南京椴嫩枝扦插生根過程中植物激素的變化

史鋒厚 ，趙 瑞 ，羅 帥 ，鄭 晨 ，沈永寶

（1.南京林業(yè)大學 林學院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；3.浙江省浦江縣鄭家塢鎮(zhèn)政府，浙江 浦江 322206）

南京椴Tilia miquelianaMaxim.為我國特有椴樹屬樹種，綜合利用價值較高，曾廣泛分布于我國華東地區(qū)，現(xiàn)種群數(shù)量急劇下降，其繁殖以種子繁殖和根蘗為主，但種子飽滿度低且存在深休眠特性，根部萌蘗增殖系數(shù)不高[1]。扦插作為一種高效無性繁殖方法，可用于南京椴苗木繁殖，但椴樹屬樹種多屬于扦插難生根樹種，使用IBA處理嫩枝插穗可促進生根[2-3]。本文以南京椴嫩枝插穗作為研究材料，以外源IBA生長調(diào)節(jié)劑處理插穗，對扦插生根過程中插穗中植物激素含量及相關激素間比值進行動態(tài)測定，探究南京椴嫩枝扦插生根過程中植物激素變化特點及其對生根的影響。

1 材料與方法

1.1 插穗制備

5月23日清晨，由南京林業(yè)大學天王苗圃基地內(nèi)3 a生母樹上采集半木質(zhì)化枝條制作插穗，枝條采集、運輸、制穗過程中注意保濕。枝條采后及時制備插穗，插穗長度10～15 cm，上切口平截，下切口斜切，插穗上部保留2片l/2葉。插穗基部使用0.5% KMnO4溶液洗脫5 min，減少插穗分泌的粘液對生根的影響。

1.2 扦插

扦插在南京林業(yè)大學玻璃溫室扦插池中進行，溫室內(nèi)配有自動噴霧、遮陽和溫控系統(tǒng)；扦插基質(zhì)選用粒徑3 mm珍珠巖，厚度約15～20 cm。扦插前5天使用50%多菌靈可溶性粉劑800倍液對基質(zhì)進行噴灑消毒。扦插時，插穗基部使用1 000 mg·kg-1IBA粉劑處理，以未蘸取生根粉（IBA）處理作為對照，每處理50根，3次重復，另每處理扦插150根插穗用于取樣測定激素含量。扦插株行距5 cm×10 cm，扦插深度約為插穗長度的2/3。

1.3 插后管理

扦插后壓實插穗周邊基質(zhì)，并澆透水。根據(jù)氣溫、光照調(diào)節(jié)噴霧，以保持葉面濕潤為宜，溫室每天定時通風。待插穗生根后，逐漸減少噴霧量和增加光照。扦插后每隔7 d，使用50 %多菌靈可溶性粉劑800倍液噴灑插穗和基質(zhì)。

1.4 指標測定

扦插后每隔10 d取樣一次，每次取10根插穗（插穗明顯死亡的不取樣），共取5次。將插穗清洗干凈后，迅速刮取插穗基部2～3 cm韌皮部約5 g左右，剪碎放至-69 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。植物激素測定采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[4]。扦插后50 d，將各處理插穗取出，統(tǒng)計插穗生根率、腐爛率、生根數(shù)及平均根長、平均根粗等指標。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Mircrosoft Excel 2007分析數(shù)據(jù)并繪制指標變化圖，采用SPSS13.0軟件進行方差分析和Duncan多重對比。

2 結果與分析

2.1 IBA處理對南京椴嫩枝插穗扦插生根的影響

南京椴嫩枝插穗經(jīng)1 000 mg·kg-1IBA粉劑處理后，插穗生根率接近67 %，極顯著高于對照（CK），不定根生根數(shù)、不定根長和插穗腐爛率的控制均優(yōu)于對照處理（表1），說明使用1 000 mg·kg-1IBA粉劑處理可以顯著促進嫩枝插穗生根，提高插穗生根質(zhì)量并降低插穗腐爛率。

表1 南京椴嫩枝插穗扦插生根統(tǒng)計結果?Table 1 Statistical results of cuttage rooting and twig cutting of T.miqueliana

經(jīng)1 000 mg·kg-1IBA粉劑處理，插穗扦插5 d時，個別插穗開始出現(xiàn)少量透明狀腫大，形成愈傷組織。扦插10 d時，部分插穗下切口形成晶瑩透明的環(huán)帶狀愈傷組織，未被愈傷包裹的插穗基部變?yōu)楹谏?，插穗基部皮孔顏色開始變深并出現(xiàn)白色小突起。扦插20 d時，大多數(shù)插穗基部被愈傷組織完全包裹，部分插穗長出白色嫩根。扦插30 d時，多數(shù)未腐爛插穗萌生出幼嫩的白色不定根，大部分不定根由插穗切口處萌出，少量由愈傷組織團長出；由切口處長出的不定根相對粗壯，而由愈傷組織處長出的嫩根較柔弱；部分基部腐爛的插穗會產(chǎn)生高位不定根，但數(shù)量有限。扦插40 d時，已生根插穗的不定根數(shù)量繼續(xù)增多，不定根由白色開始變黃并陸續(xù)出現(xiàn)側根；一些完全被愈傷組織包裹的插穗雖未腐爛，甚至展出新葉，但仍無生根跡象。

椴樹屬樹木插穗多無潛伏根原基，扦插生根過程中誘導形成根原基[2]，推斷南京椴亦應屬于誘導根原基型，根據(jù)插穗生根形態(tài)觀察，可將其扦插生根過程劃分為愈傷組織形成期、根原基誘導期、不定根形成期和不定根生長期，大致對應于扦插后0～10 d、10～20 d、20～30 d和30～40 d。

2.2 南京椴扦插生根過程中插穗植物激素含量動態(tài)變化

南京椴嫩枝扦插生根過程中，經(jīng)IBA處理的插穗與對照組插穗皮部IAA含量、ZR含量、GA3含量和ABA含量變化，分別見圖1—4。

2.2.1 扦插生根過程中插穗皮部IAA含量變化

枝扦插生根過程中，插穗皮部IAA含量變化如圖1所示。經(jīng)IBA處理和對照組插穗在生根過程中，插穗皮部IAA含量均呈現(xiàn)“升高-降低”的變化趨勢，IAA含量峰值均出現(xiàn)在扦插后20 d，該時間節(jié)點正處于根原基誘導與不定根形成過渡期；插穗IAA含量到達峰值后，經(jīng)IBA處理的插穗內(nèi)IAA含量仍然維持在較高水平，直至不定根生長期開始下降。上述分析說明，經(jīng)IBA處理的插穗皮部IAA含量始終高于對照組插穗，分析原因在于外源IBA處理插穗后可在插穗內(nèi)部轉變?yōu)镮AA，插穗內(nèi)IAA含量的升高有利于根原基的誘導和不定根的發(fā)生，IAA促進扦插生根的作用機理恰是促進了根原基的誘導和不定根的發(fā)生；不定根生長期需要消耗更多的IAA，使得插穗內(nèi)IAA含量有所降低。

2.2.2 扦插生根過程中插穗皮部ZR含量變化

圖1 插穗皮部IAA含量變化Fig.1 Changes of IAA contents in the bark of cutting

南京椴嫩枝扦插生根過程中，插穗皮部ZR含量變化如圖2所示。扦插生根過程中，經(jīng)IBA處理插穗與對照組插穗皮部ZR含量變化趨勢相似，即前期下降較快，后期變化相對平緩，且對照處理變化相對滯后于IBA處理組。經(jīng)IBA處理的插穗皮部ZR在愈傷組織形成期便降至較低含量，并在根原基誘導期處于較低水平，至不定根發(fā)生和生長期再度升高。與對照相比，IBA處理插穗ZR含量在根原基誘導期處于較低水平，說明低濃度ZR有利于根原基的誘導；IBA處理后，可阻礙插穗內(nèi)ZR的合成或促使代謝加快，使其維持較低水平，有利于插穗生根；不定根發(fā)生和生長期，插穗內(nèi)ZR含量略微升高，說明這兩個時期細胞分裂增多，需要ZR的參與。

圖2 插穗皮部ZR含量變化Fig.2 Changes of ZR contents in the bark of cutting

2.2.3 扦插生根過程中插穗皮部GA3含量變化

南京椴嫩枝扦插生根過程中，插穗皮部GA3含量變化，如圖3所示。在插穗生根過程中，IBA處理和對照插穗皮部的GA3含量變化趨勢相似，均呈雙峰曲線，經(jīng)IBA處理的插穗GA3含量在扦插后20 d降至最低點。但經(jīng)IBA處理的插穗皮部GA3在插穗生根過程中始終低于對照，尤其在扦插后20 d時，低于對照55.8 %，此階段正是插穗根原基誘導及不定根形成的關鍵時期。南京椴插穗在根原基誘導與不定根形成過渡期，插穗內(nèi)GA3含量降至最低點，表明低濃度GA3有利于插穗不定根的發(fā)生和形成，而IBA處理有利于降低插穗內(nèi)GA3含量，促進插穗生根。

2.2.4 扦插生根過程中插穗皮部ABA含量變化

南京椴嫩枝扦插生根過程中，插穗皮部ABA含量變化，如圖4所示。經(jīng)IBA處理的插穗ABA含量在愈傷組織誘導期處于較穩(wěn)定水平，但在根原基誘導期和不定根形成期階段，插穗ABA含量基本呈下降趨勢；在扦插生根的整個過程中，經(jīng)IBA處理的插穗ABA含量均低于對照。南京椴扦插生根過程中，尤其在根原基誘導期和不定根形成期，插穗內(nèi)ABA含量均呈下降趨勢，且經(jīng)IBA處理的插穗內(nèi)ABA的含量處于較低水平，說明低濃度ABA有利于插穗根原基的誘導和不定根的發(fā)生；IBA處理可使插穗內(nèi)ABA含量降低，消除或降低阻礙插穗生根的因素，有利于促進插穗生根。

圖3 插穗皮部GA3含量變化Fig.3 Changes of GA3 contents in the bark of cutting

圖4 插穗皮部ABA含量變化Fig.4 Changes of ABA contents in the bark of cutting

2.3 南京椴扦插生根過程中插穗植物激素比值動態(tài)變化

南京椴嫩枝扦插生根過程中，經(jīng)IBA處理的插穗和對照插穗皮部IAA/ABA和IAA/ZR比值變化分別，見圖5和圖6。

2.3.1 扦插生根過程中插穗皮部IAA/ABA變化

由圖5可知，經(jīng)IBA處理的插穗扦插后，插穗IAA/ABA比值基本呈直線上升趨勢，至30 d時達到峰值，而后下降；對照插穗皮部IAA/ABA比值變化較為平緩，且始終低于IBA處理組。在不定根生長期，IBA處理組和對照組插穗皮部IAA/ABA比值均呈現(xiàn)下降趨勢。經(jīng)IBA處理的插穗，在愈傷組織形成期、根原基誘導期和不定根形成期，IAA/ABA比值始終升高，而對照插穗該比值卻維持較穩(wěn)定的水平，說明IBA處理有利于提高IAA/ABA比值，有利于促進插穗生根；結合插穗中IAA和ABA含量變化，IBA處理有利于提高插穗中IAA含量和降低ABA含量，促使IAA/ABA比值在愈傷組織形成期、根原基誘導期和不定根形成期始終處于持續(xù)升高的趨勢；插穗不定根生長期，IAA/ABA下降，說明其與不定根生長的關系不緊密。

圖5 插穗皮部IAA/ABA比值變化Fig.5 Changes of IAA/ABA ratio in the bark of cutting

2.3.2 扦插生根過程中插穗皮部IAA/ZR變化

由圖6可知，經(jīng)IBA處理的插穗扦插后，插穗皮部IAA/ZR比值在前20 d呈升高趨勢、在后20 d呈下降趨勢，即在愈傷組織形成期和根原基誘導期升高、在不定根形成期和不定根生長期降低；對照組IAA/ZR比值變化趨勢與IBA處理組相似；與對照相比，IBA處理插穗皮部IAA/ZR比值在愈傷組織形成期和根原基誘導期變化幅度更大且明顯高于對照。上述分析說明，扦插過程中尤其在愈傷組織形成期和根原基誘導期，IAA/ZR比值呈現(xiàn)升高的變化趨勢有利于扦插生根，IBA處理插穗促進生根的原因在于提高IAA含量并降低ZR含量，提高IAA/ZR比值。

圖6 插穗皮部IAA/ZR比值變化Fig.6 Changes of IAA/ZR ratio in the bark of cutting

3 討 論

3.1 插穗IAA含量變化與插穗生根的關系

扦插繁殖過程中，不定根的形成受制于多種因素，但生長素在不定根形成過程中起關鍵作用，高紅濱甚至認為扦插生根的難易主要取決于內(nèi)源IAA的含量[5]。IAA促進生根的作用機理主要為其作用于非常敏感的形成層等幼嫩部位的分生組織細胞，引起細胞分化和分裂，形成根原始細胞，影響再生初期蛋白質(zhì)合成的數(shù)量和質(zhì)量[6]。同時，IAA促進韌皮射線細胞、皮層薄壁細胞等脫分化產(chǎn)生愈傷組織。因此，生產(chǎn)中常采用可刺激插穗內(nèi)部形成IAA的IBA、NAA等生長調(diào)節(jié)劑處理插穗以促進生根。

南京椴嫩枝插穗在生根過程中，IBA處理與對照插穗內(nèi)IAA含量大致經(jīng)歷了“升高—降低”的變化趨勢。本實驗證實，使用IBA處理插穗可以促進IAA的生成，且IAA含量在扦插20 d時達到峰值，該時期正值根原基誘導期，說明IBA處理有助于根原基和不定根的誘導，這與王文鳳等、鄭先武等研究結論一致[7-8]。不定根形成時期（20～30 d），根系發(fā)育需要較多IAA，理論上IAA含量應下降，但由于IBA處理刺激了根原基生長點細胞的活性，誘導產(chǎn)生IAA，使得IAA含量處于相對穩(wěn)定的水平。對照插穗由于缺乏IBA刺激作用，插穗IAA含量始終低于IBA處理插穗，這正是對照組插穗生根率和生根質(zhì)量不佳的主要原因。

3.2 插穗ZR含量變化與插穗生根的關系

細胞分裂素對插穗生根具有影響作用，主要抑制根原基的分化和形成[9]；施用外源生長素可以促進插穗ZR代謝，降低其含量，有利于插穗生根[10]。

南京椴嫩枝扦插生根過程中，插穗ZR含量由開始扦插階段的快速下降之后維持較低水平，證實插穗ZR含量低有利于根原基的分化形成；使用IBA處理的插穗中ZR含量下降速度更快，表明外源生長素具有促進ZR代謝的作用，導致插穗中ZR含量下降，這與朱青松等研究結論相符合[10]。扦插后期，即不定根伸長期，插穗ZR含量開始緩慢升高，說明高濃度ZR對不定根的生長具有促進作用，這恰是該時期插穗根系生長旺盛的原因之一。

3.3 插穗GA3含量變化與插穗生根的關系

現(xiàn)有文獻報道，降低赤霉素含量有助于刺激插穗不定根的形成[11]，外施赤霉素明顯抑制插穗生根，原因在于赤霉素具有阻礙生長素誘導根原基發(fā)育的作用[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，南京椴嫩枝扦插生根過程中，插穗GA3含量分別在愈傷組織誘導期和不定根形成期出現(xiàn)峰值，表明GA3參與了愈傷組織的誘導和不定根的形成，且較高濃度的GA3有利于愈傷組織和不定根的誘導，這與劉桂豐等研究結論相符[13]。愈傷組織誘導期和不定根形成期是插穗新陳代謝相對旺盛、細胞分裂活躍的時期，需要赤霉素發(fā)揮作用，這也證實了關于赤霉素類物質(zhì)較多地存在于生長旺盛部位的結論[14]。本實驗中，插穗中GA3含量在根原基誘導期呈現(xiàn)降低趨勢并達到低點，說明GA3含量降低有利于誘導形成根原基，這與蒙海濤等的研究結論相符[11]。

3.4 插穗ABA含量變化與插穗生根的關系

插穗中ABA含量高不利于生根的結論已獲得公認，ABA通過抑制插穗潛伏根原基的分化而抑制插穗生根，并降低生根率[7,15-16]。

南京椴嫩枝扦插過程中，插穗ABA含量基本保持下降的趨勢，且IBA處理組插穗ABA含量明顯低于對照，說明使用IBA處理可以抑制插穗中ABA合成，ABA含量降低有利于插穗生根。扦插初期，ABA含量略微升高是由于制穗過程中的機械損傷所引起；經(jīng)IBA處理的插穗ABA峰值出現(xiàn)時間比對照遲約10 d，說明外源IBA可以抑制插穗內(nèi)ABA合成，有利于促進插穗生根，提高插穗生根率，這與胡虹等的研究結論相符合[17]。

3.5 插穗IAA/ABA、IAA/ZR比值變化與插穗生根的關系

激素影響插穗生根不僅與各類激素含量有關，還與激素間比值有關，甚至相關激素間比值在決定扦插生根過程中的作用更為明顯和重要，但不同樹種對于激素間比值的反應敏感度并不相同[18]?，F(xiàn)有文獻指出，IAA/ABA與扦插生根的關系更為密切，且相較于IAA和ABA含量與插穗生根的關系更具有說服力，IAA/ABA可作為評價插穗扦插生根難易的重要指標[15-16,19]；一般認為，IAA/ABA高，插穗生根能力較強[20]，插穗中IAA含量高且ABA含量較低有利于根原基的誘導，反之則抑制根原基的形成[21]。

南京椴嫩枝扦插愈傷組織形成期、根原基誘導期和不定根形成期，IAA/ABA不斷升高，并在不定根產(chǎn)生時達到最大值，插穗中IAA和ABA含量發(fā)生巨大變化的時期均處在不定根形成期，說明IAA/ABA比值高時有利于不定根的誘導與發(fā)生，這與程水源等研究結論相符合[22]。在此期間，IAA含量保持不斷上升的態(tài)勢，而ABA含量呈現(xiàn)減小趨勢，這與愈傷組織和不定根的形成有密切聯(lián)系；隨著不定根的不斷伸長，IAA/ABA比值才開始明顯下降，主要與IAA含量下降、ABA含量上升有關。本實驗中，外源IBA處理的南京椴插穗IAA/ABA比值均顯著高于對照，說明IBA可以調(diào)節(jié)插穗中IAA與ABA含量，并提高生根率。

現(xiàn)有文獻報道，IAA/ZR同樣對扦插生根產(chǎn)生影響作用[23]。本實驗中，IAA/ZR與IAA/ABA值的變化趨勢相似，IBA處理的插穗IAA/ZR明顯高于對照，并在誘導生根過程中呈不斷升高的趨勢，至后期不定根大量形成期，比值趨于穩(wěn)定。經(jīng)IBA處理的插穗IAA/ZR升高且明顯高于對照，說明IAA/ZR升高有利于根原基的誘導與不定根的生成，這與肖關麗等的研究結論一致[23]。

4 結 論

南京椴為扦插較難生根樹種，經(jīng)IBA處理的嫩枝插穗扦插生根率可達67%，證實IBA處理對于扦插較難生根樹種的促根效果明顯。植物激素作為生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，對于樹木生長發(fā)育具有重要影響，同樣影響樹木的扦插生根過程。南京椴嫩枝扦插過程中，IAA對于插穗根原基的誘導和不定根的發(fā)生具有較為直接的影響作用，其含量升高有利于扦插生根；GA3含量增加有利于根原基形成，而低水平GA3則更有利于不定根的生長；ABA和ZR含量升高不利于插穗生根，表現(xiàn)為抑制根原基的誘導和不定根的發(fā)生；IAA/ABA相比IAA/ZR與誘導生根關系更為密切，IAA/ABA變化與插穗中IAA與ABA含量之間此消彼長的動態(tài)變化有關，且呈現(xiàn)出與生根情況相符的變化規(guī)律，說明IAA、ABA在插穗根原基誘導和不定根形成過程中有一定的協(xié)調(diào)作用，插穗生根主要是由這兩種激素的平衡狀態(tài)來調(diào)控的，IAA/ABA可以作為衡量南京椴嫩枝扦插生根能力的指標。使用外源IBA粉劑處理南京椴嫩枝插穗有利于扦插生根的原因與插穗中激素含量以及激素間比值變化具有密切關系，外源IBA處理可以促進插穗內(nèi)IAA含量升高，調(diào)節(jié)ABA、ZR、GA3含量降低，促使IAA/ABA在誘導生根期快速增大，通過相關激素的調(diào)控，使插穗向有利于促進生根的生理狀態(tài)轉變。