• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    映山紅花總黃酮對大鼠心肌細(xì)胞收縮性的影響及其機(jī)制

    2019-03-05 11:42:00孫曉青陳志武
    關(guān)鍵詞:影響

    孫曉青, 陳志武

    尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ, UⅡ)最初是從硬骨魚垂體腺中分離出來的一種環(huán)形結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)肽,人尾加壓素Ⅱ(human UII, hU Ⅱ)含有11個(gè)氨基酸, 主要表達(dá)在心血管系統(tǒng), 越來越多的研究[1-2]表明由hU Ⅱ及其受體(UT受體)組成的urotensin系統(tǒng)對機(jī)體心血管生理功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。映山紅花,系杜鵑科植物,在我國具有廣泛的分布,是一種重要的中藥資源。映山紅花總黃酮(total flavones of rhododendra, TFR)系從映山紅花中提取的黃酮類有效部位,其主要成分為槲皮素、金絲桃苷及蘆丁等化合物[3]。課題組前期研究表明TFR能夠抗大鼠心肌缺血性損傷[4],并抑制心肌梗死后心室重構(gòu)[5],但不清楚TFR是否通過直接影響心肌細(xì)胞的收縮性來發(fā)揮抗心肌缺血性損傷作用。該研究觀察了TFR對體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞收縮性的影響,并探討其作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動物1 d 齡SPF級新生SD大鼠,雌雄各半,共64只,體質(zhì)量5.5~6.5 g,由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物飼養(yǎng)于安靜、通風(fēng)良好和有空氣過濾系統(tǒng)的環(huán)境中,12 h日光燈晝夜循環(huán),保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度(22±2)℃,相對濕度(50±5)%。

    1.2主要試劑TFR購自合肥合源醫(yī)藥科技有限公司,黃色粉末,總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)85%以上,實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配成所需濃度;hU Ⅱ、Ⅱ型膠原酶、TRIton X-100、鈣熒光探針Fluo-8 AM購自美國Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自美國BI公司;胰酶購自維森特生物技術(shù)(南京)有限公司;FITC標(biāo)記的山羊抗鼠熒光二抗購于美國Proteintech公司;α-橫紋肌肌動蛋白(α-Sarcomeric actin,α-SCA)單克隆抗體購自武漢博士德生物有限公司;DAPI染色液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所;其余試劑為國產(chǎn)分析純。

    1.3新生大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定新生大鼠(每次10只)固定于超凈工作臺上,用75%酒精消毒其皮膚,打開胸腔取出心臟,在盛有PBS緩沖液的平皿中清洗之后,剪掉心房,把心室放在另一平皿中,用PBS緩沖液反復(fù)清洗3次;將一定數(shù)目的心室放進(jìn)青霉素小瓶中,將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎塊;將心肌組織的碎塊,加入0.25%胰酶和0.1% Ⅱ型膠原酶(1 ∶1)的混合消化液,反復(fù)吹打3 min后蓋緊, 放入溫箱中孵育5 min,取出后再反復(fù)吹打3 min,待自然沉降后棄去上清液;剩余沉淀再加入2 ml消化液,反復(fù)吹打3 min后放入37 ℃溫箱中消化8 min,靜置后用吸管將上清液移入10 ml離心管中,剩余沉淀用同樣條件及方法繼續(xù)消化;每次消化產(chǎn)物以1 000 r/min離心8 min,輕輕用吸管棄去上清液后,將細(xì)胞重懸于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,細(xì)胞懸液用200目銅網(wǎng)過濾后接種在培養(yǎng)皿;37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后,輕輕將細(xì)胞懸液吸出,以4×105個(gè)/ml的密度接種在24孔培養(yǎng)板上,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天更換培養(yǎng)液,并用含10 μmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶的培養(yǎng)液維持48 h,以抑制非心肌細(xì)胞的增殖。以后每2 d換液1次。① 形態(tài)學(xué)觀察:倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的大小、形態(tài)、搏動情況、生長特性及排列方式等;② 取無菌的小蓋玻片放入24孔板內(nèi),取培養(yǎng)的心肌細(xì)胞加入到24孔板,進(jìn)行培養(yǎng),制成細(xì)胞爬片。等細(xì)胞培養(yǎng)到第3天棄去培養(yǎng)液,用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗爬片2次,用含0.3% TRIton X-100(PBS緩沖液稀釋)的多聚甲醛室溫下固定30 min,棄去多聚甲醛,用PBS洗3次,室溫下加山羊血清封閉液30 min;棄去封閉液,加入1 ∶50 稀釋的小鼠抗大鼠α-SCA單克隆抗體于4 ℃過夜(陰性對照用PBS代替),PBS 洗3次;1 ∶100稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗鼠二抗室溫孵育2 h,PBS洗3次;DAPI染色液孵育10 min,PBS洗3次;抗熒光淬滅液封片后立即置于倒置熒光顯微鏡下觀察,統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)。

    1.4心肌細(xì)胞收縮頻率和收縮幅度的測定將上述培養(yǎng)的原代新生大鼠心肌細(xì)胞移入6孔培養(yǎng)板中,分別加入PBS、各濃度的TFR(3.7、11.1、33.3、100、300 mg/L)或hU Ⅱ(10、100 nmol/L),置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),然后于1 000 r/min離心5 min,棄去培養(yǎng)液,用PBS快速沖洗2次,細(xì)胞調(diào)成1×106個(gè)/ml的密度,再次移入6孔培養(yǎng)板中,倒置顯微鏡下觀察單個(gè)心肌細(xì)胞搏動情況,計(jì)數(shù)其搏動頻率,并用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件測量細(xì)胞面積(m2),以一個(gè)心動周期內(nèi)細(xì)胞的最大面積和最小面積之間的差值占最大面積的百分比作為細(xì)胞的收縮幅度(%)。每個(gè)培養(yǎng)孔中觀察10個(gè)細(xì)胞,以其平均搏動頻率和平均收縮幅度為觀察指標(biāo),實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)6次。另取一批細(xì)胞,先用100 nmol/L hU Ⅱ預(yù)處理48 h后,再加入各濃度的TFR后,同樣方法測定細(xì)胞的平均搏動頻率和平均收縮幅度。

    1.5心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的測定加藥處理后,細(xì)胞爬片用臺式緩沖液(pH 7.4)(5 mmol/L KCl,130 mmol/L NaCl,1 mmol/L MgSO4,2 mmol/L CaCl2,8 mmol/L NaOH,20 mmol/L HEPES)清洗3次,以終濃度0.2%的Fluo-8 AM 2 μl加入2 ml臺氏液中,37 ℃孵育30 min,之后用PBS清洗3次,通過氬激光器進(jìn)行激光圖像采集,激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為520 nm,采集頻率被設(shè)置為每10 s一個(gè)圖像。徠卡DMLFSA顯微鏡下使用Metafluor成像系統(tǒng)中集成CCD(電荷耦合器件)相機(jī)記錄單視野內(nèi)細(xì)胞內(nèi)鈣熒光成像并通過圖像分析軟件分析圖像中興趣區(qū)域內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化,間接反映細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+濃度。

    2 結(jié)果

    2.1新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定光學(xué)顯微鏡下觀察,剛分離的心肌細(xì)胞呈圓形,然后變?yōu)樗笮危?4 h后細(xì)胞基本貼壁,單個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動,搏動頻率和節(jié)律有所不同;48 h后伸出偽足,細(xì)胞相互接觸,交織成網(wǎng),細(xì)胞搏動趨于同步化。見圖1。用免疫熒光法檢測原代心肌細(xì)胞中特異性α-SCA蛋白,在原代心肌細(xì)胞中α-SCA抗原表達(dá)呈陽性,且位于胞質(zhì)中,DAPI染色的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。高倍鏡下取數(shù)個(gè)視野,計(jì)算其平均值,結(jié)果顯示陽性細(xì)胞率為98%。見圖2。

    圖1 光鏡下原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞 ×200

    2.2hUⅡ?qū)π募〖?xì)胞收縮頻率的影響在給予hU Ⅱ前,各組心肌細(xì)胞收縮頻率并無差異;與對照組比較,hU Ⅱ 10、100 nmol/L作用48 h能夠加快心肌細(xì)胞的收縮頻率(F=78.16,P<0.05)。見表1。

    表1 hUⅡ?qū)π募〖?xì)胞收縮頻率的影響

    與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01

    2.3hUⅡ?qū)π募〖?xì)胞收縮幅度的影響在給予hU Ⅱ前,各組心肌細(xì)胞收縮幅度并無差異;與對照組比較,hU Ⅱ 10 nmol/L處理48 h能夠增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮幅度(t=2.56,P<0.05),而hU Ⅱ 100 nmol/L處理48 h能夠降低心肌細(xì)胞收縮幅度(t=5.41,P<0.01)。見表2。

    圖2 心肌細(xì)胞中α-SCA抗原表達(dá) 免疫熒光染色×400

    表2 hUⅡ?qū)π募〖?xì)胞收縮幅度的影響

    與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01

    2.4TFR對心肌細(xì)胞收縮頻率的影響藥物作用時(shí)間為30 min,與對照組比較,TFR 3.7~100 mg/L濃度對心肌細(xì)胞收縮頻率幾乎無影響,而TFR 300 mg/L能夠減慢心肌細(xì)胞收縮頻率(F=2.932,P<0.05)。見表3。

    表3 TFR對心肌細(xì)胞收縮頻率的影響

    與對照組比較:*P<0.05

    2.5TFR對心肌細(xì)胞收縮幅度的影響藥物作用30 min后,與對照組比較,TFR 3.7~100 mg/L對心肌細(xì)胞收縮幅度幾乎無影響,而TFR 300 mg/L能夠增強(qiáng)心肌細(xì)胞收縮幅度(F=3.48,P<0.05)。見圖3。

    圖3 TFR對心肌細(xì)胞收縮幅度的影響

    1:對照組;2:TFR 3.7 mg/L組;3:TFR 11.1 mg/L組;4:TFR 33.3 mg/L組;5:TFR 100 mg/L組;6:TFR 300 mg/L組;與對照組比較:*P<0.05

    2.6TFR對hUⅡ預(yù)處理心肌細(xì)胞收縮頻率的影響與給予hU Ⅱ前比較,給予hU Ⅱ處理48 h后,心肌細(xì)胞收縮頻率增加(t=6.92、6.91、7.79、9.28、6.88、8.82,P<0.05);與對照組比較,TFR 33.3~300 mg/L能夠濃度依賴性地減弱hU Ⅱ引起的心肌細(xì)胞收縮頻率的增加(F=17.53,P<0.05)。見表4。

    表4 TFR對hUⅡ預(yù)處理心肌細(xì)胞收縮頻率的影響

    與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01;與給予hUⅡ前比較:#P<0.05

    2.7TFR對hUⅡ預(yù)處理心肌細(xì)胞收縮幅度的影響心肌細(xì)胞以100 nmol/L hUⅡ預(yù)處理48 h,然后再給予不同濃度的TFR處理30 min。與對照組比較,給予hUⅡ 100 nmol/L 處理48 h后,心肌細(xì)胞收縮幅度下降(t=2.504,P<0.01),與單獨(dú)給予hUⅡ 100 nmol/L組比較,TFR 33.3~300 mg/L能夠改善hUⅡ引起的心肌細(xì)胞收縮幅度的下降(F=16.76,P<0.05 )。見圖4。

    圖4 TFR對hUⅡ預(yù)處理心肌細(xì)胞收縮幅度的影響

    1:對照組;2:hUⅡ 100 nmol/L組;3:hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 3.7 mg/L 組;4:hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 11.1 mg/L組;5:hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 33.3 mg/L組;6:hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 100 mg/L組;7:hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 300 mg/L組;與對照組比較:**P<0.01;與hUⅡ 100 nmol/L組比較:#P<0.05,##P<0.01

    2.8TFR對hUⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+含量增加的影響與對照組比較,加入10 nmol/L hU Ⅱ處理48 h,可顯著地增加心肌細(xì)胞在488 nm波長光激發(fā)下,在520 nm處產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度,100 nmol/L hU Ⅱ進(jìn)一步增加心肌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度(F=669.67,P<0.01);但TFR 100 mg/L可明顯地抑制100 nmol/L hU Ⅱ誘導(dǎo)該熒光強(qiáng)度的增加(t=13.32,P<0.01),結(jié)果表明TFR可顯著地抑制hU Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+含量增加。見圖5。

    3 討論

    心肌細(xì)胞收縮頻率的降低可減少心肌耗氧量,而收縮幅度的增強(qiáng)可增加心肌耗氧量。本研究應(yīng)用原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞,顯示TFR能夠減慢心肌細(xì)胞收縮頻率,但增加心肌細(xì)胞的收縮幅度。因此,TFR減慢心肌細(xì)胞收縮頻率可能抵消其增加心肌細(xì)胞收縮幅度引起的心肌耗氧量的增加,提示TFR有可能在不增加心肌耗氧量的情況下加強(qiáng)心肌收縮性,這對改善心肌缺血性損傷導(dǎo)致的心功能下降是有利的。

    圖5 hUⅡ及TFR對心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的影響

    1:對照組;2:hUⅡ 10 nmol/L組;3:hUⅡ 100 nmol/L組;4:hUⅡ 100 nmol/L聯(lián)合TFR 100 mg/L組;與對照組比較:**P<0.01;與hUⅡ 100 nmol/L組比較:##P<0.01

    大量研究[6-7]表明hU Ⅱ與UT受體結(jié)合能夠產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng),并在多種心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用,是很有前景的治療新靶點(diǎn)。本研究顯示hU Ⅱ在10 nmol/L能夠增加心肌細(xì)胞收縮幅度,而在100 nmol/L反而降低心肌細(xì)胞收縮幅度,表明高低不同濃度的hU Ⅱ?qū)π募〖?xì)胞收縮性的影響是不同的,這與Dong et al[8]的研究結(jié)果較相似,結(jié)果顯示UⅡ?qū)ρ茏饔贸孰p相性,即濃度小于10-9mol /L可產(chǎn)生內(nèi)皮依賴性舒張作用,而超過10-9mol /L可直接收縮血管平滑肌。但是本研究表明,無論是10 nmol/L hU Ⅱ,還是100 nmol/L hU Ⅱ均可明顯地增加心肌細(xì)胞收縮頻率。

    文獻(xiàn)[9]報(bào)道hU Ⅱ可通過UT受體增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量。本實(shí)驗(yàn)也顯示hU Ⅱ在10和100 nmol/L濃度時(shí)能夠增加心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。心肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)不如骨骼肌發(fā)達(dá),貯Ca2+量少,其收縮有賴于細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流。10 nmol/L hU Ⅱ引起細(xì)胞內(nèi)的Ca2+增加,對于心肌細(xì)胞的收縮力是一種正性促進(jìn)作用,這與Al et al[10]的報(bào)道,hU Ⅱ在20 pmol/L~20 nmol/L能夠濃度依賴性地增加右心室收縮力的結(jié)論相一致。文獻(xiàn)[11]報(bào)道過度增加Ca2+內(nèi)流將誘導(dǎo)細(xì)胞肥大[12],并且導(dǎo)致其收縮功能受損。這就可以解釋為什么100 nmol/L hU Ⅱ在進(jìn)一步增加心肌細(xì)胞的鈣濃度時(shí),反而降低心肌細(xì)胞收縮幅度。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流的增加可導(dǎo)致其自律性的增加,收縮頻率是衡量自律性的一個(gè)指標(biāo),故而10和100 nmol/L hU Ⅱ均能夠增加心肌細(xì)胞收縮頻率。

    本研究顯示TFR在33.3~300 mg/L范圍內(nèi),可濃度依賴性地抑制100 nmol/L hU Ⅱ引起的心肌細(xì)胞收縮幅度的下降和收縮頻率的增加,改善心肌細(xì)胞收縮性。進(jìn)一步研究還表明TFR可減少100 nmol/L hU Ⅱ?qū)е碌男募〖?xì)胞Ca2+含量的增加。研究[13]表明TFR能與UT受體競爭性結(jié)合從而拮抗hU Ⅱ的作用,結(jié)合本實(shí)驗(yàn),可以推測TFR通過抑制hU Ⅱ與UT受體的結(jié)合,減少細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度, 從而改善心肌細(xì)胞的收縮性。

    猜你喜歡
    影響
    美食網(wǎng)紅如何影響我們吃什么
    英語文摘(2022年4期)2022-06-05 07:45:18
    是什么影響了滑動摩擦力的大小
    哪些顧慮影響擔(dān)當(dāng)?
    影響大師
    沒錯(cuò),痛經(jīng)有時(shí)也會影響懷孕
    媽媽寶寶(2017年3期)2017-02-21 01:22:28
    擴(kuò)鏈劑聯(lián)用對PETG擴(kuò)鏈反應(yīng)與流變性能的影響
    中國塑料(2016年3期)2016-06-15 20:30:00
    基于Simulink的跟蹤干擾對跳頻通信的影響
    如何影響他人
    APRIL siRNA對SW480裸鼠移植瘤的影響
    亚洲欧美精品自产自拍| 中文字幕av成人在线电影| 少妇人妻精品综合一区二区 | 欧美高清性xxxxhd video| 成年女人永久免费观看视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产成人一区二区在线| 欧美丝袜亚洲另类| 波多野结衣高清作品| 婷婷精品国产亚洲av在线| 免费av不卡在线播放| 99久久成人亚洲精品观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产精品电影一区二区三区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 毛片一级片免费看久久久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产v大片淫在线免费观看| 国产亚洲91精品色在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 在线看三级毛片| 六月丁香七月| or卡值多少钱| 美女黄网站色视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 少妇高潮的动态图| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 成人美女网站在线观看视频| 可以在线观看的亚洲视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美日韩在线观看h| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 亚洲欧美清纯卡通| 中文字幕熟女人妻在线| АⅤ资源中文在线天堂| 精品人妻偷拍中文字幕| 赤兔流量卡办理| 久久99热6这里只有精品| 俄罗斯特黄特色一大片| 日韩精品有码人妻一区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 禁无遮挡网站| 国产黄a三级三级三级人| 欧美日本亚洲视频在线播放| 免费看光身美女| 亚洲天堂国产精品一区在线| 夜夜爽天天搞| 日韩制服骚丝袜av| 草草在线视频免费看| 亚洲av.av天堂| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久久久久久久久成人| 精品熟女少妇av免费看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 精品久久久久久久末码| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品人妻久久久久久| 如何舔出高潮| 亚洲精品影视一区二区三区av| 麻豆国产97在线/欧美| 日韩一本色道免费dvd| 日韩国内少妇激情av| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美性感艳星| 欧美bdsm另类| 国内精品美女久久久久久| 赤兔流量卡办理| 国产91av在线免费观看| 在线观看午夜福利视频| 男女边吃奶边做爰视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | av免费在线看不卡| 亚洲成人久久性| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久草成人影院| 给我免费播放毛片高清在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 日日啪夜夜撸| 国产精品一区二区性色av| 亚洲中文日韩欧美视频| 91精品国产九色| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久久久久久午夜电影| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲最大成人中文| 国产色爽女视频免费观看| 最近的中文字幕免费完整| 嫩草影院入口| 少妇的逼好多水| 午夜影院日韩av| 久久精品91蜜桃| 色5月婷婷丁香| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产亚洲精品久久久com| 午夜精品在线福利| 晚上一个人看的免费电影| 成人欧美大片| 日韩欧美在线乱码| 亚洲色图av天堂| 寂寞人妻少妇视频99o| 三级国产精品欧美在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av.av天堂| 欧美性猛交黑人性爽| 激情 狠狠 欧美| 色播亚洲综合网| 久久九九热精品免费| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲自偷自拍三级| 在线观看美女被高潮喷水网站| 超碰av人人做人人爽久久| 91久久精品国产一区二区成人| 日韩高清综合在线| 一进一出抽搐动态| 久久午夜福利片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 校园春色视频在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 18+在线观看网站| 99久久九九国产精品国产免费| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲va在线va天堂va国产| 成人性生交大片免费视频hd| 如何舔出高潮| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产亚洲精品av在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 搡老熟女国产l中国老女人| 伦精品一区二区三区| 久久久久久久久久成人| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日本熟妇午夜| 大香蕉久久网| 又黄又爽又免费观看的视频| 99久久九九国产精品国产免费| 色综合色国产| 欧美日韩综合久久久久久| 99视频精品全部免费 在线| 欧美日韩综合久久久久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 三级国产精品欧美在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 国产高清视频在线播放一区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 成人毛片a级毛片在线播放| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲精品在线观看二区| av天堂在线播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| 黄片wwwwww| 久久中文看片网| 亚洲内射少妇av| 在线观看午夜福利视频| 在线播放国产精品三级| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩中字成人| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久久久久久大av| 亚洲精品国产av成人精品 | av免费在线看不卡| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲四区av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久精品国产亚洲网站| 成人二区视频| 直男gayav资源| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产午夜精品论理片| 精品福利观看| 永久网站在线| 日韩一本色道免费dvd| 国产欧美日韩精品亚洲av| 我要搜黄色片| 久久午夜福利片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产视频内射| 真实男女啪啪啪动态图| 全区人妻精品视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 免费av不卡在线播放| 91麻豆精品激情在线观看国产| 毛片女人毛片| 99热精品在线国产| 国产免费一级a男人的天堂| 哪里可以看免费的av片| 精品人妻熟女av久视频| 成人永久免费在线观看视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲欧美清纯卡通| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 有码 亚洲区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 99热精品在线国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 国产真实乱freesex| 亚洲av电影不卡..在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美成人a在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 综合色av麻豆| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 一个人免费在线观看电影| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲精品国产av成人精品 | 国产伦一二天堂av在线观看| 精品福利观看| 成人av一区二区三区在线看| 国产 一区精品| 日韩欧美三级三区| 99九九线精品视频在线观看视频| 成人无遮挡网站| 精品无人区乱码1区二区| 色尼玛亚洲综合影院| 天堂影院成人在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 精品不卡国产一区二区三区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 丰满的人妻完整版| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲精品久久国产高清桃花| 秋霞在线观看毛片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 成人精品一区二区免费| av天堂中文字幕网| 国产三级在线视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 综合色丁香网| 国产美女午夜福利| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 99九九线精品视频在线观看视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成年女人毛片免费观看观看9| 免费观看精品视频网站| 欧美不卡视频在线免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| av专区在线播放| h日本视频在线播放| 此物有八面人人有两片| 色综合亚洲欧美另类图片| 日韩欧美免费精品| 老司机影院成人| 校园春色视频在线观看| 赤兔流量卡办理| 日本黄色视频三级网站网址| 91av网一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 毛片一级片免费看久久久久| 麻豆乱淫一区二区| 国产色婷婷99| 大香蕉久久网| av在线观看视频网站免费| 日韩欧美三级三区| av视频在线观看入口| 一级黄片播放器| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲专区国产一区二区| 美女免费视频网站| 国国产精品蜜臀av免费| 99久国产av精品国产电影| 久久久精品大字幕| 伦理电影大哥的女人| 此物有八面人人有两片| 天堂动漫精品| 中国美女看黄片| 精品午夜福利视频在线观看一区| 青春草视频在线免费观看| 小说图片视频综合网站| 日韩欧美精品v在线| 色哟哟·www| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美另类亚洲清纯唯美| 在线国产一区二区在线| 寂寞人妻少妇视频99o| 丰满的人妻完整版| 一夜夜www| 国产日本99.免费观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 在线观看66精品国产| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 男女边吃奶边做爰视频| 久久国内精品自在自线图片| 欧美极品一区二区三区四区| 麻豆一二三区av精品| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 真人做人爱边吃奶动态| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 午夜精品国产一区二区电影 | 丰满的人妻完整版| 欧美激情在线99| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美日本视频| 国产三级中文精品| 精品久久国产蜜桃| 好男人在线观看高清免费视频| 99久国产av精品| 精品久久久久久成人av| 91狼人影院| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲内射少妇av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲成人中文字幕在线播放| 一级毛片久久久久久久久女| 欧美色欧美亚洲另类二区| 成人精品一区二区免费| 少妇人妻一区二区三区视频| 岛国在线免费视频观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲中文日韩欧美视频| 成人av一区二区三区在线看| 久久精品影院6| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久人妻av系列| 国产精品1区2区在线观看.| 午夜福利在线在线| or卡值多少钱| 久久精品国产亚洲网站| 日韩在线高清观看一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久久久久国产a免费观看| 简卡轻食公司| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品一及| 天天躁日日操中文字幕| 99久国产av精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 此物有八面人人有两片| 日韩欧美三级三区| 一区二区三区免费毛片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 波野结衣二区三区在线| 波多野结衣高清作品| 亚洲av电影不卡..在线观看| 在线a可以看的网站| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 九九在线视频观看精品| 国产精品三级大全| 国产亚洲欧美98| 国产伦在线观看视频一区| 黑人高潮一二区| 中文字幕免费在线视频6| 成人永久免费在线观看视频| 成年版毛片免费区| 国产探花在线观看一区二区| 此物有八面人人有两片| 国国产精品蜜臀av免费| 1024手机看黄色片| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲精品一区av在线观看| 丰满的人妻完整版| 一个人观看的视频www高清免费观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美区成人在线视频| 一a级毛片在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 最近在线观看免费完整版| 高清毛片免费看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 免费看a级黄色片| 欧美性猛交黑人性爽| 春色校园在线视频观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 露出奶头的视频| 秋霞在线观看毛片| 联通29元200g的流量卡| 精品一区二区三区人妻视频| 色综合站精品国产| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品不卡视频一区二区| 美女免费视频网站| 亚洲精品影视一区二区三区av| 天堂影院成人在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品久久视频播放| 一级毛片aaaaaa免费看小| 91av网一区二区| 毛片女人毛片| 欧美+日韩+精品| 国产精品人妻久久久影院| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日本-黄色视频高清免费观看| 天美传媒精品一区二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 91久久精品电影网| 校园人妻丝袜中文字幕| 天堂网av新在线| 蜜臀久久99精品久久宅男| а√天堂www在线а√下载| 观看免费一级毛片| 国产精品福利在线免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 97超碰精品成人国产| 国产成年人精品一区二区| 欧美高清性xxxxhd video| av在线观看视频网站免费| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产精品一及| 一级av片app| 成人av一区二区三区在线看| 欧美成人a在线观看| 色5月婷婷丁香| 精品久久久久久久久av| 亚洲人成网站高清观看| 久久这里只有精品中国| 亚洲人成网站在线播| 国产一区二区三区av在线 | 亚洲18禁久久av| a级毛色黄片| 插逼视频在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| 国产av一区在线观看免费| 国产高潮美女av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产成人a区在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 日韩精品有码人妻一区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 1024手机看黄色片| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 精品一区二区免费观看| 99热这里只有精品一区| 日韩制服骚丝袜av| av黄色大香蕉| www.色视频.com| 直男gayav资源| av国产免费在线观看| 91精品国产九色| 成人三级黄色视频| 性欧美人与动物交配| 最好的美女福利视频网| 热99re8久久精品国产| 91久久精品电影网| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 综合色丁香网| 97超碰精品成人国产| 国产黄a三级三级三级人| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲av美国av| 天堂影院成人在线观看| 在线观看一区二区三区| 老司机午夜福利在线观看视频| 免费看a级黄色片| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 97热精品久久久久久| av福利片在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 伦理电影大哥的女人| 岛国在线免费视频观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 我要看日韩黄色一级片| 赤兔流量卡办理| 嫩草影院精品99| 国产精品乱码一区二三区的特点| 日韩av在线大香蕉| 久久久久国产网址| 一夜夜www| 内射极品少妇av片p| 国产黄色小视频在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 免费观看人在逋| 搞女人的毛片| 午夜亚洲福利在线播放| 日韩国内少妇激情av| 日本免费a在线| 国产精品乱码一区二三区的特点| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲最大成人中文| 亚洲七黄色美女视频| 大香蕉久久网| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲欧美日韩东京热| 成人午夜高清在线视频| 日韩精品中文字幕看吧| 夜夜爽天天搞| 精品不卡国产一区二区三区| 中国美女看黄片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 熟女电影av网| 亚洲va在线va天堂va国产| .国产精品久久| 夜夜爽天天搞| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲五月天丁香| 亚洲av二区三区四区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 免费观看的影片在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | av在线播放精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 中国国产av一级| 伦精品一区二区三区| 嫩草影院新地址| 黄色配什么色好看| 国产精品久久视频播放| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲av免费高清在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 一级毛片久久久久久久久女| 欧美+日韩+精品| 嫩草影院入口| 小说图片视频综合网站| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 免费在线观看成人毛片| av中文乱码字幕在线| 成人二区视频| 久久这里只有精品中国| 久久人妻av系列| 亚洲av成人av| 久久久久久久久中文| 天美传媒精品一区二区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久久久国内视频| 插逼视频在线观看| 一本一本综合久久| 日韩av不卡免费在线播放| 秋霞在线观看毛片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲av不卡在线观看| 日本 av在线| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产高清视频在线观看网站| 真人做人爱边吃奶动态| 熟女人妻精品中文字幕| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 桃色一区二区三区在线观看| 91av网一区二区| 免费黄网站久久成人精品| 香蕉av资源在线| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日韩欧美免费精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜福利高清视频| 99热全是精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 成人性生交大片免费视频hd| 波多野结衣高清无吗| 如何舔出高潮| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品人妻久久久影院| 免费人成在线观看视频色| 日韩强制内射视频| 不卡视频在线观看欧美| 美女内射精品一级片tv| 日本黄大片高清| 韩国av在线不卡| 一a级毛片在线观看| 观看免费一级毛片| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲,欧美,日韩| 欧美激情在线99| 欧美区成人在线视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 此物有八面人人有两片| 性欧美人与动物交配| 久久久成人免费电影| 成人综合一区亚洲| 国产精品精品国产色婷婷| 国产黄片美女视频| 最近在线观看免费完整版| av中文乱码字幕在线| 国产精品久久电影中文字幕| 日本精品一区二区三区蜜桃| 日韩在线高清观看一区二区三区| 插阴视频在线观看视频| 日韩中字成人| 国产亚洲精品av在线| 亚洲国产色片| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲国产精品合色在线|