MDCK細胞外基質對HK-2細胞的增殖和遷移的影響

袁育珺，楊秀玲，胡志堅，汪 淵

腎小管上皮細胞生長、移行在急性腎損傷修復，延緩糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)進展等過程中起重要作用，尋找促進腎小管上皮細胞增殖和遷移的因素或藥物十分重要。整合素(integrin)是一類由α亞基和β亞基組成的異源二聚體跨膜蛋白，屬細胞黏附分子家族，研究[1]表明,其能介導細胞與細胞及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)之間的黏附，是細胞遷移、增殖等生理活動重要的調控因素。整合素α3和α6能與細胞外間質中的層黏連蛋白(Laminin，LN)結合[2-3]，影響細胞的黏附和運動[4]。該研究采用體外培養(yǎng)HK-2細胞，運用相關分子生物學技術(如酸性磷酸酶活性、細胞劃痕實驗、免疫熒光、Western blot等)分析生長于細胞外基質上的HK-2細胞的增殖和遷移狀況以及整合素α3和α6蛋白表達的變化，并進一步探討這些作用可能的分子調控機制，以開拓其在臨床的應用前景。

1 材料與方法

1.1材料犬腎小管上皮細胞株MDCK和腎近曲小管上皮細胞株HK-2均購自中國科學技術大學生命科學院細胞庫，于實驗室液氮保存；DMEM和原裝小牛血清均購自美國Gibco公司；酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)活性檢測試劑盒購自安徽碧云天生物試劑公司；一抗actin、整合素α3和α6均購自美國Santa Cruz公司；二抗購自美國Pierce公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和細胞外基質的制備 液氮取出HK-2和MDCK細胞，迅速37 ℃循環(huán)水浴解凍，及時接種于含10%小牛血清DMEM，細胞培養(yǎng)箱(條件：37 ℃、5% CO2、飽和濕度)培養(yǎng)過夜。胰酶消化傳代，備用。細胞外基質制備方法如下[5-6]：取MDCK細胞(細胞覆蓋率90%)，棄上清液，PBS清洗2遍，加入氨水(濃度為20 mmol/L)處理10 min，棄氨水，PBS清洗基質3遍，在含或不含MDCK細胞外基質上接種HK-2細胞，備用。分組為：正常對照組和細胞外基質組。

1.2.2ACP活性檢測細胞增殖 按1.2.1事先在96孔板內(nèi)制備細胞外基質，取對數(shù)期生長的HK-2細胞，胰酶消化，制成(1×102)～(1×105)/ml細胞懸液，平均接種于含或不含基質的96孔板，分別設6復孔。連續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出96孔板，棄上清液，PBS清洗2遍，按照ACP活性檢測試劑盒說明書操作，第一步：加入底物，37 ℃孵育2 h；第二步：加終止液，室溫靜置20 min；第三步：酶標儀檢測A405吸光度，實驗重復3次。

1.2.3細胞劃痕檢測細胞遷移 按1.2.1預先在6孔板內(nèi)制備細胞外基質，取一瓶HK-2細胞(對數(shù)期生長)，棄上清液，PBS清洗2遍，胰酶消化，制成合適細胞懸液(5 000個/ml)，平均接種于含或不含基質的6孔板。待各孔細胞覆蓋率90%，棄去上清液，PBS清洗2遍，用劃痕筆輕輕的在各孔正中央劃“十”字，PBS清洗3遍(盡量洗去殘留細胞)，加DMEM做好標記并拍照。拍照分為0、24和48 h，實驗重復3次。

1.2.4免疫熒光 6孔板內(nèi)鋪上蓋玻片，事先在一半玻片上鋪細胞外基質，再平均接種HK-2細胞。待細胞覆蓋率80%左右時，棄上清液，PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3遍，5%脫脂奶粉封閉2 h，用鑷子小心取出玻片，置于載玻片上，PBS清洗3遍(每遍靜置10 min，盡量洗去殘留物)，加入鼠抗人α3多克隆抗體(1 ∶40稀釋于脫脂牛奶)，4 ℃孵育過夜；次日PBS清洗3遍，加入FITC標記的羊抗鼠IgG(1 ∶100稀釋于PBS)，孵育2 h，PBS清洗3遍，加蓋玻片封片，經(jīng)復聚焦顯微鏡(confocalmicroscopy)雙光觀察，拍照備用，實驗重復3遍。

1.2.5Western blot 細胞總蛋白的提取：按1.2.1分組，細胞培養(yǎng)瓶批量培養(yǎng)，48 h后，棄上清液， PBS清洗2遍(盡量去除殘留培養(yǎng)基，并控干)，按照本實驗室蛋白提取指南[7]，方法：① 蛋白提取，培養(yǎng)瓶置冰上，每瓶加裂解液150 μl充分裂解，細胞刮子收集細胞，低溫冷凍離心，上清置于-80 ℃?zhèn)溆?；?BCA測定蛋白濃度，每組加入濃縮蛋白上樣緩沖液，水浴煮沸，分裝備用，置于-20 ℃保存；③ SDS-PAGE，配制12.5% SDS-PAGE，微量加樣針上樣，先用40～50 V電泳濃縮膠，100 V 電泳分離膠，100 mA冰浴轉膜，伊利脫脂牛奶封閉，PBS洗膜；④ 一抗結合，配置一抗?jié)舛葹橐种扑卅?(1 ∶400)、α6(1 ∶800)、actin(1 ∶1 000)，將膜置于一抗4 ℃過夜；⑤ 二抗結合，配置相應二抗?jié)舛确謩e為1 ∶1 000、1 ∶1 500、1 ∶3 000，37 ℃孵育2 h，PBS洗膜3次；⑥ 暗室內(nèi)膠片顯影、定影，重復實驗3次。結果進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1細胞外基質對HK-2細胞體外增殖的影響ACP結果顯示：從表1可以看出隨著接種濃度的增加，無論含或不含基質的HK-2細胞ACP活性也隨之增加；且細胞外基質組ACP活性明顯高于正常對照組，結果表明細胞外基質能促進HK-2細胞體外增殖(圖1)。

表1 細胞外基質對HK-2細胞體外增殖的影響

圖1 細胞外基質對HK-2細胞體外增殖的影響

A：細胞濃度為1×102；B：細胞濃度為1×103；C：細胞濃度為1×104；D：細胞濃度為1×105；E：細胞濃度為1×106

2.2細胞外基質對HK-2細胞遷移的影響細胞劃痕結果顯示：基質能明顯增強HK-2細胞損傷愈合速度，由圖2可以看出，無論是24 h或者48 h，基質組遷移距離都明顯高于正常對照組，結果表明細胞外基質能促進HK-2細胞遷移。見表2。

表2 細胞外基質對HK-2細胞遷移的影響

圖2 細胞外基質對HK-2細胞遷移的影響 ×100與正常對照組比較：*P<0.05

2.3細胞外基質對整合素α3在細胞內(nèi)表達的影響免疫熒光結果顯示：正常對照組(圖3A)細胞周圍有弱的、零散的熒光，表明整合素α3在正常HK-2細胞內(nèi)有表達；但是由圖3B可以看出，基質組細胞周圍整合素α3呈片狀表達，而且熒光比較強。

圖3 細胞外基質對整合素α3在細胞內(nèi)表達的影響 ×400

2.4細胞外基質對整合素α3和α6蛋白表達的影響結果采用單因素方差分析進行主體間效應檢測(Fα3=39.54，F(xiàn)α6=57.31，P<0.01)。組間兩兩比較顯示：與正常對照組比較,整合素α3和α6蛋白表達明顯增加，見圖4。

3 討論

DN是常見的糖尿病并發(fā)癥，近些年的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為引起糖尿病患者死亡的主要原因。相關研究[8-9]指出在糖尿病腎病發(fā)生早期，腎小管上皮細胞的凋亡和氧化損傷是糖尿病并發(fā)癥的原始啟動因子和細胞損傷的首要因素，也是腎小管間質纖維化發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)；同樣，在缺血性急性腎損傷病理特征中，腎小管上皮細胞凋亡增加，是缺血性急性腎損傷的重要發(fā)病機制之一[10]。因此，尋找促進腎小管上皮細胞增殖和遷移的因素或藥物來干預腎小管上皮細胞凋亡，維持上皮細胞活性，能有效地促進急性腎損傷修復，并有望延緩糖尿病腎病進展。

圖4 細胞外基質對整合素α3和α6蛋白表達的影響與正常對照組比較：*P<0.05

MDCK細胞外基質是犬腎小管上皮細胞基底膜成分，富含LN[11]。整合素是一類由α亞基和β亞基組成的異源二聚體跨膜蛋白，屬細胞黏附分子家族，能介導細胞與細胞及細胞外基質之間的黏附，是細胞遷移、增殖等生理活動重要的調控因素[1]。每種亞單位包含胞外域、單跨膜和胞內(nèi)域。由外向內(nèi)的信號轉導 (outside-insignaling)和由內(nèi)向外的信號轉導(inside-outsignaling)兩種途徑，由外向內(nèi)介導骨架重構，由內(nèi)向外調節(jié)與配體的親和力[12]。因為能夠在細胞與細胞之間、細胞與胞外環(huán)境之間傳遞信息；從而對細胞的生存、增殖、黏附和遷移起到嚴格的控制[13]。實驗結果表明：與正常對照組比較，MDCK細胞外基質能明顯增加HK-2細胞的增殖和遷移，且整合素α3和α6的表達也呈上升趨勢。其機制可能為：整合素α3和α6屬層黏連蛋白受體，可以作為橋梁與細胞外間質中的LN結合，調控多種細胞內(nèi)信號通路，包括肌動蛋白(actin)成核、聚合的激活以及促活、促有絲分裂原信號等[14-15]，進而促使培養(yǎng)的細胞進行有絲分裂，影響HK-2細胞的黏附和運動。

但是細胞調控既復雜而嚴密，且細胞外基質也是一個動態(tài)且復雜的微環(huán)境，在不同的組織當中呈現(xiàn)出不同的生物物理、機械性、生物化學方面的特征，所以MDCK細胞外基質調控HK-2細胞增殖和遷移的機制并非如此的簡單，如高表達的整合素α3和α6是通過哪些機制或信號通路來調控HK-2細胞的增殖和遷移尚不清楚，有待進一步的研究和探討。