二氫楊梅素對(duì)SHED活性及其成骨分化能力的影響

岳二麗，李夏寧*，趙紅宇，王一飛，劉 飛，肖劍礴

牙周病是一種慢性炎癥性的疾病，可以導(dǎo)致牙周支持組織的破壞，牙周病治療的目標(biāo)是使缺失的牙周組織獲得再生。近年來，組織工程學(xué)的飛速發(fā)展為這一目標(biāo)提供了新的研究方向，其中種子細(xì)胞是其中的重要角色之一。因乳牙牙髓干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)增殖能力及成骨分化能力要強(qiáng)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及恒牙牙髓干細(xì)胞[1-2],使其在組織工程學(xué)中表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。目前多項(xiàng)研究[3-4]證實(shí)顯齒蛇葡萄中主要成分為黃酮類化合物，黃酮類化合物具有抑制破骨細(xì)胞形成、促進(jìn)成骨分化能力及增加骨密度的作用。二氫楊梅素(Dihydromyricetin,DMY)是顯齒蛇葡萄中含量最高的成分[5]，郭航 等[6]及Zhang et al[7]證實(shí)一定濃度的DMY可促進(jìn)肉仔雞腸上皮細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(alkaline phosphotase,ALP)活性并通過激活Wnt /β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力。該研究旨在通過將DMY作用于SHED，探索其對(duì)SHED 的活性及骨向分化能力，探究其用于輔助治療牙周病等骨缺損性疾病的可能性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器DMY純度>96%(暨南大學(xué)王一飛教授饋贈(zèng))；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁公司)；SABC染色試劑盒、鼠抗人CD45、CD105和CD146單克隆抗體(北京索萊寶科技有限公司); ALP試劑盒(南京建成公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、q-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Biolegend公司)；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1乳牙牙髓細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將于2016年7月～9月在廣東省口腔醫(yī)院外科門診拔除的6～8歲健康兒童的無牙體牙髓牙周疾病的滯留乳牙(患兒家屬均知情同意)在超凈臺(tái)內(nèi)拔出牙髓組織，剪碎成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，接種于培養(yǎng)瓶里，翻轉(zhuǎn)，加入約4 ml培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，12 h后小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，每3～4 d換次液。待細(xì)胞匯合約80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2SHED的純化培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)期的第1代細(xì)胞，倍比稀釋調(diào)整細(xì)胞密度為10～15個(gè)/ml，接種于96孔板中，24 h后標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞孔，待克隆長(zhǎng)至孔底約80%后，將多個(gè)單細(xì)胞孔混合，擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3SHED的鑒定

1.3.1SHED免疫組織化學(xué)鑒定 取生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/ml，接種于24孔板，制備細(xì)胞爬片，細(xì)胞融合至約80%時(shí)，用4%的多聚甲醛固定15 min，按照SABC試劑盒進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白的免疫熒光染色(以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照)。

1.3.2SHED流式細(xì)胞術(shù)鑒定 取生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，取100 μl置于EP管中，實(shí)驗(yàn)組中加入2 μl含F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的1 ∶200稀釋的鼠抗人CD45、CD105和CD146抗體，對(duì)照組為無抗體組；4 ℃下孵育30 min，離心，用500 μl的PBS重懸細(xì)胞，避光，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4CCK-8檢測(cè)不同濃度的DMY對(duì)SHED活性的影響將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第4代SHED調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/ml，接種在3塊96孔板中，每孔200 μl培養(yǎng)液，周邊一圈填充無菌PBS。均置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)24 h，隨機(jī)分組，每組6孔，吸去上清液，分別加入200 μl含0、0.02、0.1、0.5、2、10、50 μmol/L濃度的DMY細(xì)胞培養(yǎng)液,并設(shè)置空白組。第24、48、72 小時(shí)分別隨機(jī)取一塊96孔板，用CCK-8試劑盒于450 nm酶標(biāo)儀處測(cè)定每孔的吸光度值。

1.5不同濃度的DMY對(duì)SHEDALP活性的影響取生長(zhǎng)狀況良好的第5代SHED，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個(gè)/ml，接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，隨機(jī)分為7組，6個(gè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，分別加入含不抑制SHED活性的及0 μmol/L的DMY的成骨誘導(dǎo)液200 μl，周圍一圈加入無菌PBS，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h后，按ALP試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀設(shè)置在520 nm處測(cè)吸光度值。

1.6不同濃度的DMY對(duì)SHEDRunt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-relatedtranscriptionfactor2,Runx2)及骨鈣素(osteocalcin,OCN)mRNA表達(dá)的影響分別收集經(jīng)不抑制SHED活性的及0 μmol/L濃度的DMY成骨誘導(dǎo)后第7天的細(xì)胞的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)成 cDNA，Real-time PCR檢測(cè)Runx2和OCN mRNA 的表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參?；蛐蛄幸姳?。

2 結(jié)果

2.1SHED形態(tài)觀察5～10 d組織塊周圍見細(xì)胞爬出(圖1A)，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞大多為長(zhǎng)梭形，呈成纖維細(xì)胞狀。純化培養(yǎng)時(shí)在第6天左右見標(biāo)記的單個(gè)細(xì)胞孔克隆形成(圖1C)，細(xì)胞體積較小，排列緊密，形態(tài)均一 。

表1 基因序列

圖1 倒置顯微鏡下SHED 原代及傳代培養(yǎng) ×40

2.2SHED免疫組織化學(xué)鑒定圖2A中見胞質(zhì)染成紅色，抗波形絲蛋白免疫熒光染色陽性；圖2B中胞質(zhì)無著色，角蛋白染色陰性。

圖2 SHED的免疫細(xì)胞化學(xué)染色 ×200

2.3SHED流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果顯示：細(xì)胞CD45表達(dá)陰性，比率為1.78%，CD146和CD105表達(dá)陽性，比率分別為88.55%及86.20%。見圖3。

2.4DMY對(duì)SHED活性的影響由表2所示，各濃度DMY作用下的SHED，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各個(gè)組的吸光度值都升高；在24、48及72 h時(shí)，各濃度DMY組與對(duì)照組相比，增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 不同濃度的DMY在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)SHED活性的影響

2.5DMY對(duì)SHEDALP活性的影響0、0.02、0.1、0.5、2、10、50 μmol/L DMY組ALP活性分別為(0.172±0.003)、(0.174±0.005)、(0.172±0.003)、(0.176±0.002)、(0.182±0.004)、(0.200±0.003)及(0.220±0.006)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.120，P=0.000)。10、50 μmol/L DMY組ALP活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，并呈濃度依賴性；0.02、0.1、0.5及2 μmol/L DMY組ALP活性與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

2.6DMY對(duì)SHEDRunx2及OCNmRNA表達(dá)的影響0、0.02、0.1、0.5、2、10及50 μmol/L DMY組Runx2 mRNA的表達(dá)結(jié)果分別為(1.00±0.02)、(1.15±0.09)、(1.39±0.02)、(1.90±0.28)、(1.97±0.04)、(2.33±0.04)、(3.31±0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=139.00，P=0.00)，其中0.1、0.5、2、10及50 μmol/L Runx2 mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，并呈濃度依賴性，0.02 μmol/L組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；OCN mRNA表達(dá)結(jié)果分別為(1.00±0.06)、(1.14±0.07)、(1.29±0.02)、(1.57±0.18)、(2.57±0.08)、(2.65±0.04)、(2.77±0.20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=140.30，P=0.00)，其中， 0.5、2、10及50 μmol/L DMY組OCN mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，0.02、0.1、0.5、2、10及50 μmol/L組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

圖4 DMY對(duì)SHED ALP活性的影響

與對(duì)照組比較：*P<0.05；與0.02 μmol/L的DMY組比較：#P<0.05；與0.1 μmol/L的DMY比較：▽P<0.05；與0.5 μmol/L的DMY比較：△P<0.05；與2 μmol/L的DMY比較：▼P<0.05；與10 μmol/L的DMY比較：▲P<0.05

3 討論

DMY化學(xué)結(jié)構(gòu)為3,5,7,3’,4’,5-六羥基-2,3雙氫黃銅醇，屬黃酮類化合物，有抗氧化、抗炎、抗病原微生物、提高動(dòng)物腸上皮ALP活性、促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力、降血糖、抗腫瘤、抗心血管疾病、解酒護(hù)肝等多方面的藥理作用[6-10]，且在自然界中分布廣泛，存在于藤茶、葡萄科、豆科、楊梅科、金絲桃科及柳科等植物中，此外DMY在顯齒蛇葡萄中的含量高達(dá)30%以上[7]，其在治療骨缺損及骨質(zhì)疏松方面有較好的開發(fā)應(yīng)用前景。

圖5 q-PCR檢測(cè)DMY作用于SHED 7 d時(shí)Runx2及OCN mRNA的表達(dá)情況

A:Runx2;B:OCN;與對(duì)照組比較：*P<0.05；與0.02 μmol/L的DMY比較：#P<0.05；與0.1 μmol/L的DMY比較：▽P<0.05；與0.5 μmol/L的DMY比較：△P<0.05；與2 μmol/L的DMY比較：▼P<0.05；與10 μmol/L的DMY比較：▲P<0.05

SHED是Miura et al[1]在2003年首次從人脫落的乳牙牙髓中發(fā)現(xiàn)的具有較強(qiáng)的增值能力以及向成骨細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多向分化潛能的干細(xì)胞。Zheng et al[11]將獲得的小型豬的乳牙牙髓干細(xì)胞與β-磷酸三鈣支架材料復(fù)合，移植至下頜骨缺損的部位，6個(gè)月后通過CT及免疫組織化學(xué)分析顯示小型豬的乳牙牙髓干細(xì)胞復(fù)合β-磷酸三鈣組的骨缺損部位大部分形成了新生骨(礦化基質(zhì)達(dá)到83.1%)明顯較單純的β-磷酸三鈣組(52.2%)高。Fu et al[12]將SHED結(jié)合者羥基磷灰石-磷酸三鈣后植入牙周炎模型的患牙處，2～3個(gè)月后，通過臨床檢查、組織學(xué)檢查及CT掃描均可見牙槽骨、牙周膜及牙骨質(zhì)的再生，且比單獨(dú)植入羥基磷灰石-磷酸三鈣組牙周軟硬組織的再生率均高許多。SHED在骨組織的再生中表現(xiàn)出了極大的應(yīng)用潛能。

本實(shí)驗(yàn)中，通過組織塊法及有限稀釋法獲得了SHED，免疫熒光組織化學(xué)鑒定獲得的細(xì)胞抗波形絲蛋白陽性，抗角蛋白陰性，并且流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示CD45 表達(dá)陰性，CD146和CD105表達(dá)陽性，證明獲取的細(xì)胞為間充質(zhì)來源的干細(xì)胞而非上皮細(xì)胞或者造血細(xì)胞來源。

在進(jìn)行DMY對(duì)SHED的成骨分化能力的研究前，首先通過CCK-8法檢測(cè)了DMY對(duì)SHED細(xì)胞活性的影響，結(jié)果表明0.02、0.1、0.5、2、10及50 μmol/L濃度的DMY與對(duì)照組相比對(duì)SHED的增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明一定濃度的DMY對(duì)SHED無明顯的細(xì)胞毒性，這與與周防震 等[13]及Zhang et al[7]的研究結(jié)果相似。

ALP是成骨分化過程中早期階段的標(biāo)志物，是一種非特異性的磷酸單酯酶，可水解磷酸鹽，在骨的礦化過程中為磷灰石晶體的沉積提供必需的磷酸，ALP活性的高低可以反映不同組織和細(xì)胞的礦化能力，及其骨向分化的趨勢(shì)[14]。本研究結(jié)果顯示10、50 μmol/L的DMY與對(duì)照組相比均可促進(jìn)ALP的活性，并呈濃度依賴性。Runx-2和OCN均是檢測(cè)細(xì)胞礦化過程的重要指標(biāo)，Runx-2表達(dá)于成骨分化的起始階段，是骨形成最早的及最具特異性的標(biāo)志；OCN由成熟的成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞合成，在維持骨的正常礦化速率中起著重要作用，是成骨分化過程中晚期階段的標(biāo)志物[15]。q-PCR檢測(cè)不同濃度DMY對(duì)SHED內(nèi)Runx-2和OCN mRNA表達(dá)的變化，直接反映了DMY對(duì)SHED早期及晚期的成骨能力。結(jié)果顯示，在成骨誘導(dǎo)第7天時(shí)，0.5、2、10及50 μmol/L DMY組與對(duì)照組相比，Runx2 mRNA表達(dá)均呈上調(diào)趨勢(shì)； 2、10及50 μmol/L DMY組與對(duì)照組相比，OCN mRNA表達(dá)均呈上調(diào)趨勢(shì)，且均具有一定的濃度特異性。但DMY在對(duì)SHED成骨誘導(dǎo)過程中的具體作用機(jī)制尚不清晰，而且細(xì)胞體外培養(yǎng)和體內(nèi)生長(zhǎng)的微環(huán)境也不同，此外，DMY能否促使牙周組織再生，缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)，這些仍需更進(jìn)一步的研究。