持房間溫度（22-24℃）和相對濕度（40-55%）。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，依表1 隨機(jī)分為：正常對照組，DSS 組，5-ASA 組，鴉膽子藥渣低、中、高劑量組，共6個(gè)小組，每組8只。

正常組給予蒸餾水，其余5 組給予3%DSS 水溶液造模，分別裝于水壺中供小鼠自由飲用7 d。造模時(shí)，正常對照組和DSS 組給予蒸餾水,其余各組小鼠灌胃給予如表1所示相應(yīng)的藥物進(jìn)行治療，持續(xù)7 d，每日1次。于第8 d 處死小鼠，剖腹取出全結(jié)腸，擠出腸道中所含糞便。迅速縱剖結(jié)腸并把糞便殘留物用生理鹽水沖洗去除，并吸除結(jié)腸多余生理鹽水后測量其長度和重量。取0.5 cm 結(jié)腸組織固定于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛中，石蠟包埋，4 μm 厚切片以備HE 染色用；剩余部分取1.0 cm分裝于離心管中，液氮凍存后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱，用于ELISA分析。

表1 小鼠分組及給藥劑量

表2 DAI評分方法

1.4 疾病活動指數(shù)（Disease activity index，DAI）評估

造模期間，每天觀察動物健康狀況并記錄其一般情況：體重變化、糞便特征、腹瀉和直腸出血情況。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，DAI 指數(shù)由不清楚實(shí)驗(yàn)方案的人員按表2標(biāo)準(zhǔn)評分。

1.5 病理切片

將小鼠腸組織制作病理切片后，在顯微鏡下觀察結(jié)腸組織的病理變化，并進(jìn)行結(jié)腸炎癥和損傷程度組織學(xué)病理評分（Histological score），評分由兩名病理學(xué)家按照下述表3標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲評。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定炎癥因子及炎性介質(zhì)

根據(jù)試劑盒說明書加入勻漿介質(zhì)并制備組織勻漿，離心后取上清液測定TNF-α、IL-1β及IFN-γ含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行繪圖，采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各指標(biāo)組間比較使用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時(shí)，組內(nèi)兩兩多重比較采用LSD 法；方差不齊時(shí)，組內(nèi)兩兩多重比較采用Dunnett's T3 法。P＜0.05 或P＜0.01 表示有顯著性差異。

表3 組織病理狀態(tài)評分

圖1 小鼠一般活動情況（n=8）

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 小鼠一般活動情況觀察

在實(shí)驗(yàn)過程中，正常組小鼠毛色光亮，每天飲水?dāng)z食正常，排便正常，體質(zhì)量呈持續(xù)上升；造模后小鼠出現(xiàn)活動減少，精神倦怠，出現(xiàn)厭食，體重減輕和水樣糞便及肛門部位不同程度的出血等情況。如圖1A 所示：模型組第3 d 起，小鼠開始逐漸出現(xiàn)腹瀉、黏液便，明顯的體重減輕；陽性藥組小鼠前4 d 雖保持持續(xù)下降趨勢，但第五天開始，飲食逐漸增多，體重下降減緩且呈上升趨勢，活動增加，大便逐漸恢復(fù)正常；鴉膽子藥渣提取物各給藥組與陽性藥組趨勢類同，且呈劑量依賴關(guān)系；其中，鴉膽子藥渣提取物高劑量組小鼠體重增長最為明顯。根據(jù)實(shí)驗(yàn)第8 d 小鼠DAI 指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如圖1B。模型組的DAI評分顯著高于正常對照組（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥治療后能夠顯著降低小鼠DAI分?jǐn)?shù)（P＜0.01）；鴉膽子藥渣提取物各給藥組能夠不同程度地降低了DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的DAI評分（P＜0.01），并呈劑量依賴關(guān)系；其中，鴉膽子藥渣提取物高劑量組降低小鼠DAI評分最為顯著。

實(shí)驗(yàn)第8 d小鼠結(jié)腸長度結(jié)果如圖1B。模型組小鼠結(jié)腸長度相比正常對照組明顯縮短（P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥治療后能夠顯著改善結(jié)腸長度的縮短情況（P＜0.01）；鴉膽子藥渣提取物各給藥組均能不同程度改善小鼠結(jié)腸長度縮短情況（P＜0.01），與陽性藥組趨勢類同，且呈劑量依賴關(guān)系；其中，鴉膽子藥渣提取物高劑量組改善小鼠結(jié)腸長度的縮短最為顯著（P＜0.01）。綜上所述，鴉膽子藥渣提取物能夠改善DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的宏觀表現(xiàn)，其中高劑量的鴉膽子藥渣提取物對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎改善最為顯著。

2.2 DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)變化

結(jié)腸組織病理切片染色及組織病理學(xué)評分，結(jié)果見圖3。正常對照組小鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊、無萎縮，黏膜層及結(jié)腸黏膜下層無明顯的炎細(xì)胞浸潤。模型組小鼠結(jié)腸組織顯示有明顯的壞死，上皮破損或缺損，黏膜下層可見大量的炎性細(xì)胞浸潤，同時(shí)伴有隱窩增生，其組織病理學(xué)評分，顯著高于正常對照組（P＜0.01）。陽性藥組較模型組情況好轉(zhuǎn)，黏膜上皮破損不明顯，黏膜層及下層炎癥細(xì)胞浸潤減少，固有層腺體萎縮情況減輕，肌層及漿膜較為完整，改善小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分（P＜0.01）；鴉膽子藥渣提取物各給藥組與陽性藥組趨勢類同，均能減輕結(jié)腸組織病理變化和改善小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分（P＜0.01），且呈劑量依賴關(guān)系；其中，鴉膽子藥渣提取物高劑量組小鼠改善結(jié)腸組織病理變化和病理學(xué)評分最為明顯。

圖2 小鼠結(jié)腸長度比較（n=8）

圖3 結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)變化及組織病理學(xué)評分（n=8）

圖4 對小鼠結(jié)腸組織中免疫炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響（n=8）

2.3 DSS 誘導(dǎo)的UC 模型小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞炎癥因子的影響

小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞炎癥因子測定結(jié)果，見圖4。模型組小鼠腸組織中的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平均明顯高于正常對照組（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組小鼠腸組織中的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平均顯著降低（P＜0.01）；鴉膽子藥渣提取物各給藥組能夠不同程度的降低促炎因子水平（P＜0.05，P＜0.01），且呈劑量依賴關(guān)系；其中，鴉膽子藥渣提取物高劑量組降低小鼠腸組織中的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平最為明顯。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease,IBD）的一種，該病是一種累及胃腸道的慢性炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制尚不明確。其有終生復(fù)發(fā)傾向，病程遷延，發(fā)作與緩解交替，且有癌變傾向，臨床表現(xiàn)以持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉、粘液血便等癥狀為主[13]。近年來，UC 的發(fā)病率在發(fā)展中國家呈指數(shù)增長，在發(fā)達(dá)國家穩(wěn)定增長。根據(jù)UC 所表現(xiàn)出來的臨床癥狀，中醫(yī)學(xué)將其歸屬于“休息痢”、“腸澼”、“腸風(fēng)”、“久痢”、“賍毒”、“滯下”等范疇[19]?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》中指出：“凡痢之偏于熱者用之皆有捷效，而以治下鮮血之痢，瀉血水之痢，則尤效”，“涼血解毒，善治熱性赤痢，二便因熱下血”。目前，臨床上治療UC 常用治療藥物多為氨基酸水楊酸鹽、免疫抑制劑、皮質(zhì)類固醇激素、抗生素等[20]，一定程度上可以緩解患者的臨床癥狀，但是不能從根本上完全治愈UC，且伴隨不同程度的副作用，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)難治病癥之一[21]。因此，尋求安全有效的治療方案和藥物刻不容緩。

鴉膽子是苦木科鴉膽子屬植物（Brucea javanica(L.)Merr.）的干燥成熟果實(shí)，始載于《本草綱目拾遺》，又名老鴉膽、苦參子等。其味苦，性寒，歸大腸、肝經(jīng)，具有清熱解毒、截瘧、止痢之功效，外用還可腐蝕贅疣。主治痢疾，瘧疾；外治贅疣，雞眼。鴉膽子用于痢疾治療由來已久，是民間用于治療里急后重、腹瀉腹痛、赤白膿血便等重要藥用植物之一[22]。張錫純[18]認(rèn)為“治痢最要藥品，其痢之偏熱者，當(dāng)以鴉膽子為最要之藥”。已有文獻(xiàn)報(bào)道，鴉膽子油口服乳液保留灌腸治療UC 療效明顯[16]，除此之外，鴉膽子油乳和鴉膽子成分鴉膽苦醇、鴉膽因D 對DSS 誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎均有明顯的治療作用[13-15]。根據(jù)文獻(xiàn)我們已知鴉膽子藥渣中含有鴉膽子苦醇、鴉膽因D 等苦木內(nèi)酯類成分[23]，因此，我們選用提油后的鴉膽子藥渣提取物作為研究對象，探究提油后的鴉膽子藥渣對DSS 誘導(dǎo)的小鼠UC是否同樣具有明顯的治療作用。

目前，UC 動物模型已成為研究該病病因的有效手段，其中化學(xué)試劑DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎與人類UC臨床表現(xiàn)特點(diǎn)相似[24,25]，如體重下降、腹瀉腹痛、結(jié)直腸縮短、直腸出血、以及相應(yīng)的組織學(xué)特性，包括組織多部位的侵蝕、結(jié)腸黏膜炎癥變化，間或腺窩膿腫等。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，口服給予小鼠不同劑量鴉膽子藥渣提取物后，能夠不同程度的增加小鼠體重，改善便血及腸組織變化。結(jié)合實(shí)驗(yàn)動物的DAI 評分（結(jié)合體重下降、糞便性狀、便血狀態(tài)三者的變化而得出的評分）和結(jié)腸長度變化，能夠從宏觀變化的角度說明鴉膽子藥渣提取物對UC 具有治療作用。此外，細(xì)胞因子是細(xì)胞經(jīng)刺激而合成分泌的一類具有生物活性的小分子蛋白的統(tǒng)稱，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、介導(dǎo)炎癥介質(zhì)和參與組織修復(fù)等功能[26]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為各種細(xì)胞因子對于腸道免疫系統(tǒng)至關(guān)重要。作為細(xì)胞間的信號傳遞分子,長期而持久的分泌失衡可使炎癥反應(yīng)呈現(xiàn)慢性化表現(xiàn)。目前已知與UC 發(fā)病密切相關(guān)的細(xì)胞因子主要有白介素（interleukin,IL）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor,TNF）、干擾素（interferon,IFN）等[27-28]。TNF-α作為TNF 的一種亞型，是機(jī)體炎癥與免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。TNF-α的過度表達(dá)可導(dǎo)致上皮屏障損傷，上皮細(xì)胞凋亡，以及結(jié)腸上皮細(xì)胞分泌趨化因子[29]；同時(shí)，其作為促炎因子，與抑炎因子間的失衡可導(dǎo)致UC 的發(fā)生與發(fā)展，在該疾病發(fā)病機(jī)制中起到核心作用[30]。IL-1β是由活化的固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生的一個(gè)經(jīng)典的促炎性細(xì)胞因子，在宿主防御和感染以及炎癥病理發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。IL-1β水平的增加，會引起損害結(jié)腸組織的自身免疫過程[31]，是UC 發(fā)病、發(fā)展的重要因素[32]。IFN-γ是由Thl 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞產(chǎn)生的一種二聚體糖蛋白，具有免疫調(diào)節(jié)活性，是吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞激活物[33]。IFN-γ對傷口的調(diào)節(jié)作用由TNF-α介導(dǎo)，對傷口修復(fù)至關(guān)重要[34]。本研究通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組的TNF-α、IFN-γ、和IL-1β水平增加明顯，給與鴉膽子藥渣提取物后能顯著降低TNF-α、IFN-γ、和IL-1β水平的增加，表明其潛在的抗炎作用。

綜上所述，鴉膽子藥渣提取物對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠具有治療作用，具體體現(xiàn)為能夠改善UC 小鼠的體重下降，疾病活動度，改善結(jié)腸組織的縮短程度和病理損傷程度。其機(jī)制可能是通過降低TNF-α、IFN-γ、和IL-1β表達(dá)，進(jìn)而維持體內(nèi)促炎癥因子平衡，修復(fù)局部結(jié)腸黏膜功能，恢復(fù)腸黏膜屏障保護(hù)功能來實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為鴉膽子提油后的藥渣用于UC 治療提供了科學(xué)依據(jù)。