BMP-2對ECV304細胞增殖遷移及血管生成的影響

馮鵬程, 左為漢, 蔣為民, 吳建兵

原發(fā)性肝癌，通常是指肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，是世界上由癌癥引起的死亡的第二大原因[1]。血管生成是肝癌的基本特征，對于肝癌的發(fā)生進展是至關(guān)重要的。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族中的一員，在細胞增殖、分化和凋亡中起著重要的作用，最近研究[2]顯示BMP-2與許多惡性腫瘤密切相關(guān)，然而，BMP-2對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，ECV304)增殖遷移和血管生成的影響尚不清楚。因此，在該研究中，構(gòu)建BMP-2慢病毒載體并轉(zhuǎn)染ECV304細胞，通過細胞功能實驗和裸鼠模型的構(gòu)建，從體內(nèi)外水平觀察BMP-2對ECV304細胞增殖、遷移及血管生成的影響。該研究可為肝癌臨床治療探尋新的治療靶點和思路提供理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器ECV304細胞、慢病毒載體和感染增強液(HitransG P，REVG003)均購自上海吉凱基因生物技術(shù)公司，裸鼠(15只雄性,SPF級BALB/c-nu小鼠；體質(zhì)量17.7～21.8 g；室溫飼養(yǎng))購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；Real-time PCR試劑盒(AQ141)、CCK-8試劑盒(FC101)購自北京TransGen Biotech公司；Transwell小室購自美國Millipore 公司；凝膠制備試劑盒(AR0138)、總蛋白提取試劑盒(P1250)、蛋白定量試劑盒(P1511)、超敏發(fā)光試劑盒(S6009)等購自南昌Cell Scientific公司；Anti-BMP-2抗體(ab14933)、GAPDH抗體(AF7021)、Goat Anti-Rabbit IgG((BA1045)購自美國Abcam公司；核酸蛋白分析儀購自德國BioPhotometer公司；梯度PCR儀(170-9703)購自美國Bio-Rad公司；熒光定量PCR分析儀(BJ001266)、多功能酶標儀(FC)購自美國ABI公司；半干膜轉(zhuǎn)儀(TE70XP)購自美國Hoefer公司。

1.2慢病毒轉(zhuǎn)染及引物設(shè)計將對數(shù)生長期的細胞消化重懸后，按1×105/L密度接種于24孔板，生長過夜，等24孔板鋪滿30%～40%時，吸除培養(yǎng)液，換新鮮的培養(yǎng)液，根據(jù)細胞數(shù)加入復感染指數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為20的病毒量，混合均勻后即可放入孵箱培養(yǎng)，24 h左右可換液，于37 ℃、5% CO2環(huán)境下貼壁培養(yǎng)、傳代，并篩選穩(wěn)定株，備后續(xù)實驗使用。BMP-2引物序列：F:5′-GGAACGGA CATTCGGTCCTT-3′，R:5′-CACCATGGTCGACCTTTA GGA-3′；β-actin F:5′-AAAGACCTGTACGCCAACA CA-3′, R:5′-CGATCCACACGGAGTACTTGC-3′。

1.3Real-timePCR實驗根據(jù)總RNA抽提試劑盒(ET111)說明書提取總RNA，然后用核酸蛋白分析儀對RNA濃度和純度測定，在梯度PCR儀逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：42 ℃、15 min，85 ℃ 、5 s，參考Real-time PCR試劑盒(AQ141)說明書加樣，反應(yīng)條件：94 ℃、30s，94 ℃、5s，60 ℃ 、30s，40個循環(huán),內(nèi)參為β-actin，于熒光定量PCR分析儀進行分析，根據(jù)循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)值計算相對表達量，實驗重復3次。

1.4Westernblot實驗按照總蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，檢測蛋白濃度后加入Loading Buffer緩沖液，經(jīng)100 ℃煮沸15 min，變性后上樣，進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，采用半干膜轉(zhuǎn)儀將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂奶粉封閉2 h，通過TBST漂洗(3 次×10 min)后，加入Anti-BMP-2抗體(稀釋濃度1 ∶500)、GAPDH抗體(稀釋濃度1 ∶500)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗(3 次×10 min)后，Goat Anti-Rabbit IgG(稀釋濃度1 ∶10 000)室溫孵育1 h，TBST洗過(3次×10 min)后,最后浸入超敏發(fā)光試劑(S6009)中約1 min，顯影成像，使用Image J 進行灰度值分析比較，實驗重復3次。

1.5細胞培養(yǎng)與實驗分組ECV304細胞在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM于37 ℃、5% CO2環(huán)境下貼壁培養(yǎng)、傳代，備后續(xù)實驗使用。實驗分為：① Normal組(BMP-2表達正常的ECV304細胞)；② LV-SH-BMP-2組(BMP-2表達下調(diào)的ECV304細胞)；③ Overexpression-LV-BMP-2組(BMP-2表達上調(diào)的ECV304細胞)。

1.6CCK-8實驗胰蛋白酶消化3組對數(shù)期細胞，離心并制成細胞懸液，通過細胞計數(shù)調(diào)整濃度至6×104/ml，取3種細胞懸液分別加入到96孔板中，100 μl/孔，每組分別設(shè)計6個復孔，培養(yǎng)24 h(37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng))，分別在第24、48、72小時的時候，每孔加入10 μl CCK-8溶液(不要產(chǎn)生氣泡)，在多功能酶標儀選擇450 nm波長測定各組細胞吸光度(optical density,OD)值，最后統(tǒng)計數(shù)據(jù)和繪制增殖曲線，實驗重復3次。

1.7劃痕實驗將3組處于對數(shù)期的細胞，接種于6孔板，當細胞生長至90%左右時，棄去培養(yǎng)液，用10 μl移液器的槍頭沿培養(yǎng)板底部做“一”字劃痕，劃痕要垂直、均衡、相同。用 PBS 洗滌脫落的細胞，重新加入無血清的培養(yǎng)基，放入37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于0 h和24 h倒置顯微鏡觀察并拍照，Image J計算劃痕愈合率，實驗重復3次。

1.8成管實驗Matrigel基質(zhì)膠4 ℃過夜溶解，次日在冰盒上進行鋪膠，先用血清DMEM培養(yǎng)基1 ∶1稀釋Matrigel基質(zhì)膠，混勻后，50 μl/孔加入96孔板，37 ℃孵箱放置1 h；將ECV304細胞(1×105/孔)接種在Matrigel層上，并在CO2培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)，12 h后觀察，并用相差顯微鏡捕獲圖片，通過使用Image Pro Plus軟件的計算機輔助圖像分析確定每孔的總管長度。

1.9裸鼠移植瘤0.25%胰蛋白酶消化，用PBS混合制成單細胞懸液，取對數(shù)生長期的ECV304細胞 1×107個，注入裸鼠右側(cè)翼皮下，負瘤小鼠4周后麻醉下處死，無菌條件下去除表面的纖維包膜、血管，剝離瘤體，測量瘤體的體積和質(zhì)量。

1.10微血管密度(microvesseldensity，MVD) 將組織切片用二甲苯脫蠟，然后將玻片浸入梯度濃度的酒精(100%、95%、85%、70%)中5 min，用蘇木精染色3 min和伊紅染色1 min。使用EnVision檢測試劑盒，用CD34標記血管內(nèi)皮細胞，選擇色素最強的區(qū)域作為“熱點”，在顯微鏡下成像并計數(shù)微血管。對于一個切片，計數(shù)3個“熱點”中的微血管并將它們的平均值用作切片MVD。

2 結(jié)果

2.1ECV304細胞中BMP-2mRNA的表達Real-time PCR結(jié)果：Normal組、Overexpression-LV-BMP-2組、LV-SH-BMP-2組ECV304細胞BMP-2 mRNA表達量分別為(0.98±0.02)、(2.28±0.87)、(0.35±0.03)，三組間差異有統(tǒng)計學意義(F=177.2，P<0.01)。與Normal組比較，Overexpression-LV-BMP-2組ECV304細胞BMP-2 mRNA的相對表達增高(P<0.01)，LV-SH-BMP-2的相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1A。

2.2ECV304細胞中BMP-2蛋白的表達Western blot結(jié)果顯示：Normal組、Overexpression-LV-BMP-2組、LV-SH-BMP-2組ECV304細胞BMP-2 蛋白表達量為(0.89±0.11)、(1.49±0.05)、(0.43±0.09)，3組間差異有統(tǒng)計學意義(F=89.83，P<0.01)。與Normal組比較，Overexpression-LV-BMP-2組ECV304細胞BMP-2 蛋白的相對表達量增高(P<0.01)，LV-SH-BMP-2組相對表達量降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖1B。

2.3ECV304細胞增殖能力CCK-8實驗結(jié)果：與Normal組(0.76±0.11)比較，Overexpression-LV-BMP-2組ECV304細胞在72 h的增殖能力(1.43±0.19)增高(P<0.05)，LV-SH-BMP-2組ECV304細胞在72 h的增殖能力(0.49±0.10)降低(P<0.05)，3組間差異有統(tǒng)計學意義(F=326.5，P<0.05)。見圖1C。

圖1 ECV304細胞中BMP-2 mRNA與蛋白的表達及ECV304細胞的增殖能力

A、B：ECV304細胞中BMP-2 mRNA與蛋白的表達 ；C：各組ECV304細胞的增殖能力；1：Normal組；2： LV-SH-BMP-2組；3：Overexpression-LV-BMP-2組；與Normal組比較：**P<0.01

圖2 ECV304細胞的遷移能力 ×100

2.4ECV304細胞遷移能力劃痕實驗結(jié)果：Normal組、Overexpression-LV-BMP-2組、LV-SH-BMP-2組ECV304細胞劃痕愈合率為(40±4)%、(74±4)%、(11±7)%，3組間差異有統(tǒng)計學意義(F=119.1，P<0.01)。與Normal組比較，Overexpression-LV-BMP-2組ECV304細胞遷移能力增高(P<0.01)，LV-SH-BMP-2組ECV304細胞遷移能力降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖2。

2.5血管生成Normal組、Overexpression-LV-BMP-2組和LV-SH-BMP-2組ECV304細胞血管數(shù)量分別為(9.32±0.97)、(19.37±0.9)、(1.66±1.73)，3組間差異有統(tǒng)計學意義(F=70.88，P<0.01)。與Normal組比較：LV-SH-BMP-2組及Overexpression-LV-BMP-2組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3A。

2.6微血管密度與Normal組MVD(31.28±1.95)相比，Overexpression-LV-BMP-2組小鼠腫瘤組織中的MVD(57.20±2.01)增加(P<0.01)，LV-SH-BMP-2組小鼠腫瘤組織中的MVD(15.53±3.82)降低(P<0.01)，3組間差異有統(tǒng)計學意義(F=361.5，P<0.01)。見圖3B。

圖3 三組ECV304細胞血管數(shù)量及MVD

1： Normal組；2 ：LV-SH-BMP-2組；3：Overexpression-LV-BMP-2組；與Normal組比較：**P<0.01

2.7血管生成相關(guān)蛋白的表達Western blot結(jié)果顯示：Overexpression-LV-BMP-2組ECV304細胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8 )、金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、MMP-9蛋白的表達水平明顯高于Normal組和LV-SH-BMP-2組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 血管生成相關(guān)蛋白的表達水平

1：Normal組；2：LV-SH-BMP-2組；3：Overexpression-LV-BMP-2組；與Normal組比較：*P<0.05

2.8體內(nèi)移植瘤的體積與質(zhì)量LV-SH-BMP-2組ECV304細胞的體內(nèi)移植瘤的體積與質(zhì)量顯著小于Normal組ECV304細胞(P<0.05)；然而，Overexpression-LV-BMP-2組ECV304細胞的體內(nèi)移植瘤的體積與質(zhì)量大于Normal組(P<0.05)，見圖5。

3 討論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)是一種多功能分泌細胞因子。最初發(fā)現(xiàn)這些BMPs能夠誘導骨和軟骨的形成和發(fā)育[3]，近年發(fā)現(xiàn)BMPs在多種癌細胞(前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和卵巢癌等)中異常表達[4-5]。如BMP-2在肺癌組織中的mRNA表達明顯高于相應(yīng)的正常組織，下調(diào)BMP-2表達可顯著抑制A549和H460細胞的增殖和遷移[2]。使用慢病毒或BMP-2抗體抑制BMP-2的活性可導致肺腫瘤生長速度下降[6]。用DMH1(BMP-2抑制劑)阻斷BMP信號傳導可抑制非小細胞肺癌的增殖、遷移和侵襲能力,促進細胞死亡。有研究[3]通過qRT-PCR檢測鼻咽癌和對應(yīng)癌旁組織中BMP-2的表達水平，結(jié)果顯示BMP-2mRNA在癌組織中高與癌旁組織。體外過表達BMP2可促進鼻咽癌細胞增殖和侵襲性，內(nèi)源性敲低BMP-2后，結(jié)果與之相反。BMP-2也可通過激活PI3K/AKT和MEK/ERK通路促進胃癌細胞的遷移與侵襲[6]。Kim et al[7]研究表明BMP-2通過促進腫瘤干細胞增殖，來增強結(jié)腸癌細胞的運動性和侵襲性，在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。BMP-2沉默可以通過MAPK/ERK通路下調(diào)MMP-2和MMP-9來抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲[8]。眾所周知，血管生成在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。VEGF是最強的促血管生成因子，VEGF沉默后可通過PI3K/AKT(phosphatidylinositol 3-kinase,Serine/threonine kinase)信號通路抑制HCC進展和促進細胞凋亡并減少骨肉瘤中的血管發(fā)生[9-10]。據(jù)文獻[11]報道，BMP-2通過刺激VEGF分泌來促進血管生成。BMP-2也可通過刺激分化抑制因子和促分裂素原活化蛋白激酶途徑參與腫瘤血管生成[12]。敲低BMPR-II后可抑制MAPK/p38和MAPK/ERK1/2途徑導致VEGF-C的表達降低[13]。兩種血管生成因子VEGF和BMP-2在肺惡性腫瘤的生物學評估中起重要作用,BMP-2可以增強進展性肺腫瘤的血管生成能力[14]。BMP-2可以增強VEGF和成纖維細胞生長因子-2對血管生成活性的作用。組織或者腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程都需要足夠多的必需物質(zhì)，這些物質(zhì)的持續(xù)輸入需要一個快速有效的運輸系統(tǒng)，最重要的就是血管的發(fā)生[15]。

圖5 體內(nèi)移植瘤的體積與重量

1：Normal組；2：Overexpression-LV-BMP-2組；3： LV-SH-BMP-2組；與Normal組比較：*P<0.05

因此，在本研究中，用慢病毒在ECV304細胞中下調(diào)和上調(diào)BMP-2的表達，Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示BMP-2 mRNA與蛋白表達增高或降低(轉(zhuǎn)染成功)，然后采用CCK-8、劃痕實驗、成管實驗和Western blot檢測ECV304細胞的增殖、遷移、成管數(shù)量和VEGF、IL-8、MMP-2和MMP-9蛋白的表達量，結(jié)果顯示，與Normal組比較，Overexpression-LV-BMP-2組ECV304細胞的增殖能力、遷移能力、生成小管的數(shù)量和VEGF、IL-8、MMP-2和MMP-9蛋白的表達量都增加,LV-SH-BMP-2組結(jié)果與之相反，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),同時體內(nèi)實驗結(jié)果顯示Overexpression-LV-BMP-2組ECV304細胞的移植瘤的體積、質(zhì)量和MVD較Normal組和LV-SH-BMP-2組多，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，體內(nèi)外實驗結(jié)果與上述觀點一致，所以BMP-2可促進ECV304細胞的增殖、遷移和血管生成。因此，BMP-2將來有可能用于HCC的新型抗血管生成的治療。