窩兒七不同提取物中總黃酮總酚含量及其抗氧化活性的研究*

孫 濤，裴青青，安衍茹，彭 亮，劉 永

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(咸陽(yáng) 712046)

窩兒七又名阿兒七、窩兒參、山荷葉、江邊一碗水，為小檗科山荷葉屬南方山荷葉(Diphylleia sinensis H.L.Li) 根及根莖。在陜西主產(chǎn)于太白山、眉縣等地，是陜西傳統(tǒng)中藥之一[1-2]。具有祛風(fēng)除濕，活血祛瘀，解毒的功效。主治風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)、小腹疼痛、癰腫瘡疔等癥[3-4]。

近些年，對(duì)窩兒七化學(xué)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其根及根莖含有大量的酚類(lèi)化合物和黃酮類(lèi)化合物[5]。黃酮類(lèi)化合物在植物體內(nèi)，是具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在且含量豐富。酚類(lèi)物質(zhì)是一種重要的植物化合物，具有抗氧化、清除自由基的作用，與維生素E的生物作用相類(lèi)似[6-7],其作用機(jī)制是直接依靠自身還原性，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)清除自由基，抑制產(chǎn)生超氧陰離子的氧化酶活性，并激活抗氧化酶活性[8]。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)窩兒七的抗氧化活性鮮有報(bào)道，所以研究窩兒七總黃酮總酚的含量與其抗氧化活性的相關(guān)性，為窩兒七的綜合開(kāi)發(fā)提供依據(jù)，同時(shí)也為其抗氧化研究提供參考。

材料與方法

1 材 料

1.1 材料與試劑:窩兒七采于太白鰲山，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室胡本祥教授鑒定為小檗科山荷葉屬南方山荷葉Diphylleia sinensis H.L.Li的根及根莖。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(西瑪實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：XMM0303)，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-201204)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Sigma，批號(hào)：D9132)，2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：K27M6M1)，2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：20180113)，總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(T-AOC，南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20180205)，抗壞血酸、福林酚、鄰菲羅啉碳酸鈉、無(wú)水乙醇、二甲基亞砜、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、三氯化鐵、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，均為分析純，水為超純水。

1.2 儀 器:FA2104式電子分析天枰(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)，HH-2型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)，706CRT型雙光束紫外分光光度計(jì)(上海精益科學(xué)儀器有限公司)，RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，DZF-6050B型真空干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)，KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 窩兒七提取物的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取窩兒七藥材20.00 g置錐形瓶中，以1∶20的料液比依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、70%乙醇、水回流提取2次，每次2 h，分別收取提取液，濃縮，真空干燥后分別得不同溶劑的提取物，密封保存?zhèn)溆?。測(cè)定前，精密稱(chēng)取樣品0.10 g置10 ml容量瓶中，加入1 ml的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩溶解，加蒸餾水補(bǔ)足至刻度，搖勻，得濃度為10 mg/ml的樣品溶液。

2.2 總黃酮含有量的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品干燥24h精密稱(chēng)定10.090 mg，用80%乙醇溶解，定容至10 ml容量瓶中，搖勻，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0090 mg/ml)。分別精密吸100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于10 ml有刻度的離心管中，用80%乙醇補(bǔ)至2.6 ml(對(duì)照品是80%乙醇)，加入顯色試劑，順序?yàn)橄燃尤?.6 ml的5% NaNO2溶液，搖勻；過(guò)6 min后加入0.6 ml的10% Al(NO3)3溶液，搖勻，6 min后加入4.2 ml的4%NaOH溶液，放置20 min，顯色。于分光光度計(jì)510 nm處，測(cè)定其吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),求得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程[9-10]。

2.2.2 測(cè)定方法：精密量取各提取物的樣品溶液400μL于10 ml離心管中，用80%乙醇補(bǔ)至2.6 ml，按2.2.1項(xiàng)下的測(cè)定方法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算各提取物中的總黃酮含量。

2.3 總酚含有量的測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：取沒(méi)食子酸12.40 mg，用蒸餾水定容至100 ml容量瓶中，得沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1240 mg/ml)。準(zhǔn)確吸取100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL、600 μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 ml離心管中，用蒸餾水補(bǔ)至4 ml，(對(duì)照品為4 ml蒸餾水)，依次加入濃度為1 mol/ml福林酚試劑1 ml，7.5% 碳酸鈉溶液3 ml，于40℃下水浴加熱1 h。取出，冷卻至室溫。紫外分光光度計(jì)于765 nm處，測(cè)定其吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。

2.3.2 測(cè)定方法：精密量取各提取物的樣品溶液40μl于10 ml離心管中，用蒸餾水補(bǔ)至4 ml，按2.3.1項(xiàng)下的測(cè)定方法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算各提取物中的總酚含量。

2.4 抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 DPPH自由基清除能力：稱(chēng)取0.02 g DPPH用少量無(wú)水乙醇溶解后轉(zhuǎn)移到500 ml容量瓶中，定容至刻度，得0.10 mmol/L的DDPH乙醇溶液，配制50 μg/ml、100 μg/ml、150 μg/ml、200 μg/ml、250 μg/ml的各提取物樣品溶液，以及濃度為5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml、20 μg/ml、25 μg/ml的抗壞血酸溶液。樣品組加入DPPH的乙醇溶液和樣品溶液各5 ml，對(duì)照組加入無(wú)水乙醇和樣品溶液各 5 ml，空白組加入DPPH乙醇溶液和無(wú)水乙醇各5 ml。充分震蕩后，避光放置30 min，紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值，每個(gè)樣品重復(fù)操作試驗(yàn)3次，取平均值，計(jì)算清除率。Vc為陽(yáng)性對(duì)照，用無(wú)水乙醇調(diào)零。計(jì)算公式：為清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。公式中：A1為實(shí)驗(yàn)組(樣品組)溶液吸光度，A2為對(duì)照組溶液吸光度值，A0為空白組吸光度值。

2.4.2 ABTS自由基清除能力：配制ABTS工作液，將7 mmol/L的ABTS溶液(用70%乙醇配制)和2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液等體積混合，搖勻后室溫避光反應(yīng)16 h，再用70%乙醇調(diào)制溶液吸光度為(0.70±0.02)，即得。配制200 μg/ml、400 μg/ml、600 μg/ml、800 μg/ml、1000 μg/ml的各提取物樣品溶液。精密量取0.10 ml的樣品溶液于4 ml離心管中，加入工作液3.90 ml，充分反應(yīng)，靜置6 min后，在734 nm處測(cè)定吸光度值。重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值計(jì)算清除率。Vc為陽(yáng)性對(duì)照，70%乙醇調(diào)零。清除率=(A0-A1)/A0×100%(式中A0為空白溶液吸光度，A1為實(shí)驗(yàn)組溶液吸光度值)

2.4.3 羥自由基清除能力：采用鄰菲羅啉體系測(cè)定法。配制不同梯度濃度的各提取物樣品溶液。以水為空白，取3支試管，都先依次加入磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)5 ml，5 mmol/L的鄰菲羅啉溶液1 ml，7.5 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 ml；接著，第一試管再加入3 ml水，充分搖勻，標(biāo)記為未損傷管；第二試管再加入2 ml水和1 ml的0.1%的雙氧水，標(biāo)記為損傷管；第3試管再加入樣品溶液2 ml和1 ml的0.1%雙氧水，充分反應(yīng)，標(biāo)記為樣品管。3支試管為1組，同時(shí)37℃下水浴1 h，于波長(zhǎng)536 nm處測(cè)定吸光度值，分別記錄為A未、A損、A樣。重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值，計(jì)算清除率，以抗壞血酸為對(duì)照品。清除率=(A樣-A損)/(A未-A損)×100%。

2.4.4 還原能力(FRAP)測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的配制：吸取500μl系列濃度為25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、150μmol/L、300μmol/L、450μmol/L、600μmol/L、750μmol/L、900μmol/L、1500μmol/L的硫酸亞鐵溶液，與3.5 ml的TPTZ工作液充分混合，在37℃下水浴10 min，于波長(zhǎng)593 nm測(cè)定吸光度。重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值。以硫酸亞鐵溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

配制200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml的樣品溶液和抗壞血酸溶液。配制：以0.3 mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH=3.6)，0.02 mol/L的三氯化鐵溶液，0.01 mol/L的TPTZ溶液(用10%的鹽酸溶解)，按照10∶1∶1的比例配制TPTZ工作液。準(zhǔn)確吸取樣品溶液0.5ml和工作液3.5 ml，在水浴37℃下反應(yīng)10 min，于波長(zhǎng)593 nm測(cè)定吸光度。重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值。計(jì)算還原能力強(qiáng)弱。根據(jù)測(cè)得的A值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求得相應(yīng)的硫酸亞鐵濃度(μmol/L)，定義為FRAP值，F(xiàn)RAP值越大，抗氧化活性越強(qiáng)。

2.4.5 總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定：按照總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒A015(南京建成生物工程研究所)試劑配制步驟，配制各工作液。配制濃度為200μg/ml的70 %乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物及抗壞血酸溶液。配制對(duì)照管和測(cè)定管溶液，充分混勻，放置10 min，在516 nm處測(cè)定吸光值，用無(wú)水乙醇調(diào)零，VC作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定其吸光度值。每樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，求平均值。按以下公式計(jì)算總抗氧化能力。計(jì)算公式：總抗氧化能力(U/ml)=(測(cè)定管OD-對(duì)照管OD)×反應(yīng)液(ml)×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)÷0.01÷30÷取樣量(ml)。

結(jié) 果

1 總黃酮總酚含量 以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=1.4986X-0.0005(R2=0.9999)，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=14.242X+0.014(R2=0.9990)。將測(cè)得的各相對(duì)應(yīng)吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，得出總黃酮、總酚的含量。結(jié)果見(jiàn)圖1,圖2。正丁醇提取物中總黃酮含量最高，為45.62 mg/g，乙酸乙酯的總黃酮含量也較高，總黃酮含量為正丁醇>乙酸乙酯>70%乙醇>水>氯仿；乙酸乙酯提取物中總酚含量最高，為106.05 mg/g，總酚含量為乙酸乙酯>正丁醇>70%乙醇>水>氯仿。結(jié)果，乙酸乙酯最適合提取窩兒七中的總黃酮總酚。

2 抗氧化活性

2.1 DPPH自由基清除能力:由圖2可知，各提取物的抗壞血酸的清除率均與其質(zhì)量濃度呈一定的正相關(guān)。各提取物中，乙酸乙酯在250 μg/ml時(shí)清除率達(dá)95.61%，抗壞血酸清除能力最強(qiáng)；在150～250 μg/ml之間，乙酸乙酯提取物，70%乙醇提取物，正丁醇提取物的清除能力比較接近，在50～250 μg/ml之間，清除能力是乙酸乙酯>正丁醇>70%乙醇>水>氯仿。

2.2 ABTS自由基清除能力:由圖3可知，在質(zhì)量濃度為1000μg/ml時(shí)，乙酸乙酯提取物的清除能力為87.86%，ABTS自由基清除能力最強(qiáng)。70%乙醇提取物的清除能力為42.14%，正丁醇提取物的清除能力為34.00%，氯仿提取物的清除能力為35.57%，三種提取物的ABTS自由基清除能力比較接近。水提物的清除能力為24.43%，水提取物的自由基清除能力表現(xiàn)為最弱。

圖1 總黃酮總酚含量

圖2 各提取物的DPPH自由基清除能力

2.3 羥自由基清除能力: 由圖4可知，各提取物的羥自由基清除能力隨質(zhì)量濃度的增大而呈不同程度的上升，其中乙酸乙酯提取物的羥自由基清除能力最強(qiáng)，在質(zhì)量濃度600～800 μg/ml時(shí)，清除能力從2.45%上升到77.37%；在質(zhì)量濃度2000 μg/ml時(shí)清除能力，正丁醇>70%乙醇>氯仿，分別為45.74% 、22.72%和3.73%。羥自由基清除能力最弱的是水提物，在質(zhì)量濃度4000 μg/ml時(shí)清除率僅為9.37%，直到濃度在8000 μg/ml時(shí)清除率上升到53.48%?？傊煌崛∥锏牧u自由基清除能力是乙酸乙酯>正丁醇>70%乙醇>氯仿>水。

2.4 還原能力(FRAP)測(cè)定:還原能力用FRAP值表示，F(xiàn)RAP值越大，抗氧化活性越強(qiáng)，還原能力越強(qiáng)。FRAP值是與吸光度值A(chǔ)相關(guān)。由圖5可知，硫酸亞鐵濃度(μmol/L)與吸光度值A(chǔ)呈正相關(guān)，故硫酸亞鐵濃度越高，吸光度值A(chǔ)越大，F(xiàn)RAP越強(qiáng)。由圖6可知，各提取物的還原能力與質(zhì)量濃度呈明顯的正相關(guān)。在質(zhì)量濃度1000 μg/ml時(shí)，乙酸乙酯、70%乙醇、氯仿、正丁醇、水提物的吸光度值分別為1.0316、0.7098、0.5787、0.4680、0.4451，乙酸乙酯提取物的還原能力最強(qiáng)。在質(zhì)量濃度(200～1000 μg/ml)的范圍內(nèi)，乙酸乙酯提取物的吸光度值從0.3113上升至1.0316，還原能力顯著增加；氯仿、正丁醇、水提取物的還原能力相互接近，其中水提物的還原能力最弱。

2.5 總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定:由圖7可知，窩兒七不同溶劑提取物總抗氧化能力大小順序?yàn)椋阂宜嵋阴ヌ崛∥?30.22U/ml)>正丁醇提取物(19,27U/ml)>70%乙醇提取物(15.42U/ml)>水提取物(11.72U/ml)>氯仿提取物(7.4U/ml)，而陽(yáng)性對(duì)照VC的總抗氧化能力為47.83U/ml。乙酸乙酯提取物的總抗氧化能力最高，氯仿提取物總抗氧化能力最低。

圖7 總抗氧化能力(T-AOC)

2.6 各提取物的EC50:設(shè)定清除率達(dá)50%或吸光度值達(dá)0.5時(shí)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為EC50。見(jiàn)表1。DDPH自由基清除能力：乙酸乙酯>正丁醇>70%乙醇>水>氯仿；ABTS自由基清除能力：乙酸乙酯>70%乙醇>正丁醇>氯仿>水；羥自由基清除能：乙酸乙酯>正丁醇>70%乙醇>氯仿>水；還原能力：乙酸乙酯>70%乙醇>氯仿>正丁醇>水。

表1 EC50測(cè)定結(jié)果(μg/ml)

討 論

窩兒七中的黃酮類(lèi)化合物和酚類(lèi)化合物，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣，難以用單一機(jī)制來(lái)闡釋,并且其生物體內(nèi)自由基的種類(lèi)各異，作用機(jī)理也不同，相對(duì)應(yīng)抗氧化活性也會(huì)有所差異。故選擇了多種抗氧化測(cè)定方法，對(duì)窩兒七的活性進(jìn)行了盡可能全面、客觀(guān)地評(píng)價(jià)與分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正丁醇提取總黃酮類(lèi)化合物最好，乙酸乙酯提取總黃酮也比較好，乙酸乙酯更易于總酚類(lèi)化合物的提取，可能是黃酮類(lèi)常與各種糖類(lèi)形成苷類(lèi)化合物，和總酚都易溶于乙酸乙酯有關(guān)。窩兒七的5種不同溶劑的提取物，都具有一定的抗氧化活性，呈現(xiàn)量效關(guān)系，其中乙酸乙酯的提取物，在DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、羥自由基清除力、還原能力、總抗氧化能力中，抗氧化能力最強(qiáng)，這與其提取的總黃酮總酚含量高有關(guān)，而且總黃酮總酚可以為體內(nèi)自由基提供單電子，使其達(dá)到化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定狀態(tài)，清除體內(nèi)多余的活性自由基，從而達(dá)到抗氧化的功效。綜上所述，窩兒七的乙酸乙酯提取物最多，抗氧化活性最強(qiáng)，乙酸乙酯可作為抗氧化活性物質(zhì)提取的最佳溶劑，通過(guò)進(jìn)一步萃取分離，追蹤其天然抗氧化活性單體物質(zhì)，為窩兒七的進(jìn)一步應(yīng)用擴(kuò)大方向。