18F-氟赤硝基咪唑micro PET/CT評(píng)價(jià)裸鼠乳腺癌早期放療療效實(shí)驗(yàn)研究

蘇曉雨, 徐慧琴, 汪 會(huì), 余文靜, 張 丹, 譙 鳳

目前，放射治療已經(jīng)成為治療中晚惡性腫瘤的主要有效手段之一，但是仍有部分惡性腫瘤對(duì)放射治療的效果不佳，這與惡性腫瘤組織內(nèi)大量乏氧細(xì)胞的存在密切相關(guān)。腫瘤組織乏氧現(xiàn)象在實(shí)體惡性腫瘤中是普遍存在的[1]。有研究[2-3]表明在惡性腫瘤組織壞死區(qū)域和其周邊間存在大量的乏氧細(xì)胞，乏氧細(xì)胞的存在能明顯影響惡性腫瘤細(xì)胞的放射治療效果，而利用放射性核素標(biāo)記的乏氧顯像劑進(jìn)行乏氧組織的小動(dòng)物正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像(micro position emission tomography，micro PET/CT)能無創(chuàng)、較為真實(shí)地反映腫瘤組織內(nèi)部的乏氧情況。18F-氟赤硝基咪唑(18F-FETNIM)在外周組織代謝水平相對(duì)較低，脫氟率也較其他乏氧顯像劑低，且容易被腫瘤內(nèi)部的乏氧組織攝取，能夠真實(shí)反映腫瘤內(nèi)部的乏氧狀態(tài)，可以作為惡性腫瘤的乏氧顯像劑[4]。該研究擬通過18F-FETNIM micro PET/CT顯像聯(lián)合免疫組化乏氧指標(biāo)乏氧誘導(dǎo)因子( hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)，探討18F-FETNIM micro PET/CT評(píng)估裸鼠MDA-MB231乳腺癌早期放療療效的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器人乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS(胎牛血清)、0.25%胰酶、PBS(磷酸鹽緩沖液)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；HIF-1α免疫組化試劑購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司；BALB/C 裸鼠，雌性，6～8周齡，20～22 g，16只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；VARIAN 23EX型直線加速器購(gòu)自美國(guó)瓦里安公司；Inveon micro PET/CT購(gòu)自德國(guó)Siemens公司；FETNIM前體購(gòu)自常熟華益有限公司；18F-FETNIM由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院PET中心合成，放化純度>95%。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及乳腺癌模型的建立人乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，在含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC型，日本SANYO公司)中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼滿培養(yǎng)皿底約80%時(shí)用含EDTA的胰酶消化制成單細(xì)胞懸液(2×107個(gè)/ml)，取0.2 ml皮下接種于裸鼠右上肢腋下。接種1周后即開始試驗(yàn)，瘤體直徑≥1cm。

1.3實(shí)驗(yàn)分組采用隨機(jī)對(duì)照原則將16只荷瘤裸鼠分為A、B兩組，每組8只；A組為對(duì)照組，未進(jìn)行任何處理；B組為放療組，將裸鼠麻醉固定，用美國(guó)VARIAN 23EX醫(yī)用直線加速器對(duì)裸鼠腫瘤進(jìn)行照射，使用6 MeV電子線，照射野10 cm×10 cm，行單次照射，劑量為10 Gy，然后分別于放療后24 h及48 h行micro PET/CT顯像。

1.418F-FETNIMmicroPET/CT顯像裸鼠于顯像前禁食8 h，不禁水。顯像前將裸鼠麻醉固定，于尾靜脈注射約150 μCi劑量的18F-FETNIM，1 h后用異氟烷麻醉并俯臥位固定于掃描床上，行micro PET/CT顯像，CT掃描參數(shù)10 min，PET掃描5 min。然后由2位高年資的核醫(yī)學(xué)科醫(yī)師采用視覺和半定量結(jié)合的方法對(duì)micro PET/CT圖像進(jìn)行分析。目測(cè)圖像中腫瘤病灶18F-FETNIM的攝取程度，并于放射性濃聚最高的層面，測(cè)量最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(SUVmax)。

1.5組織病理學(xué)檢查顯像完成后，采取頸椎脫臼法處死裸鼠。盡快取出腫瘤組織，用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片并行HE染色以及HIF-1α免疫組化檢查。HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核及胞質(zhì)中。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(10×40)拍照分析，計(jì)數(shù)每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

2 結(jié)果

2.1裸鼠18F-FETNIMmicroPET/CT顯像情況micro PET/CT顯像圖像后，在16只裸鼠右上肢腋下均可見放射性攝取濃聚病灶，少數(shù)腫瘤內(nèi)可見放射性攝取分布稀疏或缺損區(qū)，腫瘤周邊與周圍正常組織分界清晰，部分裸鼠肌肉及腸道可見生理性放射性攝取，余全身未見明顯腫瘤轉(zhuǎn)移病灶，具體見圖1。放療前，對(duì)照組與放療組SUVmax值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.375，P>0.05)。放療組放療后48 h裸鼠腫瘤組織SUVmax值較放療前(t=9.958，P<0.05)、放療后24 h(t=16.506，P<0.05)明顯降低(F=58.860，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。放療后24 h SUVmax值也低于放療前(t=5.405，P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2組織病理學(xué)結(jié)果

2.2.1HE染色結(jié)果 顯像完成后，頸椎脫臼法處死所有裸鼠后取出完整的腫瘤組織，肉眼觀察見腫瘤與周圍正常組織分界清晰，有明顯包膜。選擇腫瘤最大截面切開，部分腫瘤中心見灰白色壞死組織。HE染色鏡下觀察對(duì)照組MDA-MB231細(xì)胞排列密集紊亂，細(xì)胞核呈明顯異型，細(xì)胞核大、深染，核質(zhì)比例增大，壞死較少；放療組MDA-MB231細(xì)胞仍可見明顯異型，分裂象比例明顯減少，周邊可見大片狀腫瘤壞死區(qū)，見圖2。

表1 放療組裸鼠MDA-MB231乳腺癌腫瘤

與放療前比較：*P<0.05；與放療后24 h比較：#P<0.05

圖1 放療組裸鼠MDA-MB231乳腺癌18F-FETNIM micro PET/CT顯像結(jié)果A:放療前；B:放療后24 h；C:放療后48 h

圖2 對(duì)照組及放療組裸鼠MDA-MB231乳腺癌HE染色 ×400A：對(duì)照組；B：放療組

2.2.2HIF-1α免疫組化檢查結(jié)果 鏡下觀察，HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞核及胞質(zhì)中，陽(yáng)性結(jié)果為點(diǎn)狀或成簇狀分布，陽(yáng)性細(xì)胞率為26%～89%。放療組在放療前、放療后HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性率分別為(76.198±9.046)%、(41.905±10.262)%。放療組放療后HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于放療前(t=14.802，P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

2.3SUVmax與HIF-1α表達(dá)相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析結(jié)果示，SUVmax與HIF-1α表達(dá)呈明顯正相關(guān)性(r=0.865，P<0.05)，見圖4。

圖3 放療組裸鼠MDA-MB231乳腺癌HIF-1a免疫組化 ×400A: 放療前；B：放療后

圖4 腫瘤SUVmax值與HIF-1α表達(dá)相關(guān)性分析

3 討論

惡性腫瘤的早期放療療效評(píng)價(jià)與其預(yù)后密切相關(guān)，傳統(tǒng)影像學(xué)檢查方法(如CT、MRI及B超等)可以在解剖結(jié)構(gòu)的變化方面對(duì)腫瘤的放射治療效果做出判斷評(píng)價(jià)，但是難以同時(shí)針對(duì)惡性腫瘤組織解剖及功能代謝改變做出具體有效的評(píng)價(jià)[5]。PET/CT是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的分子影像學(xué)檢查方法，將功能成像PET和解剖成像CT同機(jī)融合，能同時(shí)擁有較高的靈敏度和分辨率，同時(shí)PET/CT也可應(yīng)用多種顯像劑，可特異性地反映腫瘤組織的代謝、增殖、乏氧及凋亡等情況，進(jìn)而對(duì)惡性腫瘤的放療效果進(jìn)行有效的評(píng)價(jià)[6]。micro PET/CT能夠無創(chuàng)、活體、動(dòng)態(tài)、定量地從分子生物水平觀察放射性藥物在小動(dòng)物體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄等過程。18F-硝基咪唑丙醇(18F-FMISO)是一種乏氧顯像劑，可與腫瘤內(nèi)的乏氧細(xì)胞特異性結(jié)合，選擇性滯留在乏氧細(xì)胞內(nèi)，但因?yàn)槠渚哂幸欢ǖ纳窠?jīng)毒性，且水溶性較差，評(píng)價(jià)腫瘤組織乏氧狀態(tài)具有一定的缺陷，所以很難廣泛應(yīng)用于臨床[7-8]。有研究者對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了稍加改進(jìn)，1995年，Yang et al[9]合成了18F-FETNIM，發(fā)現(xiàn)其比18F-FMISO親水性更強(qiáng)，并且周圍正常組織的攝取較腫瘤組織低。而Lehti? et al[10]的相關(guān)研究中，對(duì)10例頭頸部腫瘤患者行18F-FETNIM動(dòng)態(tài)顯像，同時(shí)測(cè)定腫瘤部位的血流供應(yīng)，將兩個(gè)結(jié)果結(jié)合后發(fā)現(xiàn)18F-FETNIM可以較好地真實(shí)反映腫瘤組織內(nèi)部的乏氧情況。

本研究中，裸鼠行18F-FETNIM micro PET/CT顯像后，每只裸鼠于右側(cè)腋下皮下均可見腫瘤病灶。放療組放療后48 h裸鼠腫瘤組織SUVmax值較放療前及放療后24 h均明顯降低，且放療后24 h也較放療前明顯降低，說明18F-FETNIM micro PET/CT可以通過腫瘤組織SUVmax來反映腫瘤組織內(nèi)部的乏氧狀態(tài)，并且可進(jìn)一步反映放療產(chǎn)生的療效。

HIF-1α是HIF-1的活性亞單位,是低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,其在低氧的惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),可以同轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物反應(yīng)參與多種基因的轉(zhuǎn)錄，協(xié)助腫瘤細(xì)胞適應(yīng)周圍環(huán)境[11-13]。同時(shí)有研究[14]證實(shí)HIF-1α具有促進(jìn)乏氧狀態(tài)下惡性腫瘤細(xì)胞新生血管的生成,改變乏氧狀態(tài)下的代謝方式和狀態(tài),増強(qiáng)腫瘤侵襲性,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等作用,并且參與乏氧狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞增殖和調(diào)亡的調(diào)控。徐慧琴 等[15]關(guān)于18F-FDG PET/CT評(píng)估齊墩果酸放射增敏作用實(shí)驗(yàn)研究中SUVmax與HIF-1α的相關(guān)性分析結(jié)果提示SUVmax大小與HIF-1α表達(dá)呈明顯正相關(guān)性。本研究通過腫瘤乏氧指標(biāo)HIF-1α來反映裸鼠MDA-MB231乳腺癌腫瘤組織的乏氧狀態(tài)，并從病理學(xué)上驗(yàn)證18F-FETNIM micro PET/CT的顯像結(jié)果。

HE染色結(jié)果顯示放療組出現(xiàn)大片狀壞死，且壞死現(xiàn)象較對(duì)照組更明顯，說明放射治療可以促進(jìn)細(xì)胞溶解、壞死，加速腫瘤細(xì)胞凋亡。免疫組化結(jié)果顯示，放療組放療后HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于放療前，此結(jié)果與micro PET/CT顯像中各組腫瘤的SUVmax值相一致。結(jié)合相關(guān)性分析結(jié)果腫瘤組織SUVmax與HIF-1α呈明顯正相關(guān)性，從病理學(xué)方面進(jìn)一步驗(yàn)證了18F-FETNIM micro PET/CT顯像結(jié)果。

綜上所述，18F-FETNIM micro PET/CT顯像可以監(jiān)測(cè)惡性腫瘤內(nèi)部的的乏氧狀態(tài)，并且可以評(píng)價(jià)裸鼠MDA-MB231乳腺癌的早期放療療效。