三七總皂苷調(diào)節(jié)能量代謝干預(yù)心肌細胞肥大的效應(yīng)機制研究＊

羅 凱，張 騰1，＊＊，陳 瑜1，＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 上海 200437；2.上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所 上海 200437）

根據(jù)2019 年3 月發(fā)布的《中國心血管病報告2018》顯示，近十年來，我國心血管病死亡率一直位居各類疾病首位，并且發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升趨勢[1]。作為多種心血管疾病形成過程中共同病理表型之一的心肌細胞肥大也越來越多的受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。心肌細胞肥大是心肌細胞對各種內(nèi)外因素誘導(dǎo)的生物學(xué)壓力增加所作出的反應(yīng)，其特點是心肌細胞體積增大，直徑增寬，長度增加，肌節(jié)數(shù)量增多，并且與心肌肥厚和心衰的發(fā)生密切相關(guān)[2]。三七是五加科植物三七的干燥根和根莖，味甘、性溫、微苦，最早明確記載于《本草綱目》之中，迄今有數(shù)百年的臨床應(yīng)用歷史?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》記載：“三七，善化瘀血，又善止血妄行，病愈后不致瘀血留于經(jīng)絡(luò)?！比呔哂谢鲋寡?、活血定痛的功效。PNS 是中藥三七最主要活性成分之一，具有抗炎、抗凝、抗氧化、抗凋亡、抗心律失常、減少心肌耗氧量等多種藥理活性，其相關(guān)制劑臨床廣泛應(yīng)用于心血管疾病的防治[3，4]。近年來，有研究報道PNS 能夠顯著降低心肌損傷小鼠的心肌細胞橫截面積，提示PNS 可能具有抑制心肌細胞肥大，抗心肌肥厚的效應(yīng)[5，6]，然而有關(guān)其作用機制尚未見深入的研究報道。亦有報道，心肌細胞肥大與能量代謝紊亂關(guān)系密切[7]。因此，本實驗從能量代謝途徑發(fā)掘并探索PNS 抑制心肌細胞肥大效應(yīng)可能的分子機制，以期為其臨床應(yīng)用和推廣提供扎實的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑

新生1-3 天C57BL/6J 乳鼠(由購自斯萊克動物有限公司的成年C57BL/6J 小鼠繁育所得)；小鼠心肌細胞分離試劑盒（Thermo Scientific）；三七總皂苷（純度≥98%）（上海泛亞生物醫(yī)藥集團）；異丙腎上腺素（純度≥99%）（東京化成工業(yè)株式會社）；羅丹明-鬼筆環(huán)肽染料（Thermo Scientific）；ATP檢測試劑盒（碧云天生物科技公司）；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen）；5xPrime Script RT Master Mix（TaKaRa）；SYBR GREEN（Roche）；PPAR-δ一 抗（Thermo Scientific，PA1-823A）；PPAR-δ二抗（Thermo Scientific，SH253595）。

1.2 實驗儀器

熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國UVP 公司）；多功能酶標儀（BioTek 公司）；倒置熒光顯微鏡（Leica，DM6000B）；實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（Roche）；細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific）；微量紫外分光光度計（Shimadzu）。

1.3 細胞分離及模型制備

新生1-3 天C57BL/6J 乳鼠，75%的醫(yī)用酒精皮膚消毒，沿左側(cè)肋弓下緣將肋弓與胸腔分離，使心臟暴露于體外，用鑷子迅速離斷心臟，于HBSS 緩沖液中（不含Ca2+、Mg2+）將心臟殘血浸滌干凈并剪碎，每個心臟置于備有木瓜蛋白酶200 μL和嗜熱菌蛋白酶10 μL混合液的EP 管中，37℃震蕩消化30 min，3000 rcf 常溫離心3 min，去上清液留心肌細胞沉淀物，每管加入HBSS緩沖液1 mL將沉淀吹打均勻，室溫放置5 min終止消化反應(yīng)，2000 rcf 常溫離心3 min，去上清留沉淀，每管加入含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL 將沉淀吹打均勻，將各個EP 管中含有心肌細胞的培養(yǎng)基置于50 mL 離心管中混勻，調(diào)整細胞濃度為5 × 105/mL，接種至12 孔培養(yǎng)板，1000 μL/孔，37℃條件下置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育。待心肌細胞貼壁（約24 h）后，將上清連同沒有貼壁的心肌細胞吸出，重新加入DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)孵育。利用ISO（10 μmol/L）在二氧化培養(yǎng)箱5%CO2，37℃環(huán)境中培養(yǎng)孵育72 h，制備心肌細胞肥大模型。

1.4 分組給藥

將心肌細胞隨機分為4 組：①正常組:加入等體積的生理鹽水溶液；②模型組：等體積生理鹽水+ISO 10 μmol/L；③PNS 低劑量組:PNS 50 mg/L+ISO 10 μmol/L；④PNS 高劑量組:PNS 200 mg/L+ISO 10 μmol/L。PNS 干預(yù)后30 min 給予ISO，在二氧化培養(yǎng)箱5%CO2，37℃環(huán)境中培養(yǎng)孵育72 h。

1.5 心肌細胞病理染色及橫截面積計算

心肌細胞孵育72 h 后吸去培養(yǎng)基，用PBS 清洗細胞10 min× 2 次，1% Triton 200 μL 透明化浸泡3 min，PBS清洗細胞10 min×2次，10%BSA 200 μL孵育20 min，5 μg/mL羅丹明-鬼筆環(huán)肽200 μL室溫避光孵育20 min，PBS 清洗細胞10 min × 2 次，0.1 mg/mL DAPI 200 μL溶液室溫孵育1 min，對細胞核進行復(fù)染，400 倍熒光顯微鏡下觀察拍攝細胞形態(tài)。每孔觀察5 個視野，每個視野測5-10 個細胞，應(yīng)用image J 軟件計算心肌細胞橫截面積，取其平均值。

1.6 總RNA抽取及miRNA、基因表達分析

心肌細胞孵育72 h后吸去培養(yǎng)基，9%生理鹽水清洗，每孔分別加入500 μL Trizol 吹打，室溫放置5 min；離心取上清，加入氯仿100 μL，溫和振蕩室溫放置20min；離心取上清，加入異丙醇250 μL，振蕩混勻室溫放置15 min；離心棄上清，RNA 沉于管底加入75%乙醇500 μL，振蕩混勻室溫放置5 min；離心棄上清，室溫晾干10 min，每管加入DEPC 水50 μL 溶解，完成總RNA 提取。計算總RNA 濃度，進行逆轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA。利用SYBG法進行Real-Time PCR 檢測。

各引物如表1和表2所示。

表1 用于mRNA表達分析的引物

1.7 心肌細胞ATP水平分析

心肌細胞孵育72 h 后吸去培養(yǎng)基，9%生理鹽水清洗，4℃環(huán)境按150 μL/孔加ATP 細胞裂解液，4℃離心取上清（即ATP 樣品），按照20 μL/孔，將樣品加入檢測孔中，利用多功能酶標儀檢測樣品中ATP 濃度，利用BCA 法測定樣品中蛋白濃度，計算樣品單位心肌細胞ATP 含量=樣品ATP 濃度/樣品蛋白含量，計算各組單位心肌細胞所含ATP的相對比值。

1.8 蛋白提取及表達水平分析

心肌細胞孵育72 h 后吸去培養(yǎng)基，9%生理鹽水清洗，裂解心肌細胞，收集上清，BCA 法測蛋白濃度，配SDS 凝膠，每個凝膠孔加入蛋白樣品20 μg 進行電泳分離，80 V電泳約25 min，120 V電泳約80 min，切取目的條帶所在的凝膠進行濕式電轉(zhuǎn)膜，30 mA 持續(xù)轉(zhuǎn)膜約12 h，將轉(zhuǎn)膜后的印跡膜用TBST緩沖液洗膜10 min×2次，10%牛血清球蛋白封閉2 h，一抗（1:500,PA1-823A）4℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜10 min ×2 次，二抗（1:5000，SH253595）室溫孵育2 h，TBST 緩沖液洗膜10 min×2 次，DAB法顯色、成像，Launch visionworksLS分析軟件分析測定PPAR-δ與β-actin 的灰度值，取PPAR-δ/β-actin比值為蛋白水平進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗，結(jié)果取P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PNS對ISO誘導(dǎo)的原代心肌細胞肥大具有顯著直接抑制效應(yīng)

羅丹明-鬼筆環(huán)肽可以特異性的識別心肌細胞內(nèi)的肌動蛋白微絲，對心肌細胞進行染色在熒光顯微鏡下可呈現(xiàn)紅色，以示意心肌細胞輪廓；心肌細胞核因DAPI 染色可呈現(xiàn)為藍色，代表心肌細胞數(shù)量。如圖1所示，400 倍鏡下，正常組心肌細胞體積較小，細胞呈現(xiàn)圓形或小梭形；模型組心肌細胞體積增大，最短徑增寬，長度增加，心肌細胞輪廓呈現(xiàn)為大梭形、長方形；與模型組比較，PNS 低、高劑量組心肌細胞體積不同程度變小。

表2 用于miRNA表達分析的引物

圖1 心肌細胞羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色（× 400）

表3 心肌細胞橫截面積（mean ± SEM）

應(yīng)用image J軟件計算心肌細胞橫截面積。如表3所示，與正常組比較，模型組心肌細胞橫截面積顯著增大（P＜0.05）；與模型組比較，PNS 低、高劑量組心肌細胞橫截面積顯著減?。≒＜0.05）。

2.2 PNS顯著下調(diào)心肌細胞肥大相關(guān)因子mRNA表達

圖2 心肌細胞BNP mRNA表達水平

如圖2 所示，Real-Time PCR 分析結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組心肌細胞BNP mRNA 表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，PNS 低、高劑量組心肌細胞BNP mRNA表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。

2.3 PNS顯著升高心肌細胞ATP水平

如圖3所示，與正常組比較，模型組心肌細胞ATP水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，PNS 低、高劑量組心肌細胞ATP水平顯著升高（P＜0.05）。

2.4 PNS 顯著上調(diào)心肌細胞脂肪酸β 氧化相關(guān)因子mRNA表達

如圖4 所示，Real-Time PCR 分析結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組心肌細胞PPAR-δ、MCAD、LCAD mRNA 表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，PNS低劑量組心肌細胞MCAD、LCAD mRNA 表達水平顯著上調(diào)，PNS 高劑量組心肌細胞PPAR-δ、MCAD、LCAD mRNA表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。

2.5 PNS顯著上調(diào)心肌細胞PPAR-δ蛋白水平

如圖5 所示，Western blotting 分析結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組心肌細胞PPAR-δ蛋白水平顯著下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，PNS 低、高劑量組心肌細胞PPAR-δ蛋白水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。

2.6 PNS顯著下調(diào)心肌細胞miRNA-199a表達

如圖6 所示，Real-Time PCR 分析結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組心肌細胞miRNA-199a 表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，PNS 低、高劑量組心肌細胞miRNA-199a表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)中并無與心肌細胞肥大直接對應(yīng)的中醫(yī)病名，但根據(jù)其病因病機和臨床表現(xiàn)可將其歸屬于中醫(yī)的心悸、怔忡、胸痹等范疇，其病機多樣，瘀血阻滯是發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一?；诓∫虿C及臨床特點，后世醫(yī)家在總結(jié)前人經(jīng)驗基礎(chǔ)上，對這類疾病往往采用不同的治療方式，其中“活血化瘀”是常用的治法之一。無論是古方還是現(xiàn)代臨床用藥，三七都是活血化瘀治法中重要的組成部分，PNS 是三七中最主要也是研究最多的活性成分之一[8]。

圖4 心肌細胞MCAD、LCAD、PPAR-δ mRNA表達水平

體內(nèi)心肌細胞發(fā)生肥大的過程中，一方面心臟在感受壓力和容量負荷增加等不良刺激后會直接誘導(dǎo)心肌細胞發(fā)生肥大；另一方面心臟感受不良刺激后處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，激活ROS 系統(tǒng)，促使炎癥細胞釋放大量炎性因子作用于心肌細胞肥大相關(guān)受體，導(dǎo)致炎癥周圍心肌細胞發(fā)生肥大，炎癥因子也可以促進成纖維細胞增殖，使心肌發(fā)生纖維化，進而激活心肌細胞肥大相關(guān)受體，加快心肌細胞肥大進程[9，10]。在前期實驗研究中觀察到，PNS 能夠顯著降低心肌損傷小鼠的心肌細胞橫截面積，提示PNS 可能具有抑制心肌細胞肥大的效應(yīng)。心肌組織主要由心肌細胞和成纖維細胞組成，并且病理狀態(tài)下心肌內(nèi)富含各種炎癥細胞，基于心肌細胞肥大發(fā)生的分子學(xué)機制，單純的小鼠體內(nèi)實驗并不能系統(tǒng)準確的闡述PNS 是否具有直接抑制心肌細胞肥大的效應(yīng)。對此，本實驗基于PNS 在小鼠體內(nèi)抑制心肌細胞肥大有效的前提下，對原代心肌細胞進行分離，將心肌組織中絕大多數(shù)的成纖維細胞、炎癥細胞進行消化剔除，最大比例的保留原代心肌細胞后，在成功復(fù)制原代心肌細胞肥大模型基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討PNS 是否具有直接抑制心肌細胞肥大的效應(yīng)。實驗結(jié)果顯示，給予不同劑量的PNS 后，ISO 誘導(dǎo)的心肌細胞橫截面積顯著減小，心肌細胞肥大相關(guān)因子BNP 的mRNA 表達水平顯著下調(diào)。提示PNS 具有顯著直接抑制心肌細胞肥大的效應(yīng)。

生理狀態(tài)下，心肌細胞活動所需要的能量60%-90%來自脂肪酸β氧化，10%-40%來自葡萄糖有氧氧化，少量來自酮體、氨基酸分解[11]。病理狀態(tài)下，心肌細胞內(nèi)能量底物由脂肪酸向葡萄糖轉(zhuǎn)換，脂肪酸β氧化減少，糖酵解增加[12]。糖酵解雖然能夠在短時間內(nèi)迅速提供能量，暫時滿足心肌細胞對能量的需求，但是這種產(chǎn)能方式產(chǎn)能效率低下。由于糖酵解過程中會產(chǎn)生大量乳酸，使細胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，ATP 此時大多用于維持內(nèi)環(huán)境中Na+、Ca2+等離子的轉(zhuǎn)運，用于心肌細胞收縮的供能減少，導(dǎo)致心臟效率下降，發(fā)生心肌細胞肥大、心肌肥厚[2]。ATP 又稱三磷酸腺苷，是機體的直接供能物質(zhì)，ATP 發(fā)生水解時，形成ADP 并釋放一個磷酸根，同時釋放能量。脂肪酸、葡萄糖、蛋白質(zhì)給機體供能，都要通過代謝轉(zhuǎn)化成為ATP實現(xiàn)[13]。因此ATP 可以直接反映心肌細胞最終的能量生成。有研究報道[14]，心肌細胞肥大發(fā)生時伴有ATP 生成減少，提示心肌細胞肥大可能與能量代謝異常存在密切關(guān)系。本實驗在PNS 具有顯著直接抑制心肌細肥大效應(yīng)的基礎(chǔ)上進一步對心肌細胞能量代謝進行探索。實驗通過對原代心肌細胞中ATP 含量進行測定，以此反映心肌細胞能量代謝情況。實驗結(jié)果顯示，ISO 誘導(dǎo)的心肌細胞在肥大過程中ATP 水平顯著降低；給予不同劑量的PNS 后，ATP 水平顯著升高。提示PNS 可能通過改善心肌細胞能量代謝，發(fā)揮抑制心肌細胞肥大的效應(yīng)。

圖5 心肌細胞PPAR-δ蛋白水平

圖6 心肌細胞miRNA-199a表達水平

正常狀態(tài)下，甘油三酯可以在胞質(zhì)內(nèi)分解為甘油和脂肪酸。中鏈和長鏈脂肪酸需要轉(zhuǎn)化為脂酰COA，在肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I催化下與肉堿結(jié)合形成脂酰肉堿才能轉(zhuǎn)運進入線粒體內(nèi)，進行脂肪酸β氧化，生成大量ATP[15]。心臟病理狀態(tài)下，心肌細胞及線粒體內(nèi)的酶活性和代謝發(fā)生顯著變化，影響脂酰COA 由胞質(zhì)向線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)運速率，使參與脂肪酸β氧化的底物水平下降，導(dǎo)致ATP 生成減少，產(chǎn)能降低。LCAD 和MCAD 是肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I 重要組成部分，二者分別協(xié)助長鏈脂肪酸和中鏈脂肪酸進入線粒體，在脂肪酸β氧化過程中發(fā)揮著重要作用[16]。有研究報道心肌細胞肥大過程中，LCAD 和MCAD 活性降低,造成線粒體外膜上的肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I 表達下降，影響脂酰COA 與肉堿結(jié)合形成脂酰肉堿，使脂酰COA 由胞質(zhì)向線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)運速率降低，線粒體攝取脂酰COA 功能出現(xiàn)障礙[17]。實驗采用Real-Time PCR 分析心肌細胞中LCAD、MCAD的mRNA 表達。結(jié)果顯示，ISO 誘導(dǎo)心肌細胞肥大過程中，心肌細胞中LCAD、MCAD 的mRNA 表達水平顯著下調(diào)；給予不同劑量PNS 后心肌細胞中LCAD、MCAD 的mRNA 表達水平顯著上調(diào)。提示PNS可能通過上調(diào)LCAD、MCAD 的表達，促進脂肪酸代謝，增加心肌細胞能量生成。

PPAR-δ是心肌細胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一，可以激活與脂肪酸攝取、氧化相關(guān)的多種基因的表達，與心肌細胞脂肪酸代謝密切相關(guān)[15]。有研究報道在心肌細胞脂肪酸代謝過程中，PPAR-δ可能通過調(diào)控其下游靶基因LCAD 和MCAD 的活性,影響脂肪酸β氧化[18]。實驗采用Real-Time PCR 分析心肌細胞中PPAR-δ的mRNA 表達。結(jié)果顯示，ISO誘導(dǎo)心肌細胞肥大過程中，心肌細胞中PPAR-δ的mRNA 表達水平顯著下調(diào)；給予不同劑量PNS 后，心肌細胞中PPAR-δ的mRNA 表達水平出現(xiàn)不同程度上調(diào)，其中以PNS 高劑量組為顯著上調(diào)。由于PPAR-δ在脂肪酸代謝過程中，可能與微小RNA（microRNA,miRNA）存在密切聯(lián)系，實驗采用Western Blotting 進一步分析PPAR-δ蛋白水平。結(jié)果顯示，ISO 誘導(dǎo)心肌細胞肥大過程中，心肌細胞PPAR-δ蛋白水平顯著下調(diào)；給予不同劑量PNS 后，心肌細胞PPAR-δ蛋白水平顯著上調(diào)。提示PNS 可能通過上調(diào)PPAR-δ促進LCAD、MCAD 的表達。

MiRNA 屬于非編碼微小RNA，作用于靶基因mRNA 分子3’端非編碼區(qū)域，通過負性調(diào)控或直接降解mRNA，參與蛋白合成和表達，影響生物活動的進程[19]。研究報道心臟超負荷和缺氧狀態(tài)下可能存在miRNA-199a 表達水平的上調(diào)，進而抑制PPAR-δ活化，限制細胞內(nèi)脂肪酸β氧化速率，影響能量代謝，誘導(dǎo)心肌細胞肥大[20]。實驗結(jié)果顯示，ISO 誘導(dǎo)心肌細胞肥大過程中，心肌細胞miRNA-199a 表達水平顯著上調(diào)；給予不同劑量PNS 后，miRNA-199a 表達水平顯著下調(diào)。提示PNS 下調(diào)心肌細胞miRNA-199a 的表達，上調(diào)其靶基因PPAR-δ的表達，可能是PNS 改善心肌能量代謝，增強脂肪酸β氧化的作用機制之一。

綜上所述PNS 具有顯著直接抑制心肌細胞肥大的效應(yīng)；PNS 干預(yù)MiR-199a/PPAR-δ調(diào)控、改善心肌能量代謝可能是其抑制心肌細胞肥大的作用機制之一。PNS改善能量代謝抑制心肌細胞肥大過程中是否涉及葡萄糖有氧氧化、糖酵解等其他能量代謝途徑尚需要進一步探索研究。這將為改善心肌肥厚、防治心衰提供新的視點和思路。