HPLC測定益智仁以及其鹽灸炮制品中白楊素和圓柚酮含量＊

舒雪純，胡 璇，于福來，楊 全，白宗利，元 超，龐玉新＊＊，袁 媛＊＊

（1.海南大學熱帶農(nóng)林學院 ?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所 ?？?571101；3.廣東藥科大學中藥資源學院 云浮 527300；4.康美藥業(yè)股份有限公司 普寧 515300）

益智仁為姜科植物益智（Alpinia oxyphyllaMiq）的干燥成熟果實，廣泛栽培于熱帶和亞熱帶南部地區(qū)[1]，其中海南和廣東為道地主產(chǎn)區(qū)，福建、廣西、云南等地亦有少量栽培[2]，是我國四大南藥之一，其性溫，味辛，入脾胃經(jīng)，具有溫脾止瀉[3]、攝唾液[4]、暖腎、固精縮尿[5]之功效。益智的炮制方法始建于唐代去殼炒法；宋代載有去皮，切，鹽炒；明代有蜜炙，鹽煮，酒炒，姜汁炒；清代煨[6]。2015 版《中華人民共和國藥典》中收錄的方法是照鹽水炙法炒干。目前，中醫(yī)臨床上常用的益智仁藥材有生品和鹽炙品兩種[7]，生品性溫味辛，主歸脾經(jīng)，常用于脾胃虛寒的腹痛吐瀉，口涎自留等癥[8]，鹽炙品可緩解辛燥，主歸腎經(jīng)，專行下焦，長于固精縮尿，多用于治療腎氣虛寒的遺精，早泄，尿頻，遺尿，白濁等癥[9]。

中藥材通過炮制可去除其有害部分，并改變其有效組分或含量，提高藥物的治療效果[10]?，F(xiàn)代研究表明，鹽灸前后益智仁揮發(fā)油中4 種成分發(fā)生了明顯變化，其中菖蒲烯、喇叭茶醇、氧化石竹烯和香附子烯僅在益智仁生品中檢出，而桉葉-11 烯-1a-醇、9，10-脫氫異長葉烯、古蕓烯環(huán)氧化物和1R，4R，7R，11R-1,3,4,7-四甲基三環(huán)[5.3.1.0(4,11)]-十一-2-烯（0.38%）僅在鹽益智仁中檢出[11]；黃勤挽[12]等運用氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）聯(lián)用分析方法對益智仁生品、鹽炙品揮發(fā)油成分進行對比分析發(fā)現(xiàn)，益智仁經(jīng)鹽灸后新增16種化合物，消失35 種化合物；李夢琪[13]等研究發(fā)現(xiàn)，益智仁鹽灸后1 號峰峰面積發(fā)生顯著變化，其含量在鹽灸后有明顯增加。提示鹽灸前后益智仁化學成分不僅在種類方面發(fā)生變化，而且在化學成分含量上也存在明顯差異。但未見關于鹽灸前后益智仁中多成分含有量影響的報道。因此，本研究建立了高效液相色譜法（HPLC）同時測定益智仁以及其鹽灸炮制品中白楊素、圓柚酮兩種成分含量，并對其含量差異進行分析討論，以期為闡明炮制作用機制奠定基礎，同時也為益智仁飲片的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 實驗材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；ME54E/02 型萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多（上海）公司）；DAD 紫外檢測器（美國Agilent 公司）；YC-04A 手提式高速粉碎機（廣州金本機械設備有限公司）；KQ-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；

從康美藥業(yè)股份有限公司收集20 批益智仁飲片和20批益智仁鹽灸炮制品飲片，經(jīng)廣東藥科大學龐玉新教授鑒定均為姜科植物益智（Alpinia oxyphyllaMiq）的干燥成熟果實，批號及產(chǎn)地信息見表1。對照品白楊素（批號X24O6C4947，純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司）、圓柚酮（批號CHB171218，純度＞97%，成都克洛瑪生物科技有限公司），乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制方法簡述

鹽益智仁：取益智仁飲片除去雜質(zhì)，取適量的鹽溶解至4-5 倍水中（每100 kg 益智仁用鹽2 kg），加入到益智仁飲片中，攪拌均勻，悶潤2-4 h。將悶潤好的益智仁倒入炒藥機內(nèi)炒干，取出，放涼即可。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗

采用YMC-Pack C18（250×4.6 mm，5 μm），流動相為0.3%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（表2），檢測波長250 nm，流速0.6 mL·min-1，進樣量為15 μL，柱溫30℃，色譜圖見圖1。

表1 樣品信息

表2 流動相梯度洗脫程序

圖1 混合對照品溶液（A）、益智仁樣品溶液（B）和鹽益智仁樣品溶液（C）HPLC圖譜

表3 各被測成分的回歸方程、相關系數(shù)及檢測限和定量限

2.3 對照品溶液的制備

分別精密量取白楊素和圓柚酮對照品適量置于20 mL 的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配置成白楊素和圓柚酮質(zhì)量濃度為0.502 mg·mL-1，40.00 mg·mL-1的單一對照儲備液，再精密量取白楊素、圓柚酮單一對照品溶液適量置于10 mL 的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配置成白楊素和圓柚酮質(zhì)量濃度為0.010,0.405 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取益智仁粉末（20目，下同）約1.0 g，精密稱定，置于20 mL 容量瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取（250 W,40 kHz）30 min，放冷，稱重，用甲醇補足失重，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 標準曲線制備

分別精密量取混合對照品儲備液0.5，1.25，2.5，5，8，10 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，稀釋配置成一系列梯度濃度的混合對照品溶液，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，按照“2.2”項下的色譜條件進行色譜分析，以對照品質(zhì)量濃度X（mg·L-1）對峰面積Y進行線性回歸，繪制白楊素、圓柚酮標準曲線，線性范圍見表3。結(jié)果表明，2種成分在測定范圍內(nèi)線性關系良好。

2.5.2 檢測限與定量限

將“2.3”項的混合對照品溶液用甲醇逐級稀釋后，按信噪比S/N 為3∶1 的對照品溶液濃度確定為檢出限（LOD），以信噪比S/N 為10∶1 的對照品溶液濃度確定為定量限（LOQ），結(jié)果見表3。

2.5.3 重復性試驗

取同一批益智仁粉末約1.0 g，共6 份，精密稱定，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算白楊素、圓柚酮峰面積的RSD分別為2.06%、1.98%，表明本方法重復性良好。

2.5.4 精密度試驗

取同一批益智仁粉末供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件進樣，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，計算白楊素、圓柚酮峰面積的RSD分別為1.64%、0.13%，表明本方法精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗

取同一批益智仁粉末供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 分別進樣，記錄峰面積，計算白楊素、圓柚酮峰面積的RSD值分別為0.50%、0.17%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗

取已知含量（白楊素和圓柚酮2個化合物的質(zhì)量分數(shù)分別為0.088%、2.065%）的益智仁樣品粉末約0.2 g，精密稱定9份，置10 mL容量瓶中，分別精密加入配置好適量濃度的白楊素、圓柚酮各自0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，加入一定量甲醇定容至刻度線，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項色譜條件進行含量測定，計算平均加樣回收率和RSD 值，白楊素、圓柚酮的加樣回收率均值在101.45%～104.13%，RSD 值分別為1.92%、1.76%。表明本方法回收率良好，結(jié)果見表4。

2.6 樣品測定及結(jié)果

取各批次益智仁及其炮制品粉末，每個樣品取3份，分別按“2.4”項方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液15 μL，按“2.2”項下色譜條件進行測定，以峰面積按標準曲線發(fā)計算各樣品中2種主要成分的含量，并計算平均值，結(jié)果見表5。結(jié)果表明益智仁與其炮制品鹽益智仁在白楊素平均含量上具有顯著差異（P＜0.05），鹽益智仁中白楊素的平均含量為0.086±0.009 mg.g-1，益智仁中白楊素的平均含量為0.097 ±0.021 mg.g-1；鹽灸前后圓柚酮平均含量呈上升趨勢，但無顯著差異，不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），益智仁中圓柚酮成分含量為3.01±0.307 mg·g-1，鹽灸后圓柚酮成分含量為2.93±0.456 mg·g-1。由此推測，鹽灸前后益智仁內(nèi)在質(zhì)量差異較大，因此為了建立更加科學合理的益智仁評價標準，還需要對益智仁中多種成分含量進行對比分析。鹽灸前后益智仁中白楊素含量差異較大，益智仁的鹽灸方式、飲片規(guī)格可能是導致其成分含量波動的主要原因。在益智仁質(zhì)量控制中，應對白楊素等成分進行質(zhì)量控制，以全面評價益智仁藥材質(zhì)量。

表4 各成分的加樣回收率與RSD（n=9）

表5 炮制前后益智仁樣品含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

益智中化學成分復雜[14]，為了使被定量的白楊素和圓柚酮具有合適的保留時間和良好的分離度。本研究采用梯度洗脫方式，對檢測波長、柱溫、進樣量、磷酸的濃度、流速以及流動相的梯度洗脫程序進行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測波長為250 nm 時,白楊素和圓柚酮具有較強的紫外吸收且峰型對稱；隨著柱溫的升高，白楊素的分離度呈降低趨勢而圓柚酮影響不大；進樣量為5 μL 時，圖譜色譜峰數(shù)目明顯減少；分別選用0.1%，0.2%，0.4%，0.5%的磷酸溶液為流動相，發(fā)現(xiàn)磷酸濃度為0.4%時,圖譜中大部分色譜峰尤其是2 個待測色譜峰的峰形和分離度均較好；對不同的流動相梯度進行考察主要是不斷調(diào)整有機相乙腈的比例，在保證各成分流出順序不改變的前提下調(diào)整保留時間而達到改善被測峰分離度的目的，尤其是白楊素，因與其前面色譜峰極性差別較小，需要在合適的色譜條件下分離度才能達到1.5 以上。所以綜合各種因素，最終梯度洗脫條件確定為：檢測波長250 nm，進樣量15 μL，流動相為0.3%磷酸水-乙腈，柱溫30℃，流速0.6 mL·min-1，梯度洗脫程序見“梯度洗脫項下。

3.2 益智仁以及其鹽灸炮制品中白楊素和圓柚酮含量差異及分析

益智仁現(xiàn)代炮制方法不甚一致，但與古代相比，主導方法漸趨一致，均為鹽炙法[15]，益智仁經(jīng)過鹽炙過程后，其化學組分和含量均存在不同程度的改變。研究發(fā)現(xiàn)，益智仁經(jīng)鹽炙后出現(xiàn)2個新色譜峰，并發(fā)現(xiàn)有7 個色譜峰峰面積發(fā)生改變[16]；經(jīng)GC-MS 分析鹽炙后益智仁中揮發(fā)性成分γ-古蕓烯、β-欖香烯等相對含量變化較大，但圓柚酮和艾里莫芬烯含量基本未發(fā)生改變[17]。本文分別對康美公司收集的多批次益智仁樣品及其鹽灸炮制品進行了有效成分的定量分析，由于目前市售益智化合物標準品的限制，只選擇了具有生物活性的黃酮類化合物楊芽黃素和白楊素以及倍半萜化合物圓柚酮作為定性定量分析成分，但在多次定性研究過程中發(fā)現(xiàn)楊芽黃素并不存在于益智仁以及其鹽灸炮制品中，故最終選擇白楊素和圓柚酮作為含量測定主要指標成分。對測定結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，益智仁以及其鹽灸炮制品在白楊素平均含量上具有顯著差異（P＜0.05），炮制品中白楊素含量相對較低，圓柚酮平均含量呈上升趨勢，但不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

現(xiàn)代藥理研究表明白楊素、圓柚酮均是益智發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎成分，白楊素具有抗腫瘤、抗高血壓、抗炎、阻斷細胞凋亡、減輕心肌損傷的作用[18,19]；圓柚酮具有縮尿澀精、溫脾止瀉、改善神經(jīng)行為表現(xiàn)等功效[17,20]。在本文研究定量標準品相對較少的情況下，白楊素和圓柚酮含量的變化是否與益智炮制前后藥理作用的差異存在關聯(lián)性，還有待后續(xù)進行深入實研究。在本論文的基礎上應加大對益智的提取分離純化鑒定研究，以期獲得更多的單體成分對益智仁及其炮制品進行定性定量分析，同時也為益智藥材以及飲片的多指標成分質(zhì)量控制提供依據(jù)。