七氟烷調(diào)節(jié)CARMA3靶向NF-κB通路抑制胃癌細(xì)胞遷移、侵襲

賈秀萍,陳曉貞,樓群兵,周振鋒,高 亮,周鵬飛

賈秀萍,陳曉貞,樓群兵,義烏市中心醫(yī)院麻醉科 浙江省義烏市322000

周振鋒,浙江省人民醫(yī)院麻醉科 浙江省杭州市 310000

高亮,周鵬飛,浙江省人民醫(yī)院腫瘤科 浙江省杭州市 310000

核心提要: 七氟烷可以抑制胃癌(gastric cancer,GC)細(xì)胞的遷移和侵襲,其中的作用機(jī)制與下調(diào)CARMA3失活NFκB通路有關(guān). 七氟烷有望成為治療GC的新藥物.

0 引言

胃癌(gastric cancer,GC)是消化道常見癌癥之一,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)位居第四,僅2012年診斷出95.2萬新病例,且新增病例數(shù)呈逐年增加趨勢(shì)[1]. 近年來GC的早期篩查和治療技術(shù)有較大提高,但其預(yù)后仍不佳. 目前臨床上仍迫切需要尋找能夠診斷和治療GC的新型藥物.七氟烷(Sevoflurane)作為一種吸入麻醉藥,憑借其麻醉誘導(dǎo)簡單、平穩(wěn)的優(yōu)點(diǎn)在臨床上廣泛應(yīng)用. 報(bào)道顯示,七氟烷吸入法用于老年GC根治手術(shù)患者麻醉,對(duì)患者的血流動(dòng)力學(xué)影響小,術(shù)后患者蘇醒質(zhì)量高[2,3]. 七氟烷可調(diào)節(jié)乳腺癌[4]、前列腺癌[5]、膠質(zhì)瘤[6]、肺癌、腎癌[7]的癌細(xì)胞發(fā)展. 黎真真等[8]報(bào)道,七氟烷可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲. 但七氟烷對(duì)GC細(xì)胞遷移、侵襲的作用機(jī)制尚未完全闡明. 含半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域的膜相關(guān)鳥苷酸激酶蛋白(coactivator-associated arginine methyltransferase,CARMA)蛋白家族有三個(gè)成員,分別為CARMA1、CARMA2、CARMA3. 該家族三成員均廣泛參與調(diào)節(jié)各種疾病的發(fā)生發(fā)展[9]. CARMA3在乳腺癌[10]、卵巢癌[11]、結(jié)直腸癌[12]、腎癌[13]、膀胱癌[13]、胰腺癌等[14]癌組織均高表達(dá),且與癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切. CARMA3調(diào)節(jié)乳腺癌、大腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移,其機(jī)制與激活NF-κB有關(guān)[15-17].而NF-κB與細(xì)胞增殖分化、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、上皮-間充質(zhì)化和腫瘤血管生成密切相關(guān)[18]. CARMA3可促進(jìn)GC細(xì)胞增殖、抑制凋亡[19]. 但CARMA3對(duì)GC細(xì)胞遷移、侵襲的作用機(jī)制尚未完全清楚. 本研究擬以人GC細(xì)胞SGC7901為研究對(duì)象,觀察七氟烷、沉默CARMA3、過表達(dá)CARMA3對(duì)GC細(xì)胞遷移、侵襲的影響,其機(jī)制可能與失活NF-κB通路有關(guān),可為七氟烷用于GC的臨床治療提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 人GC細(xì)胞SGC7901購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫; 信號(hào)通路特異性激活劑PMA、信號(hào)通路特異性抑制劑PTDC、pcDNA 3.1、siCARMA3、Matrigel基質(zhì)膠購自美國Invitrogen公司; Transwell小室購自美國Coming公司; PVDF膜、LipofectamineTM2000脂質(zhì)體、SDSPAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購于碧云天公司; DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、BCA蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于大連Takara公司; 半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國BIO-RAD公司; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國ABI公司; 紫外分光光度計(jì)購自美國Thermo公司; 細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司; PCR儀購自美國BIO-RAD公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng): 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)GC細(xì)胞SGC7901,于37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng). 每2-3 d更換培養(yǎng)液或消化傳代一次.

1.2.2 轉(zhuǎn)染: 將siCARMA3、siControl、pcDNA 3.1-CAR MA3和pcDNA 3.1用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染GC細(xì)胞SGC7901,分別標(biāo)記為siCARMA3組、NC組、CARMA3組、Vector組. 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)、Western blot實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn).

1.2.3 Transwell: 取適量對(duì)數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)/孔接種于6孔板,常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%,更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜. 調(diào)整各組細(xì)胞密度為105個(gè)/mL,取100 μL加入上室內(nèi),600 μL含血清的培養(yǎng)基加入下室內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)過夜. 取出小室,用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞,PBS洗滌2次,甲醇固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,PBS洗滌2次. 顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細(xì)胞,隨機(jī)取5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù),取平均數(shù).

將小室的上室涂適量基質(zhì)膠后再加入100 μL適當(dāng)密度的轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞,其他操作與檢測(cè)細(xì)胞遷移數(shù)一樣,最后顯微鏡下觀察小室下表面附著的細(xì)胞數(shù)量,隨機(jī)取5個(gè)視野拍照計(jì)算,取平均值.

1.2.4 qRT-PCR: 取適量對(duì)數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞,Trizol裂解液裂解細(xì)胞,RNA抽提試劑盒提取RNA,并進(jìn)行分光光度計(jì)定量. 立即用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,qRT-PCR試劑盒進(jìn)行CARMA3 mRNA的檢測(cè),以2-△△Ct法計(jì)算定量結(jié)果. 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.5 Western blot: 取適量對(duì)數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞,RIPA裂解后,提取總蛋白,BCA法蛋白定量后變性,然后進(jìn)行SDS蛋白電泳,之后進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉2 h,然后用Ⅰ抗,4 ℃孵育過夜. 次日,洗膜后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗37 ℃孵育2 h. 結(jié)束后加入顯影混合液,顯影曝光. 以GADPH為內(nèi)參,以目的條帶灰度值與GADPH灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)情況.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析. 計(jì)量資料用mean±SD表示,多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩兩數(shù)據(jù)比較采用SNK-q檢驗(yàn),以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 七氟烷抑制GC細(xì)胞遷移、侵襲 運(yùn)用Transwell法檢測(cè)不同濃度七氟烷處理的GC細(xì)胞的細(xì)胞遷移、侵襲量. 高劑量組、中劑量組、低劑量組于對(duì)照組,細(xì)胞遷移量均顯著降低,高劑量組于中劑量組,細(xì)胞遷移量顯著降低(圖1A和B); 高劑量組、中劑量組、低劑量組于對(duì)照組,細(xì)胞侵襲量均顯著降低,高劑量組于中劑量組,細(xì)胞侵襲量顯著降低(圖1A和C). 可見,七氟烷抑制為癌細(xì)胞遷移、侵襲且呈濃度依賴性.

2.2 七氟烷抑制GC細(xì)胞中CARMA3表達(dá) 運(yùn)用qRTPCR法檢測(cè)不同濃度組GC細(xì)胞中CARMA3 mRNA表達(dá),高劑量組、中劑量組、低劑量組于對(duì)照組,CARMA3 mRNA表達(dá)均為顯著降低,高劑量組于中劑量組,CARMA3 mRNA表達(dá)顯著降低(圖2A); CARMA3蛋白表達(dá)均顯著降低,高劑量組于中劑量組,CARMA3蛋白表達(dá)顯著降低(圖2B). 可見,七氟烷抑制GC細(xì)胞中CARMA3表達(dá).

2.3 CARMA3對(duì)GC細(xì)胞遷移、侵襲的影響 si-CARMA3組于NC組,SGC7901細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)均顯著降低,CARMA3組于NC組,細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)均顯著升高(圖3A和B). CARMA3于Vector組細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)均顯著升高(圖3A和B),均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05). 可見,沉默CARMA3抑制GC細(xì)胞遷移、侵襲,過表達(dá)CARMA3促進(jìn)GC細(xì)胞遷移、侵襲.

2.4 CARMA3靶向NF-κB信號(hào)通路 運(yùn)用Western blot檢測(cè)si-CARMA3組、CARMA3組GC細(xì)胞中p-p65、p65蛋白表達(dá). si-CARMA3組于NC組,p-p65蛋白表達(dá)顯著降低(圖4A和B),p65蛋白表達(dá)差異不顯著(圖4A和C);CARMA3組于NC組,p-p65蛋白表達(dá)顯著降低(圖4A、B),p65蛋白表達(dá)差異不顯著(圖4A和C),均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05). 可見,CARMA3靶向NF-κB信號(hào)通路.

2.5 NF-κB通路對(duì)GC細(xì)胞遷移、侵襲的影響 將用1 μmol/L的NF-κB通路激活劑處理48 h的GC細(xì)胞標(biāo)記為PMA組,用20 μmol/L的NF-κB通路抑制劑處理48 h的GC細(xì)胞標(biāo)記為PTDC組. PMA組于NC組,細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)均顯著升高(圖5A和B),PTDC組于NC組,細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)均顯著降低(圖5A和B),均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05). 可見,NF-κB的活性與GC細(xì)胞遷移、侵襲量成正相關(guān).

圖2 七氟烷抑制胃癌細(xì)胞中CARMA-3表達(dá). A: 不同濃度七氟烷對(duì)胃癌細(xì)胞中CARMA3 mRNA表達(dá)的影響(對(duì)照: 1.01±0.04; 低劑量組:0.77±0.09; 中劑量組: 0.57±0.05; 高劑量組: 0.35±0.08); B: 不同濃度七氟烷對(duì)胃癌細(xì)胞中CARMA3蛋白表達(dá)的影響(對(duì)照組: 1.01±0.04; 低劑量組: 0.77±0.10; 中劑量組: 0.55±0.05; 高劑量組: 0.35±0.08); aP＜0.05,與對(duì)照組比較; cP＜0.05,與中劑量組比較.

圖3 CARMA3對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響. A: 不同處理方式對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移量的影響(NC: 318.33±22.29; si-CARMA3: 178.00±14.97; Vector: 311.00±24.91; CARMA3: 414.00±13.95); B: 不同處理方式對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞侵襲量的影響(NC: 174.67±5.73; si-CARMA3:78.67±8.58; Vector: 177.67±17.17; CARMA3: 274.67±13.27); aP＜0.05,與NC組比較; cP＜0.05,與Vector組比較.

圖4 CARMA3靶向NF-κB信號(hào)通路. A: 不同處理方式對(duì)胃癌細(xì)胞中p-p65、p65蛋白表達(dá)的影響; B: 不同處理方式對(duì)胃癌細(xì)胞中p-p65蛋白表達(dá)量的影響(NC: 1.05±0.13; si-CARMA3: 0.31±0.07; CARMA3: 0.80±0.62); C: 不同處理方式對(duì)胃癌細(xì)胞中p65蛋白表達(dá)量的影響(NC:1.04±0.09; si-CARMA3: 1.05±0.12; CARMA3: 0.97±0.04); aP＜0.05,與NC組比較.

2.6 七氟烷可調(diào)節(jié)靶向NF-κB信號(hào)通路的CARMA3抑制GC細(xì)胞遷移、侵襲 將用七氟烷處理過的Vector組、CARMA3組、CARMA3+PBS組和CARMA3+PTDC組與未做任何處理的NC組相比,Vector組細(xì)胞遷移量、侵襲量均顯著降低; CARMA3組與Vector組相比,細(xì)胞遷移量、侵襲量均顯著升高; CARMA3+PTDC組與CARMA3+PBS組相比,細(xì)胞遷移量、侵襲量均顯著降低(圖6A和B),均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05). 可見,七氟烷可調(diào)節(jié)靶向NF-κB信號(hào)通路的CARMA3抑制GC細(xì)胞遷移、侵襲.

圖5 NF-κB通路對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響. A: NF-κB通路對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移量影響(NC: 308.67±23.80; PMA: 411.00±13.14;PTDC: 178.00±14.97); B: NF-κB通路對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞侵襲量影響(NC: 168.67±13.72; PMA: 255.33±6.60; PTDC: 87.67±8.18),aP＜0.05,與NC組比較.

圖6 七氟烷可調(diào)節(jié)靶向NF-κB信號(hào)通路的CARMA3抑制胃癌細(xì)胞遷移、侵襲. A: 不同處理組對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移量影響(NC:307.33±7.54;Vector: 170.00±12.83; CARMA3: 359.00±12.83; CARMA3+PBS: 358.67±18.79; CARMA3+PTDC: 274.33±12.47); B: 不同處理組對(duì)胃癌細(xì)胞的細(xì)胞侵襲量影響(NC: 173.00±8.83; Vector: 79.33±3.68; CARMA3: 214.33±5.31; CARMA3+PBS: 213.67±8.65; CARMA3+PTDC: 135.33±7.41);aP＜0.05,與NC組比較; cP＜0.05,與Vector組比較; eP＜0.05,與CARMA3+PBS組相比.

3 討論

七氟烷曾為吸入麻醉的里程碑藥物,其為維持兒童全麻的首選藥物[20]. 近幾年七氟烷在多種癌癥中的治療作用均得到證實(shí). 最近Yang等[21]在研究頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中發(fā)現(xiàn),七氟烷可抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡,激活HIF-1α途徑,揭示了七氟烷可降低HNSCC細(xì)胞的惡性行為,其機(jī)制與激活HIF-1α途徑有關(guān). 本研究運(yùn)用Transwell檢測(cè)不同濃度七氟烷處理的GC細(xì)胞的細(xì)胞遷移、侵襲發(fā)現(xiàn),七氟烷可抑制GC細(xì)胞遷移、侵襲,且呈濃度依賴性; 又運(yùn)用qRT-PCR、Western blot檢測(cè)七氟烷處理的GC細(xì)胞中CARMA3的mRNA、蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),七氟烷可抑制CARMA3表達(dá).

半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域的膜相關(guān)鳥苷酸激酶蛋白(CARMA)歸屬于膜相關(guān)鳥苷酸激酶(MAGUK)家族.MAGUK家族蛋白在特定的細(xì)胞膜區(qū)域具有組裝蛋白復(fù)合物的支架作用. CARMA的肽鏈末端有一個(gè)半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域,CARMA羧基末端有一個(gè)MAGUK區(qū)域(PDZ結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、GUK結(jié)構(gòu)域)[22]. GARMA蛋白家族的分布非常廣泛,但其家族成員間的分布具有一定特異性,CARMA3主要分布于心、肝、腎、膀胱、卵巢等器官組織中[23]. McAuley等[24]在研究CARMA3在實(shí)體腫瘤發(fā)病機(jī)制的作用中揭示,CARMA-Bcl 10-MALT1(CBM)信號(hào)通路在實(shí)體腫瘤細(xì)胞中具調(diào)節(jié)作用,而含有CARMA3的CBM復(fù)合物在G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)和生長因子受體酪氨酸激酶(PTKs)的下游起作用,GPCRs和PTKs的異常激活是大部分實(shí)體腫瘤發(fā)病機(jī)理的基礎(chǔ),闡明了CARMA3介導(dǎo)的信號(hào)通路在惡性腫瘤中具有重要意義. 劉枋等[25]在研究結(jié)腸癌時(shí),構(gòu)建敲減CARMA3基因的HCT116細(xì)胞,并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞增殖、凋亡、EMT、遷移、侵襲的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),敲減CARMA3可抑制細(xì)胞EMT、增殖、遷移、侵襲,揭示了CARMA3可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、EMT影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲,其機(jī)制與NF-κB通路有關(guān). 本研究運(yùn)用Transwell檢測(cè)了沉默CARMA3和過表達(dá)CARMA3的GC細(xì)胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)發(fā)現(xiàn),沉默CARMA3抑制GC細(xì)胞遷移、侵襲,過表達(dá)CARMA3促進(jìn)GC細(xì)胞遷移侵襲.

CARMA3在淋巴和非淋巴細(xì)胞中與Ikappa激酶γ/NFκB必需調(diào)節(jié)(IkappaKgamma-NEMO)物理結(jié)合,且CARMA3的NEMO結(jié)合區(qū)的表達(dá)失活Bcl10介導(dǎo)的NFκB[26]. Jiang等[16]研究EGFR激活NF-κB的作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn),CARMA3具有EGF誘導(dǎo)的NF-κB活化所必需的caspase募集域(CARD),敲減CARMA3抑制EGF刺激后IKK復(fù)合物的活化,導(dǎo)致EGF誘導(dǎo)的IκBα磷酸化和NFκB的失活,揭示CARMA3有助于體內(nèi)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移. Ekambaram等[27]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn),血管緊張素II受體(AGTR1)介導(dǎo)CARMA3-Bcl10-MALT1(CBM通路)信號(hào)通路的激活,促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,NF-κB的CBM依賴性激活促進(jìn)腫瘤血管生成,揭示AGTR1可激活CBM/ NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌的惡化. 本研究檢測(cè)了沉默CARMA3、過表達(dá)CARMA3對(duì)NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)發(fā)現(xiàn),沉默CARMA3可失活NFκB信號(hào)通路,過表達(dá)CARMA3可激活NF-κB信號(hào)通路;進(jìn)一步運(yùn)用通路激活劑PMA、通路抑制劑PTDC處理GC細(xì)胞發(fā)現(xiàn),NF-κB的活性與GC細(xì)胞遷移、侵襲量成正相關(guān),且過表達(dá)CARMA3的GC細(xì)胞與七氟烷、通路抑制劑PTDC共處理后可抑制GC細(xì)胞遷移、侵襲.

總之,七氟烷可抑制GC細(xì)胞遷移、侵襲,其機(jī)制可能與下調(diào)CARMA3失活NF-κB信號(hào)通路有關(guān),為七氟烷治療GC的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

七氟烷在多種癌癥中均可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲. 但七氟烷在胃癌(gastric cancer,GC)細(xì)胞中的作用機(jī)制國內(nèi)外尚未有人研究.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究旨在研究七氟烷對(duì)GC細(xì)胞遷移侵襲的影響,并探討其分子作用機(jī)制,以期望為解決GC治療的問題提供線索.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探討七氟烷抑制GC細(xì)胞遷移侵襲的作用,及其機(jī)制,以期為GC的治療提供新方向.

實(shí)驗(yàn)方法

將GC細(xì)胞SGC7901分成siCARMA3組(轉(zhuǎn)染siCARM A3)、NC組(轉(zhuǎn)染siControl)、CARMA3組(轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-CARMA3)、Vector組(轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1),用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲量; 用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中CARMA3 mRNA表達(dá); Western blot檢測(cè)細(xì)胞中CARMA3、p-p65、p65的蛋白表達(dá).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究成功構(gòu)建過表達(dá)CARMA3和沉默CARMA3的GC細(xì)胞發(fā)現(xiàn),GC細(xì)胞的遷移侵襲能力與CARMA3的表達(dá)量呈正相關(guān); 七氟烷能夠抑制GC細(xì)胞的遷移侵襲及CARMA3表達(dá),且CARMA3靶向NF-κB信號(hào)通路.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

七氟烷可抑制GC細(xì)胞遷移、侵襲,其可能與七氟烷下調(diào)CARMA3進(jìn)而失活NF-κB信號(hào)通路有關(guān),提示七氟烷可用于治療GC.

展望前景

本研究僅在體外研究七氟烷對(duì)GC細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用,后期還需增加七氟烷在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)GC轉(zhuǎn)移的研究實(shí)驗(yàn),以更清晰的展示七氟烷對(duì)GC的治療價(jià)值,也為七氟烷的臨床應(yīng)用提供更充分的理論依據(jù).