人巨細胞病毒活動性感染與自然流產(chǎn)的相關機制研究

柯 旭，趙衛(wèi)東，李 靜，周榮生

自然流產(chǎn)( spontaneous abortion)為孕婦妊娠不滿28周、胎兒體重不足1 kg時自然終止的妊娠[1]。近年來，研究[2-3]顯示妊娠早期流產(chǎn)的病因十分復雜，除了遺傳因素、感染、內分泌、生殖器官結構異常等病因外，仍有近半數(shù)的自然流產(chǎn)無法查出病因。目前，臨床中對于自然流產(chǎn)的原因尚不十分清晰。病原體感染是自然流產(chǎn)的重要因素之一，有文獻[4-5]報道主要已知的病原體感染如單純皰疹、人支原體、弓形蟲、巨細胞病毒(cytomegalovirus, cMV))等均與流產(chǎn)有關。人巨細胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)是造成宮內感染的主要病毒[6]。越來越多的研究[7]表明，自然流產(chǎn)孕婦的HCMV感染率明顯高于正常孕婦。但目前HCMV導致宮內感染及引起自然流產(chǎn)的具體機制和途徑尚不清楚。已有研究[8]表明，免疫應答能夠激活外周血單核細胞中的HCMV，誘發(fā)自身免疫性疾病的發(fā)生。該研究通過檢測62例自然流產(chǎn)孕婦的外周血，探討HCMV活動性感染與自然流產(chǎn)關系機制，進一步為臨床治療預防流產(chǎn)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1病例資料

1.1.1病例組 根據(jù)如下納入和排除標準收集來合肥市第三人民醫(yī)院就診的自然流產(chǎn)孕婦62例作為病例組，所有研究對象符合2004年《婦產(chǎn)科學》的診斷標準[9]；病例組年齡為21～34(26.47±7.43)歲，孕周為7～14周，平均孕周(10.65±3.62)周；納入標準：① 病例組孕婦經(jīng)臨床檢查，均符合2004年《婦產(chǎn)科學》的診斷標準[9]；② 孕婦生殖器結構正常，無染色體異常和內分泌疾??；③ 孕婦和家屬了解本研究內容，簽署知情同意書。排除標準：① 因生殖器結構異常、遺傳因素、內分泌因素造成的自然流產(chǎn)患者；② 惡性腫瘤患者；③ 孕期曾使用過導致胚胎異常的藥物；④ 由于各種原因難以配合研究進行的患者。根據(jù)cMV-IgM的檢測結果對自然流產(chǎn)孕婦進行分組。其中，cMV-IgM陽性患者為HCMV活動性感染組，cMV-IgM陰性患者為HCMV非活動性感染組。

1.1.2對照組 選擇同期體檢正常孕婦51例作為對照組。對照組年齡為22～34(26.68±7.32)歲，孕周為7～15周，平均孕周(10.73±3.27)周。研究對象的主要基線指標如年齡、孕周等，經(jīng)檢驗兩組基本平衡(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1標本采集 抽取所有孕婦的清晨空腹靜脈血4 ml，分為兩管，每管2 ml。其中一管加入溶血試劑，待提取全血DNA。另一管，靜置5 min后，進行4 ℃離心，2 000 r/min離心15 min，留取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2檢測方法

1.2.2.1抽提全血DNA進行HCMV-DNA表達水平檢測 采用酚氯仿抽提法提取全血DNA，PCR體外擴增HCMV-DNA，PCR反應采用Tap DNA聚合酶，擴增片段430 bp，操作完全按照實際說明書進行。全血DNA的抽提步驟如下：① 全血1 300 r/min離心15 min；② 將上層白細胞吸到1.5 ml離心管中，加滅菌過的純水至1.5 ml刻度，4 ℃、4 000 r/min離心15 min；③ 去上層血清，加無菌水1 ml溶血；④ 4 ℃、3 500 r/min離心10 min，重復3次；⑤ 加TES 720 μl，RNAase A 5 μl，室溫靜置20 min(消化RNA)；⑥ 加入蛋白酶K(10 mg/ml)15 μl，56 ℃消化3～4 h，直至沒有肉眼可見的懸浮物；⑦ 加入等體積(740 μl)酚，翻轉10 min混勻；15 000 r/min離心15 min，吸取上層水相640 μl；⑧ 加入等體積(640 μl)酚，翻轉10 min混勻；15 000 r/min離心15 min，吸取上層水相520 μl；⑨ 加入等體積(520 μl)酚-氯仿-異戊醇，翻轉10 min混勻；17 000 r/min離心15 min，吸取上層水相400 μl；⑩ 加入3 mol/L 乙酸鈉(pH 5.2)40 μl(1/10體積)，加入880 μl(兩倍體積)的無水乙醇(-20 ℃預冷)，翻轉20次混勻，出現(xiàn)白色絮狀DNA沉淀。4 ℃、15 000 r/min離心10 min，小心倒掉上清液，在吸水紙上扣干殘液；加入70% 乙醇1 ml重懸沉淀，4 ℃、15 000 r/min離心5 min，小心倒掉上清液，在吸水紙上扣干殘液，用無菌棉簽擦拭離心管內壁，勿碰到DNA沉淀；打開管蓋，室溫靜置3 min，加純水40 μl，用移液槍吹洗5次混勻，室溫靜置10 min；測定濃度和A260/A280，-20 ℃保存。

1.2.2.2ELISA法檢測血清中cMV-IgM、 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6的表達水平 另一管外周血進行血清中cMV-IgM、TNF-α、IL-1、IL-6表達水平檢測，采用ELISA法進行檢測(試劑盒購自美國Genzyme公司)。ELISA法步驟如下：從4 ℃冰箱中取出人IL-1、IL-6和TNF-α ELISA檢測試劑盒，放在室內待其溫度與室內溫度達到平衡。配置不同濃度的標準品：向試劑盒中凍干標準品的試管加入1 ml的標準品及樣品稀釋液，室溫靜置10 min，待標準品凍干粉充分溶解后，輕輕搖勻即可得到濃度為1 000 pg/ml的標準品。將1 000 pg/ml的標準品在嚴格滅菌且無內毒素的試管進行倍比稀釋。稀釋成濃度依次為0、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000 pg/ml。將濃縮洗滌液、生物素化抗體和辣根過氧化物酶結合物稀釋成工作液，放置室溫中待用，同時將血清樣本放置室內平衡至室溫。本實驗中設置標準孔、待測樣本孔、空白孔，待測樣本孔中加入樣本稀釋液100 μl，標準孔和待測樣本孔需要添加對應的樣品100 μl，而空白孔中需要加對照樣品，輕輕搖晃使其混勻。用覆膜將酶標板覆蓋，放溫箱中37 ℃孵育60 min。溫箱取出酶標板，棄去液體，洗板機洗板5次，洗板結束后輕輕拍干使其沒有殘留的液體。每孔中加入稀釋后的酶結合物工作液100 μl，然后加上覆膜，恒溫箱37 ℃孵育30 min。溫箱取出酶標板，棄去液體，洗板機洗板5次，結束后輕輕拍干使其沒有殘留的液體。TMB底物溶液按每個孔都要加入100 μl，37 ℃恒溫箱顯色15 min。最后加入反應終止液每孔50 μl，停止反應，這時由藍色立即轉化成了黃色，每個待測樣本重復3孔，在450 nm波長處測量每個樣本對應3孔的吸光度(optical density, OD)值，取平均值并保存數(shù)據(jù)。

1.3病理染色收集組織固定于福爾馬林中，再流水沖洗過夜，經(jīng)過脫水包埋，制成石蠟組織塊，再進行組織切片、脫蠟水化、染色，最后進行脫水、透明、封片、拍照。通過HE染色觀察組織情況。HE染色步驟如下：① 將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色20 min；② 酸水及氨水中分色，10～15 s；③ 流水沖洗1 h后入蒸餾水2 min；④ 入70%和90%酒精中脫水各10 min；⑤ 入酒精伊紅染色液染色2～3 min；⑥ 純酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封固。

表1 病例組與對照組HCMV-DNA和cMV-IgM水平比較[n(%)]

與對照組比較：*P<0.05，***P<0.001

2 結果

2.1病例組與對照組HCMV-DNA和cMV-IgM水平比較病例組HCMV-DNA的陽性率(16.13%)高于對照組(3.92%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；cMV-IgM的陽性率(37.10%)也高于對照組(7.84%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表1。

2.2病例組與對照組炎性細胞因子水平比較病例組與對照組炎性細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6水平水平進行比較，結果顯示：病例組患者的血清TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表2。

表2 病例組與對照組炎性細胞因子水平比較

與對照組比較：***P<0.001

2.3HCMV活動性感染組與非活動性感染組炎性細胞因子水平比較根據(jù)檢測結果將流產(chǎn)孕婦分為HCMV活動性感染組與非活動性感染組，比較兩組炎性細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6水平的差異，結果顯示：活動性感染組的血清TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯高于非活動性感染組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表3。

表3 HCMV活動性感染組與非活動性感染組炎性細胞因子水平比較

與HCMV非活動性感染組比較：***P<0.001

2.4血清TNF-α、IL-1、IL-6水平與HCMV感染相關性的Logistic回歸分析以兩組孕婦資料為樣本，以是否有HCMV活動性感染為應變量，并賦值1=有此感染，0=否。建立非條件Logistic回歸模型。以血清TNF-α、IL-1、IL-6水平為自變量，并在回歸前均行兩分類轉化(轉化及賦值方法：1=≥對應指標的兩組總均值，0=<對應指標的兩組總均值)?；貧w過程采用后退法(α退出=0.05)，以進行自變量的選擇和剔除?；貧w結果顯示：TNF-α、IL-1、IL-6等三指標均被保留入回歸方程，其OR值均>1，P<0.05，提示該三指標(升高)均為HCMV活動性感染的危險影響因素?；貧w結果見表4。

表4 血清TNF-α、IL-1、IL-6水平與HCMV活動性感染的Logistic回歸分析

2.5HCMV感染表達陽性病理圖示例HCMV感染表達陽性的病理見圖1A～1D。圖1A組織取自蛻膜，可見組織中大量中性粒細胞浸潤，伴微小膿腫形成；圖1B組織取自絨毛，間質纖維組織輕度增生，絨毛間隙見出血，周圍滋養(yǎng)層細胞萎縮；圖1C組織取自蛻膜，可見蛻膜組織退變壞死；圖1D組織取自絨毛，呈現(xiàn)間隙明顯出血，絨毛體積小，周圍滋養(yǎng)層細胞萎縮。HCMV感染表達陰性的病理見圖1E、1F。圖1E、圖1F組織均取自絨毛，鏡下可見正常絨毛及滋養(yǎng)層細胞，絨毛間質無水腫及纖維化，間隙無出血及炎細胞浸潤。

3 討論

HCMV屬于皰疹病毒科β亞科，廣泛存在于人體中并能引起人體的多種疾病[7]。與其他皰疹病毒一樣，HCMV感染會在宿主體內的白細胞、唾液腺等處建立持續(xù)終身的潛伏感染，然而，該類感染對健康人體并沒有危害。但是，HCMV感染對免疫功能低下的個體，如胎兒、嬰幼兒、器官移植患者、艾滋病患者、干細胞治療患者以及使用免疫抑制劑的患者均可造成致死性損傷[5,10]。HCMV是目前已知引起孕婦和胎兒宮內感染的最常見、危害最大的一種病毒[11]。妊娠婦女感染HCMV是導致妊娠不良結局的重要因素之一[4-5]。HCMV可通過胎盤致使胎兒宮內感染，導致胎兒宮內發(fā)育遲緩、胎兒智力和聽力受損、死胎、流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸形、新生兒死亡等。目前，HCMV病毒感染引起流產(chǎn)已然引起了廣泛的重視。

圖1 HCMV感染表達陽性病理圖及陰性對照示例(HE染色)

然而，關于HCMV活動性感染導致孕婦流產(chǎn)的具體機制尚需不清楚。近年來，cMV感染作為一類全身感染性疾病，已被列為性傳播疾病，HCMV的感染可因妊娠免疫力低下而激活[12]。研究[13]表明，正常妊娠期間，母體機體處于免疫抑制狀態(tài)，輔助型T細胞2型(helper T cell 2, Th2)免疫應答具有優(yōu)勢，而HCMV感染可以調控轉錄因子GATA-3(GATA結合蛋白3)和T-bet(T- box基因家族轉錄因子)的表達，使GATA-3上調，T-bet下調，促進Th2型細胞的分化從而進一步抑制免疫功能。TNF-α是HCMV感染的免疫反應中的關鍵因子，可以激活病毒基因轉錄，活化HCMV增強子，上調HCMV基因表達，繼而促進一系列細胞因子分泌[12]。

本研究通過收集自然流產(chǎn)孕婦和同期體檢正常孕婦的外周血并進行相關檢測，結果表明：自然流產(chǎn)孕婦的HCMV-DNA和cMV-IgM的陽性率顯著高于對照組；自然流產(chǎn)孕婦血清中的炎性細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6的表達水平均顯著提高，說明自然流產(chǎn)孕婦存在著HCMV活動性感染。研究[14]顯示，免疫應答能夠激活外周血單核細胞中的HCMV，誘發(fā)自身免疫性疾病的發(fā)生，感染HCMV的孕婦會出現(xiàn)原因不明的復發(fā)性流產(chǎn)，誘發(fā)其自身出現(xiàn)免疫性疾病，需要采用免疫治療的方法進行治療。在妊娠過程中，細胞因子充當重要的輔助作用，當其含量出現(xiàn)異常時則表現(xiàn)為病理妊娠。IL-1、IL-6、TNF-α均與感染性疾病相關，過量的分泌將導致機體的免疫損傷。本研究對比了自然流產(chǎn)患者中HCMV活動性感染組與非活動性感染組的TNF-α、IL-1、IL-6表達水平差異，結果顯示上述炎性細胞因子在HCMV活動性感染組患者的水平明顯高于非活動性感染組，證明血清中TNF-α、IL-1、IL-6的表達水平與自然流產(chǎn)存在密切關聯(lián)，是HCMV活動性/自然流產(chǎn)狀態(tài)的危險影響因素。

綜上所述，HCMV活動性感染會抑制孕婦免疫功能，促使宮內感染，與孕婦自然流產(chǎn)關系密切。本研究將為闡明HCMV感染引起自然流產(chǎn)提供理論依據(jù)，同時，為臨床治療預防流產(chǎn)提供新的視角。