映山紅花總黃酮對大鼠心肌細胞收縮性的影響及其機制

孫曉青, 陳志武

尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ, UⅡ)最初是從硬骨魚垂體腺中分離出來的一種環(huán)形結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)肽，人尾加壓素Ⅱ(human UII, hU Ⅱ)含有11個氨基酸, 主要表達在心血管系統(tǒng), 越來越多的研究[1-2]表明由hU Ⅱ及其受體(UT受體)組成的urotensin系統(tǒng)對機體心血管生理功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。映山紅花，系杜鵑科植物，在我國具有廣泛的分布，是一種重要的中藥資源。映山紅花總黃酮(total flavones of rhododendra, TFR)系從映山紅花中提取的黃酮類有效部位，其主要成分為槲皮素、金絲桃苷及蘆丁等化合物[3]。課題組前期研究表明TFR能夠抗大鼠心肌缺血性損傷[4]，并抑制心肌梗死后心室重構(gòu)[5]，但不清楚TFR是否通過直接影響心肌細胞的收縮性來發(fā)揮抗心肌缺血性損傷作用。該研究觀察了TFR對體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞收縮性的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物1 d 齡SPF級新生SD大鼠，雌雄各半，共64只，體質(zhì)量5.5～6.5 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)于安靜、通風良好和有空氣過濾系統(tǒng)的環(huán)境中，12 h日光燈晝夜循環(huán)，保持實驗室內(nèi)溫度(22±2)℃，相對濕度(50±5)%。

1.2主要試劑TFR購自合肥合源醫(yī)藥科技有限公司，黃色粉末，總黃酮質(zhì)量分數(shù)達85%以上，實驗前用生理鹽水配成所需濃度；hU Ⅱ、Ⅱ型膠原酶、TRIton X-100、鈣熒光探針Fluo-8 AM購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國BI公司；胰酶購自維森特生物技術(shù)(南京)有限公司；FITC標記的山羊抗鼠熒光二抗購于美國Proteintech公司；α-橫紋肌肌動蛋白(α-Sarcomeric actin，α-SCA)單克隆抗體購自武漢博士德生物有限公司；DAPI染色液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3新生大鼠心肌細胞的培養(yǎng)與鑒定新生大鼠(每次10只)固定于超凈工作臺上,用75%酒精消毒其皮膚，打開胸腔取出心臟，在盛有PBS緩沖液的平皿中清洗之后，剪掉心房，把心室放在另一平皿中，用PBS緩沖液反復清洗3次；將一定數(shù)目的心室放進青霉素小瓶中，將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎塊；將心肌組織的碎塊，加入0.25%胰酶和0.1% Ⅱ型膠原酶(1 ∶1)的混合消化液，反復吹打3 min后蓋緊, 放入溫箱中孵育5 min，取出后再反復吹打3 min，待自然沉降后棄去上清液；剩余沉淀再加入2 ml消化液，反復吹打3 min后放入37 ℃溫箱中消化8 min，靜置后用吸管將上清液移入10 ml離心管中，剩余沉淀用同樣條件及方法繼續(xù)消化；每次消化產(chǎn)物以1 000 r/min離心8 min，輕輕用吸管棄去上清液后，將細胞重懸于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，細胞懸液用200目銅網(wǎng)過濾后接種在培養(yǎng)皿；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，輕輕將細胞懸液吸出，以4×105個/ml的密度接種在24孔培養(yǎng)板上，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天更換培養(yǎng)液，并用含10 μmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶的培養(yǎng)液維持48 h，以抑制非心肌細胞的增殖。以后每2 d換液1次。① 形態(tài)學觀察：倒置顯微鏡下觀察心肌細胞的大小、形態(tài)、搏動情況、生長特性及排列方式等；② 取無菌的小蓋玻片放入24孔板內(nèi)，取培養(yǎng)的心肌細胞加入到24孔板，進行培養(yǎng)，制成細胞爬片。等細胞培養(yǎng)到第3天棄去培養(yǎng)液，用預冷的PBS緩沖液清洗爬片2次，用含0.3% TRIton X-100(PBS緩沖液稀釋)的多聚甲醛室溫下固定30 min，棄去多聚甲醛，用PBS洗3次，室溫下加山羊血清封閉液30 min；棄去封閉液，加入1 ∶50 稀釋的小鼠抗大鼠α-SCA單克隆抗體于4 ℃過夜(陰性對照用PBS代替)，PBS 洗3次；1 ∶100稀釋的FITC標記山羊抗鼠二抗室溫孵育2 h，PBS洗3次；DAPI染色液孵育10 min，PBS洗3次；抗熒光淬滅液封片后立即置于倒置熒光顯微鏡下觀察，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。

1.4心肌細胞收縮頻率和收縮幅度的測定將上述培養(yǎng)的原代新生大鼠心肌細胞移入6孔培養(yǎng)板中，分別加入PBS、各濃度的TFR(3.7、11.1、33.3、100、300 mg/L)或hU Ⅱ(10、100 nmol/L)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后于1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用PBS快速沖洗2次，細胞調(diào)成1×106個/ml的密度，再次移入6孔培養(yǎng)板中，倒置顯微鏡下觀察單個心肌細胞搏動情況，計數(shù)其搏動頻率，并用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件測量細胞面積(m2)，以一個心動周期內(nèi)細胞的最大面積和最小面積之間的差值占最大面積的百分比作為細胞的收縮幅度(%)。每個培養(yǎng)孔中觀察10個細胞，以其平均搏動頻率和平均收縮幅度為觀察指標，實驗獨立重復6次。另取一批細胞，先用100 nmol/L hU Ⅱ預處理48 h后，再加入各濃度的TFR后，同樣方法測定細胞的平均搏動頻率和平均收縮幅度。

1.5心肌細胞內(nèi)Ca2+含量的測定加藥處理后，細胞爬片用臺式緩沖液(pH 7.4)(5 mmol/L KCl，130 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgSO4，2 mmol/L CaCl2，8 mmol/L NaOH，20 mmol/L HEPES)清洗3次，以終濃度0.2%的Fluo-8 AM 2 μl加入2 ml臺氏液中，37 ℃孵育30 min，之后用PBS清洗3次，通過氬激光器進行激光圖像采集，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為520 nm，采集頻率被設置為每10 s一個圖像。徠卡DMLFSA顯微鏡下使用Metafluor成像系統(tǒng)中集成CCD(電荷耦合器件)相機記錄單視野內(nèi)細胞內(nèi)鈣熒光成像并通過圖像分析軟件分析圖像中興趣區(qū)域內(nèi)熒光強度的變化，間接反映細胞內(nèi)游離的Ca2+濃度。

2 結(jié)果

2.1新生大鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)與鑒定光學顯微鏡下觀察，剛分離的心肌細胞呈圓形，然后變?yōu)樗笮危?4 h后細胞基本貼壁，單個細胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動，搏動頻率和節(jié)律有所不同；48 h后伸出偽足，細胞相互接觸，交織成網(wǎng)，細胞搏動趨于同步化。見圖1。用免疫熒光法檢測原代心肌細胞中特異性α-SCA蛋白，在原代心肌細胞中α-SCA抗原表達呈陽性，且位于胞質(zhì)中，DAPI染色的細胞核呈藍色熒光。高倍鏡下取數(shù)個視野，計算其平均值，結(jié)果顯示陽性細胞率為98%。見圖2。

圖1 光鏡下原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞 ×200

2.2hUⅡ?qū)π募〖毎湛s頻率的影響在給予hU Ⅱ前,各組心肌細胞收縮頻率并無差異；與對照組比較，hU Ⅱ 10、100 nmol/L作用48 h能夠加快心肌細胞的收縮頻率(F=78.16，P<0.05)。見表1。

表1 hUⅡ?qū)π募〖毎湛s頻率的影響

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3hUⅡ?qū)π募〖毎湛s幅度的影響在給予hU Ⅱ前,各組心肌細胞收縮幅度并無差異；與對照組比較，hU Ⅱ 10 nmol/L處理48 h能夠增強心肌細胞收縮幅度(t=2.56，P<0.05),而hU Ⅱ 100 nmol/L處理48 h能夠降低心肌細胞收縮幅度(t=5.41，P<0.01)。見表2。

圖2 心肌細胞中α-SCA抗原表達 免疫熒光染色×400

表2 hUⅡ?qū)π募〖毎湛s幅度的影響

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4TFR對心肌細胞收縮頻率的影響藥物作用時間為30 min，與對照組比較，TFR 3.7～100 mg/L濃度對心肌細胞收縮頻率幾乎無影響，而TFR 300 mg/L能夠減慢心肌細胞收縮頻率(F=2.932，P<0.05)。見表3。

表3 TFR對心肌細胞收縮頻率的影響

與對照組比較：*P<0.05

2.5TFR對心肌細胞收縮幅度的影響藥物作用30 min后，與對照組比較，TFR 3.7～100 mg/L對心肌細胞收縮幅度幾乎無影響，而TFR 300 mg/L能夠增強心肌細胞收縮幅度(F=3.48，P<0.05)。見圖3。

圖3 TFR對心肌細胞收縮幅度的影響

1：對照組；2：TFR 3.7 mg/L組；3：TFR 11.1 mg/L組；4：TFR 33.3 mg/L組；5：TFR 100 mg/L組；6：TFR 300 mg/L組；與對照組比較：*P<0.05

2.6TFR對hUⅡ預處理心肌細胞收縮頻率的影響與給予hU Ⅱ前比較，給予hU Ⅱ處理48 h后，心肌細胞收縮頻率增加(t=6.92、6.91、7.79、9.28、6.88、8.82，P<0.05)；與對照組比較，TFR 33.3～300 mg/L能夠濃度依賴性地減弱hU Ⅱ引起的心肌細胞收縮頻率的增加(F=17.53，P<0.05)。見表4。

表4 TFR對hUⅡ預處理心肌細胞收縮頻率的影響

與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與給予hUⅡ前比較：#P<0.05

2.7TFR對hUⅡ預處理心肌細胞收縮幅度的影響心肌細胞以100 nmol/L hUⅡ預處理48 h，然后再給予不同濃度的TFR處理30 min。與對照組比較，給予hUⅡ 100 nmol/L 處理48 h后，心肌細胞收縮幅度下降(t=2.504,P<0.01)，與單獨給予hUⅡ 100 nmol/L組比較，TFR 33.3～300 mg/L能夠改善hUⅡ引起的心肌細胞收縮幅度的下降(F=16.76,P<0.05 )。見圖4。

圖4 TFR對hUⅡ預處理心肌細胞收縮幅度的影響

1：對照組；2：hUⅡ 100 nmol/L組；3：hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 3.7 mg/L 組；4：hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 11.1 mg/L組；5：hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 33.3 mg/L組；6：hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 100 mg/L組；7：hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 300 mg/L組；與對照組比較：**P<0.01；與hUⅡ 100 nmol/L組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.8TFR對hUⅡ誘導的心肌細胞內(nèi)游離的Ca2+含量增加的影響與對照組比較，加入10 nmol/L hU Ⅱ處理48 h，可顯著地增加心肌細胞在488 nm波長光激發(fā)下，在520 nm處產(chǎn)生的熒光強度，100 nmol/L hU Ⅱ進一步增加心肌細胞的熒光強度(F=669.67，P<0.01)；但TFR 100 mg/L可明顯地抑制100 nmol/L hU Ⅱ誘導該熒光強度的增加(t=13.32，P<0.01)，結(jié)果表明TFR可顯著地抑制hU Ⅱ誘導的心肌細胞內(nèi)游離的Ca2+含量增加。見圖5。

3 討論

心肌細胞收縮頻率的降低可減少心肌耗氧量，而收縮幅度的增強可增加心肌耗氧量。本研究應用原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞，顯示TFR能夠減慢心肌細胞收縮頻率，但增加心肌細胞的收縮幅度。因此，TFR減慢心肌細胞收縮頻率可能抵消其增加心肌細胞收縮幅度引起的心肌耗氧量的增加，提示TFR有可能在不增加心肌耗氧量的情況下加強心肌收縮性，這對改善心肌缺血性損傷導致的心功能下降是有利的。

圖5 hUⅡ及TFR對心肌細胞內(nèi)Ca2+熒光強度的影響

1：對照組；2：hUⅡ 10 nmol/L組；3：hUⅡ 100 nmol/L組；4：hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 100 mg/L組；與對照組比較：**P<0.01；與hUⅡ 100 nmol/L組比較：##P<0.01

大量研究[6-7]表明hU Ⅱ與UT受體結(jié)合能夠產(chǎn)生多種生物學效應，并在多種心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用，是很有前景的治療新靶點。本研究顯示hU Ⅱ在10 nmol/L能夠增加心肌細胞收縮幅度，而在100 nmol/L反而降低心肌細胞收縮幅度，表明高低不同濃度的hU Ⅱ?qū)π募〖毎湛s性的影響是不同的，這與Dong et al[8]的研究結(jié)果較相似，結(jié)果顯示UⅡ?qū)ρ茏饔贸孰p相性，即濃度小于10-9mol /L可產(chǎn)生內(nèi)皮依賴性舒張作用，而超過10-9mol /L可直接收縮血管平滑肌。但是本研究表明，無論是10 nmol/L hU Ⅱ，還是100 nmol/L hU Ⅱ均可明顯地增加心肌細胞收縮頻率。

文獻[9]報道hU Ⅱ可通過UT受體增加細胞內(nèi)Ca2+含量。本實驗也顯示hU Ⅱ在10和100 nmol/L濃度時能夠增加心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度。心肌細胞的肌漿網(wǎng)不如骨骼肌發(fā)達，貯Ca2+量少，其收縮有賴于細胞外Ca2+的內(nèi)流。10 nmol/L hU Ⅱ引起細胞內(nèi)的Ca2+增加，對于心肌細胞的收縮力是一種正性促進作用，這與Al et al[10]的報道，hU Ⅱ在20 pmol/L～20 nmol/L能夠濃度依賴性地增加右心室收縮力的結(jié)論相一致。文獻[11]報道過度增加Ca2+內(nèi)流將誘導細胞肥大[12]，并且導致其收縮功能受損。這就可以解釋為什么100 nmol/L hU Ⅱ在進一步增加心肌細胞的鈣濃度時，反而降低心肌細胞收縮幅度。心肌細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流的增加可導致其自律性的增加，收縮頻率是衡量自律性的一個指標，故而10和100 nmol/L hU Ⅱ均能夠增加心肌細胞收縮頻率。

本研究顯示TFR在33.3～300 mg/L范圍內(nèi)，可濃度依賴性地抑制100 nmol/L hU Ⅱ引起的心肌細胞收縮幅度的下降和收縮頻率的增加，改善心肌細胞收縮性。進一步研究還表明TFR可減少100 nmol/L hU Ⅱ?qū)е碌男募〖毎鸆a2+含量的增加。研究[13]表明TFR能與UT受體競爭性結(jié)合從而拮抗hU Ⅱ的作用，結(jié)合本實驗，可以推測TFR通過抑制hU Ⅱ與UT受體的結(jié)合，減少細胞內(nèi)的Ca2+濃度， 從而改善心肌細胞的收縮性。