CD64在RA患者單核細胞中的表達及與TNF-α的相關性研究

黃自坤，黃清水，李 雪，鞠北華，羅 清

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種病因尚不明確的難治性的自身免疫性疾病，全世界每年的發(fā)病率為1%～3%，其主要特點是不可逆的關節(jié)滑膜炎癥和損傷[1]。越來越多的研究[2]表明單核細胞/巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等在多種層面上參與RA的致病。單核細胞/巨噬細胞可通過分泌大量的炎性細胞因子來維持RA患者的炎性環(huán)境以及招募大量的免疫細胞遷移至關節(jié)炎，導致關節(jié)不可逆的損傷。簇分化抗原64(cluster of differentiation antigen, CD64)是IgG Fc段受體Ⅰ(FcγRⅠ)，為高親和性受體。CD64是連接機體體液免疫和細胞免疫的橋梁，在細胞吞噬、清除免疫復合物、抗原遞呈和刺激炎性介質釋放中發(fā)揮至關重要的作用[3]。Hepburn et al[4]研究發(fā)現RA患者單核細胞上CD64表達與正常對照者之間差異無統(tǒng)計學意義。Laurent et al[5]研究發(fā)現RA患者單核細胞上CD64的表達低于正常對照者。而Matt et al[6]研究表明RA患者單核細胞上CD64的表達升高，并且與疾病的活動程度相關。因此，CD64在RA患者單核細胞上的表達情況及其在RA中的具體作用還不是很明確。該研究通過流式細胞術檢測RA患者和正常對照者外周血單核細胞表面CD64的表達，分析其與疾病嚴重程度和分泌細胞因子的關系，探討CD64在RA發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1病例資料收集2016年6月～2017年6月于南昌大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科就診的RA患者46例，其中女38例，男8例，年齡34～78(57.3±12.0)歲。所有的RA患者符合1987年美國風濕病學會(ACR)制定的RA診斷標準[7]，并排除其他嚴重疾病。正常對照組22例，為年齡和性別相匹配的健康體檢者，其中女18例，男4例，年齡32～69(51.2±11.6)歲。詳細收集RA患者臨床資料及相關實驗室檢查結果，并進行RA疾病活動性評分(disease activity score 28, DAS28)[8]，根據評分將疾病組分為活動組(DAS28≥2.6分，38例)和穩(wěn)定組(DAS28<2.6分，8例)。根據病程的長短將疾病組分為復發(fā)病例組(病程大于6個月，41例)和新發(fā)病例組(病程小于6個月，5例)[9]。所有的RA患者在采集標本前使用了相關抗風濕病藥物的治療。本實驗經過醫(yī)院倫理委員會批準，參加者知情同意。

1.2儀器和試劑Ficoll-Paque分離液購自美國Sigma公司；流式細胞抗體藻紅蛋白標記的CD64抗體(phycoerythrin-CD64, PE-CD64)、PE標記的CD163抗體(PE-CD163)、PE標記的CD206抗體(PE-CD206)、PE標記的CD86抗體(PE-CD86)、異硫氰酸熒光素標記的CD40抗體(fluorescein isothiocyanate-CD40，FITC-CD40)、FITC標記的CD80抗體(FITC-CD80)、FITC標記的HLA-DR抗體(FITC-HLA-DR)購自美國eBioscience公司；藻紅蛋白-得克薩斯紅標記的CD14抗體(phycoerythrin-texas red，ECD-CD14)及相應的同型對照PE-IgGl和FITC-IgG1均購自美國Beckman Coulter公司。Cytomics FC 500流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產品，分析軟件為儀器自帶的CXP分析系統(tǒng)。

1.3外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)提取肘前靜脈采集EDTA抗凝外周血5 ml，6 h內送檢。采用Ficoll-Paque分離液(美國Sigma公司)提取RA患者和對照者的PBMC。

1.4流式細胞術檢測單核細胞表面分子各取受試者100 μl 生理鹽水重懸的PBMC加入5試管中，按以下組合加入單克隆抗體各10 μl: ECD-CD14、PE-IgGl、FITC-IgGl; ECD-CD14、PE-CD163、FITC-CD80; ECD-CD14、PE-CD206、FITC-CD40; ECD-CD14、PE-CD86、FITC-HLA-DR; ECD-CD14、PE-CD64，4 ℃避光孵育30 min，如有紅細胞，則用紅細胞裂解處理后，生理鹽水洗滌，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，重懸后用Cytomics FC 500流式細胞儀檢測分析，使用CXP分析軟件分析單核細胞(CD14+)CD163/CD206/CD40/CD64/CD86/CD80/HLA-DR的表達。

1.5流式細胞術檢測CD64陽性和陰性單核細胞內腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α) 將分離的PBMC調整細胞數為5×109個/L接種于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔1 ml，同時加入LPS干預(終濃度100 μg/L),置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，用胰酶將其消化獲取細胞，室溫 1 500 r/min 離心 5 min ,棄上清液，用生理鹽水洗滌后，再重懸細胞。加入流式抗體(10 μl ECD-CD14和 FITC-CD64)避光孵育 30 min，生理鹽水離心洗滌，再加入500 μl破膜/固定劑，避光孵育 20 min， 經Perm /WashTM緩沖液洗滌并用100 μl 重懸細胞，再加入 10 μl PE-TNF-α抗體，避光孵育30 min。生理鹽水洗滌后，重懸細胞。先以單核細胞設門，圈出CD64陽性和陰性兩群細胞，再分別以CD64陽性和陰性的單核細胞設門，分別讀取CD64陽性和陰性單核細胞胞內TNF-α 的表達。

1.6RA的其他實驗室指標檢測血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR)采用動態(tài)血沉儀法(北京普利生公司)，類風濕因子(rheumatoid factor, RF)和C-反應蛋白(C-reactive protein, CRP)采用速率散色比濁法(美國Beckman Coulter公司)，抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-citrullinated protein antibodies, ACPA)采用酶聯免疫吸附法(上?？菩律锛夹g股份有限公司)。

2 結果

2.1RA患者及對照組外周血單核細胞的CD163/CD206/CD40/CD64/CD86/CD80/HLA-DR表達采用流式細胞術分析RA患者和正常對照組外周血單核細胞(CD14+)上CD163、CD206、CD40、CD64、CD86、CD80和HLA-DR表達水平，結果如表1所示，RA患者外周血CD64+單核細胞百分率為(94.64±0.92)%，正常對照組CD64+單核細胞百分率為(92.20±1.42)%，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；RA患者組外周血單核細胞CD64表達的平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)為(38.53±2.58)，顯著高于正常對照組(28.14±1.64)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.010)；而外周血單核細胞上的CD163、CD206、CD40、CD86、CD80和HLA-DR表達水平在兩組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2RA患者外周血單核細胞上CD64表達與DAS28評分相關性分析結果如圖1所示，RA活動組(DAS28≥2.6)和穩(wěn)定組(DAS28<2.6)外周血單核細胞上CD64表達的MFI分別為(40.64±18.00)、(20.04±7.12)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.040)。RA患者外周血單核細胞上CD64表達的MFI與DAS28呈正相關性(rs=0.34,P=0.025)。

表1 RA組及對照組單核細胞表面CD163、CD206、CD40、CD64、CD86、CD80和HLA-DR的表達

圖1RA患者外周血單核細胞上CD64表達與DAS28相關性分析

A：RA活動組外周血單核細胞上CD64表達MFI明顯高于RA穩(wěn)定組; B：RA患者外周血單核細胞上CD64表達MFI與疾病活動性評分DAS28呈正相關性

2.3RA患者外周血單核細胞上CD64表達與炎性指標相關性分析結果如圖2所示，RA患者外周血單核細胞上CD64表達的MFI與ESR呈正相關性(rs=0.46,P=0.002)，RA患者外周血單核細胞上CD64表達的MFI與CRP呈正相關性(rs=0.50,P=0.002)。

2.4RA患者外周血單核細胞上CD64表達與自身抗體的關系結果如圖3所示，RA患者ACPA陽性組外周血單核細胞上CD64表達的MFI高于對應的陰性組(P=0.048)，RA患者RF陽性組外周血單核細胞上CD64表達的MFI高于對應的陰性組(P=0.004)。

圖2 RA患者外周血單核細胞上CD64表達與炎性指標相關性分析

A：RA患者外周血單核細胞上CD64表達MFI與ESR呈正相關性;B：RA患者外周血單核細胞上CD64表達MFI與CRP呈正相關性

圖3 RA患者外周血單核細胞上CD64表達與自身抗體的關系

A：RA患者ACPA陽性組外周血單核細胞上CD64表達的MFI高于對應的陰性組; B：RA患者RF陽性組外周血單核細胞上CD64表達的MFI高于對應的陰性組

2.5新發(fā)和復發(fā)RA患者外周血單核細胞的CD64表達的比較結果如圖4所示，外周血單核細胞上CD64表達的MFI在新發(fā)RA患者與復發(fā)RA患者之間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.265)。

2.6RA患者CD64+單核細胞的TNF-α水平結果如圖5所示，RA患者 CD64+單核細胞表達的TNF-α水平明顯高于CD64-單核細胞 (P=0.014)。

圖4 新發(fā)RA患者和復發(fā)RA患者單核細胞上CD64表達

3 討論

CD64是IgG Fc 段受體Ⅰ，為高親和性受體，組成性的表達在單核細胞和巨噬細胞表面。雖然之前有關于RA患者單核細胞上CD64的表達研究報道，但其結果存在爭議[4-6,10]。因此，本研究為深入了解CD64在RA發(fā)病機制中的作用，采用流式細胞術檢測RA患者和正常對照者外周血單核細胞中CD64的表達，結果顯示，RA患者外周血單核細胞上CD64的表達明顯升高,并與DAS28呈正相關性，說明 CD64的表達水平與疾病活動性呈正比,患者疾病越嚴重,CD64的表達水平越高。不同研究其結果不一致可能原因是不同RA患者異質性較大，其病程、用藥情況、自身抗體的狀況、年齡和性別都有所差異，且其發(fā)病機制較為復雜。

本研究還分析了RA患者單核細胞中CD64的表達與炎癥指標、自身抗體的相關性。在RA患者中，單核細胞CD64的表達與炎癥指標CRP和ESR呈正相關性，且RA 患者單核細胞中CD64的表達水平與自身抗體密切相關。而近期研究[3-6]顯示CD64作為高親和力的IgG Fc 段受體，可促進單核細胞結合大量的抗體及抗原抗體免疫復合物，在刺激炎性介質釋放及RA發(fā)病中發(fā)揮至關重要的作用，而本研究進一步證實了CD64+單核細胞可分泌更多的TNF-α等促炎細胞因子，提示CD64可作為RA嚴重程度的評價指標。此外，本課題組之前的研究也證實單核細胞亞群中的經典型和中間型CD64表達與與炎癥水平、自身抗體產生和疾病活動性有明確的相關性，以及中間型單核細胞CD64 的表達與細胞因子相關[11]。這些結果進一步證實單核細胞上CD64的表達與RA的致病相關。

圖5RA患者CD64+單核細胞的TNF-α水平

A：流式細胞檢測CD64+單核細胞分泌TNF-α典型代表圖; B：RA患者 CD64+單核細胞表達的TNF-α 水平明顯高于CD64-單核細胞

RA是一種慢性炎性自身免疫性疾病，機體內存在大量的炎性細胞因子，已有研究證實IFN-γ和 G-CSF 等細胞因子可促進CD64的表達[12-13]。這就解釋了在RA這種炎性環(huán)境中，患者的單核細胞CD64表達升高。

此外，需要指出的是，本研究還存在一些缺陷：① RA患者研究樣本不夠多，尤其是新發(fā)RA患者；② 沒有檢測未用藥的新發(fā)RA患者以及沒有直接檢測用藥前后新發(fā)RA患者的CD64表達差異,因此無法了解在沒有藥物干擾情況下,CD64在RA中的作用，以及藥物對CD64表達的影響。本研究在后續(xù)的研究中將進一步擴大樣本量檢測未用藥新發(fā)RA 患者以及用藥前后CD64的表達情況，使研究結果更具有可靠性。