姜黃素對過度訓練大鼠骨骼肌p38 MAPK的表達及抗氧化能力的影響

楊 棟，莫中成

過度訓練是一種大強度運動，可導致運動員骨骼肌組織中活性氧（reactive oxy gen species，ROS）的生成增加，細胞抗氧化和氧化平衡被破壞，骨骼肌發(fā)生過勞性損傷（常波 等，2014；肖衛(wèi)華 等，2014）。因此，運動過程中，如果機體的抗氧化能力得到改善，可有效預防訓練時骨骼肌損傷。

姜黃素（curcumin）是姜黃根中重要的活性成分之一，屬二酮類化合物，在抗炎、抗衰老、抗腫瘤、利膽、抗氧化等方面具有非常廣譜的生物學作用（鄭佳 等，2013；周瑤瑤 等，2016；Jin et al.，2015；Nagahama et al.，2015）。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以清除體內(nèi)的氧自由基，是一種高效抗氧化劑（池愛平 等，2006）。但在運動損傷中，姜黃素是否可以影響骨骼肌的氧化應激狀態(tài)仍不清楚。本研究以負荷游泳訓練創(chuàng)建過度訓練大鼠模型，觀察姜黃素對過度訓練大鼠骨骼肌抗氧化能力的影響，并探討其初步分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取7周齡Wistar雄性大鼠40只，平均體重為223.35±16.23 g，均由南華大學實驗動物部提供。所有大鼠均飼以基礎飼料和蒸餾水，常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。適應飼養(yǎng)3天以后，隨機分為4組：空白對照組（control group，CG）、有氧訓練組（aerobic training group，ATG）、過度訓練組（overtraining group，OG）、過度訓練+姜黃素干預組（overtraining and curcumin-treated group，OCG），每組10只。訓練時，每組大鼠自由攝食和飲水，OCG組每天以100 mg/kg姜黃素灌胃1次，其他組予以相應體積的生理鹽水灌胃作為對照。

1.2 試劑來源與訓練方案

姜黃素為Sigma公司分裝，TRIzol試劑、PVDF膜購自Invitrogen公司，擴增用引物由上海生工公司合成，逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自長沙佳和生物科技有限責任公司，p38 MAPK一抗及HRP標記的IgG二抗購自Abcam公司，SOD活性、MDA含量、 CK活性和 LDH活性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

訓練方案參考文獻進行（崔笑梅 等，2017），具體方案如下：CG組不進行任何運動訓練，ATG組每天進行無負重游泳訓練60 min。OG組和OCG組每天進行遞增負荷游泳運動，即第1～3周，不負重，只遞增運動時間以增加運動負荷（第1周5～30 min，第2周30～60 min，第3周60～120 min）；第4～6周固定運動時間并增加運動負荷量（第4周負荷1%～2%體重，第5周負荷2%～4%體重，第6周負荷4%～6%體重）。游泳用玻璃槽水深50 cm，溫度為31.0±2.0℃，箱底放置有水泵，防止大鼠靜止在水面。訓練期間，每周訓練6天，休息1天，全程共6周。

1.3 取材與檢測

大鼠于末次訓練結束后，經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈處取全血置抗凝管，取血清檢測血清睪酮，以評價大鼠過度訓練模型的建立情況。同時分離大鼠兩側的深層腓腸肌，冰PBS漂洗后置于超低溫保存?zhèn)溆?。采用分光光度法測定骨骼肌SOD活性及MDA含量，乙酰半胱氨酸法檢測血清中CK活性，苯肼顯色法檢測血清中LDH 活性，所有指標檢測均嚴格按試劑盒的操作說明執(zhí)行。

1.4 實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR） 檢測mRNA的含量

采用TRIZOL法常規(guī)提取組織總RNA，經(jīng)紫外線分光光度儀測定其OD260/OD280的比值在1.8～2.0之間，按試劑盒說明先進行逆轉錄，再以其cDNA產(chǎn)物進行實時熒光定量PCR。定量PCR反應按試劑盒說明書進行，采用25 μl的反應體系，其中含有SYBR green mix（2x） 12.5 μl，ddH2O 8.5 μl，cDNA 2μl，上下游引物各1 μl。擴增程序：95℃ 10 min，擴增循環(huán)95℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)，72℃采集熒光信號，每組重復實驗3次。

1.5 Western blot檢測蛋白質(zhì)的表達

采用RIPA裂解液常規(guī)裂解骨骼肌組織，以BCA法進行蛋白質(zhì)定量檢測，蛋白變性后以每孔20 μl的上樣量進行SDS-PAGE垂直電泳（分離膠濃度為10%），再經(jīng)半干電轉移至PVDF膜上，4%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗置于4℃冰箱搖床孵育過夜，取出后以0.1% Tween-PBS漂洗3次（每次5 min），再室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗1 h，經(jīng)0.1%Tween-PBS洗3次（每次5 min），最后以蛋白質(zhì)印跡發(fā)光檢測試劑盒顯示于Tanon化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)，計算分析蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（M±SD）表示，兩組間比較采用方差分析及t檢驗，采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，以P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果與分析

2.1 訓練結束后大鼠血清睪酮的變化

為期6周的訓練結束后，CG組、ATG組大鼠狀態(tài)正常，而OG組大鼠則表現(xiàn)出神態(tài)倦怠，易受驚嚇等癥狀。血睪酮水平是反映疲勞的消除和體現(xiàn)運動能力變化的重要指標，結果顯示，OG組的血清睪酮水平顯著下降（P＜0.05），提示大鼠過度訓練模型建立成功。而OCG組大鼠血清睪酮的水平有所上升（P＜0.05），提示姜黃素可以在一定程度上緩解過度訓練導致的大鼠血清睪酮水平的下降（圖1）。

圖1 各組大鼠血清睪酮水平的變化Figure 1. Changes of Serum Testosterone Levels in Each Group

2.2 姜黃素對過度訓練大鼠骨骼肌SOD活性和MDA含量，以及血清中CK和LDH活性的影響

訓練結束后，采用試劑盒分別檢測各組大鼠骨骼肌組織中SOD活性和MDA含量（表1），與CG組比較，ATG組大鼠的SOD、CK和LDH活性無顯著變化（P＞0.05），而OG組SOD活性顯著下降，CK和LDH活性則顯著上升（P＜0.05），但是增加姜黃素干預的OCG組大鼠SOD的活性明顯高于單純的OG組，而CK和LDH活性則低于單純的OG組（P＜0.05）。骨骼肌MDA的含量，ATG組與CG組無顯著差別（P＞0.05），但是OG組較CG組明顯升高（P＜0.05）；而與單純OG組比較，OCG組大鼠MDA的含量測顯著降低（P＜0.05）。

2.3 姜黃素對過度訓練大鼠骨骼肌p38 MAPK mRNA和蛋白表達的影響

訓練結束后，采用熒光定量PCR試劑盒檢測各組大鼠骨骼肌組織中p38 MAPK mRNA的表達含量（圖2），與CG組和ATG組比較，OG組大鼠的p38 MAPK mRNA的表達上調(diào)（P＜0.05）；而與OG組比較，增加了姜黃素干預的大鼠骨骼肌p38 MAPK mRNA的表達則下調(diào)（P＜0.05）。

圖2 姜黃素對過度訓練大鼠骨骼肌P38 MAPK mRNA表達的影響Figure 2. Effects of Curcumin on the Expression of p38 MAPK mRNA in Skeletal Muscle of Over-trained Rats

采用Western blotting檢測各組大鼠骨骼肌組織中p38 MAPK 蛋白的表達（圖3），與CG組和ATG比較，OG組大鼠p38 MAPK 蛋白質(zhì)的表達上調(diào)（P＜0.05）；而與OG組比較，增加了姜黃素干預的大鼠骨骼肌p38 MAPK蛋白質(zhì)的表達則下調(diào)（P＜0.05）。

表1 各組大鼠骨骼肌SOD活性和MDA含量以及血清中CK和LDH活性的變化Table 1 Changes of SOD Activity，MDA Content，CK Acitvity and LDH Activity in Skeletal Muscle of Rats （n=5）

3 討論

隨著競技體育競爭越發(fā)激烈，運動員訓練強度逐漸加大，更容易出現(xiàn)過度訓練導致運動員骨骼肌受損。因此，預防過度訓練所造成的損傷以及探討過度訓練導致骨骼肌損傷的機制成為運動醫(yī)學的重要研究領域（Gandra et al.，2012；Pereira et al.，2013）。本研究應用游泳訓練的方式建立過度訓練大鼠模型，檢測了反映過度訓練狀況的常用指標血清睪酮的水平。結果發(fā)現(xiàn)，OG組大鼠的血清睪酮水平顯著下降，說明大鼠出現(xiàn)了運動性疲勞低血睪酮水平，結合大鼠機體狀況的表現(xiàn)，證實過度訓練大鼠模型建立成功。

過度訓練導致?lián)p傷的機制較為復雜，目前尚無統(tǒng)一的認識。機體在過度訓練時，組織的耗氧量會增加，產(chǎn)生的氧自由基也會增加，這樣會使機體內(nèi)抗氧化劑及合成抗氧化酶的成分過度消耗，如果不能及時補充，就會引起機體抗氧化能力的下降，從而使氧自由基的清除能力減弱，進而損傷骨骼肌細胞的細胞器，從而影響運動能力（Merry et al.，2016；Shill et al.，2016）。因此，機體抗氧化能力的保護，是增加肌肉承受更大運動強度能力的一個關鍵因子。本研究中，過度訓練的大鼠SOD活性顯著降低，MDA含量增高，表明過度訓練可以降低大鼠骨骼肌的抗氧化能力，血清中CK和LDH 活性明顯增高，提示骨骼肌組織存在損傷。

圖3 姜黃素對過度訓練大鼠骨骼肌p38 MAPK 蛋白表達的影響Figure 3. Effects of Curcumin on the Expression of p38 MAPK Protein in Skeletal Muscle of Over-trained Rats

姜黃素提自于姜黃根，屬于姜科，是咖喱食品中的主要成分，被廣泛應用于傳統(tǒng)的中醫(yī)治療。姜黃素是姜黃根中具有治療活性的主要物質(zhì)之一，在骨骼肌損傷的保護過程中也有重要作用。吳珊等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能通過抑制炎性因子分泌及泛素-蛋白酶體關鍵分子表達，緩解免疫應激大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)降解。姜黃素可通過抑制NF-κB 表達，從而促進C2C12 骨骼肌細胞的增殖分化（魏連波 等，2015）。高超等（2017）認為，姜黃素對小鼠急性游泳訓練導致的骨骼肌損傷具有保護作用，其機制主要是通過其抗氧化作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素結構中富含酚羥基，可通過抑制氧化酶、激活和保護抗氧化酶系等方式，清除氧自由基，進而保護細胞膜結構和功能，減輕細胞損傷。本研究中，在建立過度訓練大鼠模型的基礎上，采用了姜黃素干預。結果發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以提高過度訓練大鼠骨骼肌SOD的活性，降低MDA含量及血清中CK和LDH 的活性，提示姜黃素在一定程度上可以提高過度訓練損傷后骨骼肌的抗氧化能力，并對骨骼肌的疲勞性損傷產(chǎn)生緩解作用。

MAPK是細胞內(nèi)重要的蛋白激酶之一，其介導的信號通路可以將胞外刺激信息傳導至胞核內(nèi)，調(diào)控基因的轉錄和表達，從而參與細胞的多種生物學功能。p38 MAPK是MAPK家族的重要一員，有研究發(fā)現(xiàn)，過度的氧自由基聚積可以激活p38 MAPK，從而活化MAPK系統(tǒng)，進而影響骨骼肌細胞的功能（李琳燕，2011；Martinez et al.，2016）。本研究檢測了p38 MAPK的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，OG組大鼠骨骼肌組織p38 MAPK的mRNA和蛋白表達上調(diào)，而應用姜黃素干預后，在一定程度上可以使大鼠骨骼肌組織p38 MAPK的mRNA和蛋白表達下調(diào)，提示p38 MAPK在過度訓練所致的大鼠骨骼肌損傷中有一定的作用，而且參與了姜黃素對骨骼肌疲勞性損傷的緩解作用。

4 結論

過度訓練可以導致骨骼肌組織抗氧化能力下降，造成骨骼肌疲勞性損傷，而應用姜黃素干預后，可以有效緩解過度訓練所導致的機體氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡，并下調(diào)p38 MAPK的表達，提高抗氧化能力，從而緩解運動性疲勞的發(fā)生與發(fā)展。